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Univ Odontol. 2010 Jul-Dic; 29(63): 107-112. ISSN 0120-4319
CIENCIAS BÁSICAS, BIOTECNOLOGÍA Y BIOINFORMÁTICA
Efecto de la
Calendula ofcinalis
en la
proliFeración del ±broblasto gingival humano
Efect oF
Calendula ofcinalis
on the ProliFeration oF Human
Gingival ±ibroblast
Trabajo de grado de los tres primeros autores
para optar al título de odontólogos, Pontifcia
Universidad Javeriana, Bogotá, Colombia.
CÓMO CITAR ESTE ARTÍCULO
Madrid MA, Mahecha LC, Oviedo VA, Chaves
M, Roa NS, García DA, Moreno GC. Efecto de
la
Calendula o²cinalis
en la proliferación del
fbroblasto gingival humano. Univ Odontol. 2010
Jul-Dic; 29(63): 107-112.
Recibido para publicación: 25-05-2010
Aceptado para publicación: 26-08-2010
Disponible en
universitasodontologica
María Alejandra Madrid Ahumada
Odontóloga, Pontificia Universidad
Javeriana, Bogotá, Colombia.
Luis Carlos Mahecha Donato
Odontólogo, Pontificia Universidad
Javeriana, Bogotá, Colombia.
Viviana Andrea Oviedo Peñaloza
Odontóloga, Pontificia Universidad
Javeriana, Bogotá, Colombia.
Margarita Chaves Clavijo
Bacterióloga. Magistra en Microbiología.
Docente, Pontificia Universidad
Javeriana, Bogotá, Colombia.
Nelly Stella Roa Molina
Odontóloga. Magistra en Microbiología,
Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá,
Colombia. Candidata al Doctorado en
Inmunología, Universidad Autónoma de
México, Ciudad de México, México.
Dabeiba Adriana García Robayo
Bacterióloga. Magistra en
Microbiología. Candidata al Doctorado
en Ciencias, Universidad Nacional de
Colombia, Bogotá, Colombia.
Gloria Cristina Moreno Abello
Odontóloga. Magistra en
Microbiología. Docente, Pontificia
Universidad Javeriana, Bogotá,
Colombia.
RESUMEN
Antecedentes:
la
Calendula o²cinalis
tiene múltiples propiedades terapéuticas, dentro de
las que se encuentra su capacidad para mejorar procesos de cicatrización. Por ello resulta
interesante estudiar su posible valor para tratar patologías orales.
Objetivo
: observar los
efectos que producen tres presentaciones de
C. o²cinalis
en diferentes concentraciones
en la proliFeración de los fbroblastos gingivales humanos.
Método:
a fbroblastos gingi
-
vales humanos (FGH) en quinto pase, obtenidos de explantes de donantes sanos, se les
realizaron estímulos con extracto etanólico de
C. o²cinalis
(EEC), tintura de
C. o²cinalis
(TC) y enjuague K-Trix® en concentraciones de 750, 500, 150, 100 μg/ml y se observó la
proliferación de los FGH a las 12, 24 y 48 horas en relación con un grupo de células sin
estimular, utilizando la prueba MTA con Cell Titer 96®.
Resultados:
el mayor efecto proli-
ferativo se logró con el EEC en concentraciones de 750 y 500 μg/ml a las 12 horas. La TC
a 100 y 150 μm/ml a las 48 horas inhibió el crecimiento, mientras que el enjuague K-Trix®
no tuvo efecto en la proliferación de los FGH en ninguna concentración en ningún tiempo.
Conclusión:
la proliferación de los FGH depende de la presentación de la
C. o²cinalis,
del
tiempo y de la concentración.
PALABRAS CLAVE
Calendula o²cinalis
, cicatrización, enjuague fbroblasto, extracto etanólico, proliFeración
celular, tintura.
PALABRAS CLAVES DESCRIPTOR
Fibroblastos, microbiología, proliferación celular, cicatrización de heridas, caléndula inmu-
nología, periodoncia
ÁREA TEMÁTICA
Periodoncia.
ABSTRACT
Background: Calendula o²cinalis
has multiple therapeutic properties such as improving
the process of cicatrization. Therefore, it is interesting its possible value and use to treat
oral pathologies.
Objective:
To observe the e±ect oF three presentations oF
C. o²cinalis
in di±erent concentrations on the proliFeration oF the human gingival fbroblasts.
Methods:
Human Gingival ²ibroblasts (²GH) in fFth pass were obtained From healthy donor explants
and exposed to stimuli with ethanolic extract of
C. o²cinalis
(EEC), tincture of
C. o²cinalis
(TC) and K-Trix® rinsing in concentrations of 750, 500, 150, 100 μg/ml. Proliferation of the
FGH was observed at 12, 24 and 48 hours in relation with a group of cells without getting
any stimulation, using the MTA test with Cell Titer 96®.
Results:
The major proliFerative e±ect
was achieved by the EEC in concentrations of 750 and 500 μg/ml at 12 hours. The tincture
of 100 and 150 μg/ml
C. o²cinalis
at 48 hours generated inhibition in cell growth whereas
the rinsing K-Trix® did not have e±ect on the proliFeration oF the ²GH in any concentration
at any time.
Conclusion:
The proliferation of the FGH depends on the presentation of the
C. o²cinalis
, time, and concentration.
KEY WORDS
Calendula o²cinalis
, cell proliFeration, dyeing, ethanol extract, fbroblast, rinse, wound healing.
KEY WORDS PLUS
Fibroblasts, Microbiology, Cell Proliferation, Wound Healing, Calendula, Inmunology,
Periodontics
T
HEMATIC ²IELD
Periodontics.
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Madrid MA, Mahecha LC, Oviedo VA, Chaves M, Roa NS, García DA, Moreno GC
Univ Odontol. 2010 Jul-Dic; 29(63): 107-112. ISSN 0120-4319
INTRODUCCIÓN
La búsqueda por mejorar estilos de vida incluye el uso
de alternativas naturales provenientes de las plantas,
utilizadas como antibióticos, antiinfamatorios y, más
recientemente, como cicatrizantes. La cicatrización
no es un fenómeno aislado y su evolución está con-
dicionada por factores bioquímicos locales, cambios
en las estructuras tisulares y ciertos procesos que
determinan la formación de la cicatriz.
1
Los Fbroblastos son células que participan activa
-
mente en los procesos de cicatrización cuando proli-
±eran y depositan Fbrina y tropocolágeno e inician la
reparación de la herida.
2
Los Fbroblastos se originan
localmente y a través de las células mesenquimáti-
cas pluripotenciales, que comienzan la producción de
tropocolágeno al tercer o cuarto días después de la
lesión.
2
El Fbroblasto presenta características parti
-
culares de acuerdo con el tejido en el que se encuen-
tre.
3
El de tipo gingival desempeña un papel importante
durante los procesos de cicatrización y regeneración
periodontal, por medio de una respuesta prolifera-
tiva activa, además de otros fenómenos celulares y
moleculares.
4
Esta respuesta proliferativa es inducida
por diferentes factores de crecimiento presentes en el
plasma y en los gránulos plaquetarios.
5
En medicina popular, la
Calendula ofcinalis
se usa
para mejorar la cicatrización. La palabra
caléndula
vie-
ne de las calendas del latín, que designaban el primer
día del mes. Es así porque la
C. ofcinalis
forece todos
los meses del año, incluso los de invierno, siempre y
cuando el invierno sea leve.
6
También es conocida
como maravilla y se ha usado extensamente en la
piel para tratar heridas pequeñas, infecciones de la
piel, quemaduras, picaduras de abeja, quemaduras de
sol, verrugas y cáncer. La mayor parte de la evidencia
cientíFca, en cuanto a su e±ectividad como agente
para curar heridas, se basa en estudios con animales,
mientras que las investigaciones en seres humanos
son pocas.
6-9
Las fores de
C. ofcinalis
constituyen la parte de la
planta más utilizada. Los compuestos activos prima-
rios de la planta incluyen triterpenos (antiinfamato
-
rios) y favonoides, aceites esenciales, saponinas,
mucílagos y sustancias amargas como la calendina.
Estos componentes son algunos de los principios
activos que le conFeren a la
C. ofcinalis
sus pro-
piedades antiinfamatoria, antiséptica, cicatrizante,
desintoxicante y fungicida.
10
Recientes estudios de
investigación en laboratorio indican que los péta-
los de la
C. ofcinalis
tienen propiedades antibacte-
rianas y antivirales, antiinfamatorias, astringentes y
antisépticas, y pueden incluso ofrecer acciones in-
munoestimulantes y propiedades antiespasmódica y
antiulcerosa.
11-13
También se han demostrado efectos de la
C. ofci
-
nalis
en células como el linfocito TCD4. Un extracto
acuoso de la planta inhibió la transcriptasa reversa
en linfocitos de sangre periférica humana; además, se
encontraron e±ectos inhibitorios y actividad antiinfa
-
matoria.
12
En Fbroblastos gingivales no se conocen
investigaciones sobre el efecto de la
C. ofcinalis.
Por
ello, el objetivo de la presente investigación fue ob-
servar los efectos que producen tres presentaciones
de la
C. ofcinalis
en diferentes concentraciones en la
proli±eración de Fbroblastos gingivales humanos para
aportar información que sustente el efecto de esta
planta en los procesos de cicatrización periodontal.
MATERIALES Y MÉTODOS
Obtención de fbroblastos gingivales humanos
Previo cumplimiento de las normas éticas para la in-
vestigación sobre seres humanos, que incluyeron el
diligenciamiento del consentimiento informado, se ob-
tuvo una muestra de tejido gingival producto de una ci-
rugía realizada por Fnes estéticos en un paciente joven
sin a±ectaciones sistémicas ni presencia de infamación
gingival. Los autores no tienen ningún tipo de conficto
de intereses en la elaboración de este estudio. Los
Fbroblastos ±ueron obtenidos a partir de explantes del
tejido gingival. Los ensayos de proliferación se rea-
lizaron con Fbroblastos gingivales humanos (²GH) en
quinto pase. La prueba se realizó por triplicado.
Soluciones de
C. oFcinalis
La fórmula magistral del extracto etanólico de
C. of
-
cinalis
(EEC) 1:1 (50%) fue provista por el laboratorio
Labfarve. Para los ensayos se extrajo el componente
alcohólico con un rotavapor. La fórmula magistral
de la tintura de
C. ofcinalis
(TC) al 20% se obtuvo
igualmente del laboratorio Labfarve, lote 37708200.
El enjuagueWomercial que contiene extracto de
C.
ofcinalis
al 0,20%. Para los estímulos se realizaron
las diluciones de 750, 500, 150, 100 μg/ml de cada
presentación de
C. ofcinalis
en medio de cultivo sin
suero fetal bovino.
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Proliferación Fbroblasto en
Calendula
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Estímulos de
C. ofcinalis
En placas de 96 pozos se sembraron 5.000 células por
pozo, a las cuales se le añadieron 200 μl de medio
completo suplementado con SFB 10%. Se incubaron
durante 12 horas para lograr adherencia, que se veriF
-
có microscópicamente. Las células se estimularon con
cada una de las presentaciones EEC, TC y enjuague,
en cada una de las concentraciones de
C. ofcinalis
(750, 500, 150, 100 μg/ml). Como control se tuvieron
células sin estímulo.
Las lecturas de proliferación celular y viabilidad fueron
realizadas a las 12, a las 24 y a las 48 horas median-
te el reactivo CellTiter 96® AQueous (Promega). Se
adicionaron 10 μl de CellTiter más 50 μl del medio
basal de Eagle (MEM) modiFcado por Dulbeco (DMEM)
sin suplementar a cada pozo, y después de 2 horas
de incubación a 37 ºC, las placas fueron leídas en un
microlector de ELISA a 490 nm.
El efecto de las diferentes presentaciones de
C. of
-
cinalis
en distintas concentraciones sobre los cultivos
de FGH fue comparado con la proliferación celular de
los Fbroblastos del grupo sin estímulo. Se determinó
que el 100% de proliferación equivalía a la absorban-
cia de las células del grupo control, y se calculó la
proliferación de cada pozo según la fórmula:
TP = DO problema × 100 / DO control =
(% sobre el control)
Donde:
TP: tasa de proliferación.
DO: densidad óptica.
Para el análisis de los datos de proliferación se utilizó
estadística descriptiva que incluyó promedios y des-
viación estándar.
RESULTADOS
Los resultados a las 12 horas mostraron un aumento
del 61% en la proliferación celular con el uso del EEC
a una concentración de 500 μg/ml, y con una con-
centración de 750 μg/ml el aumento correspondió
al 31%, al ser comparados con el grupo control. Las
otras presentaciones TC y enjuague no mostraron
ningún cambio en las diferentes concentraciones so-
bre la proliferación del ±GH (Fgura 1).
0
50
100
200
750 μg/ml
500 μg/ml
150 μg/ml
100 μg/ml
Proliferación
150
Extracto etanólico
Tintura
Enjuague
±I²URA 1
E³´CTO µ´
C. Of±INALIS
¶OBR´ ±GH A LA¶ 12 ·ORA¶
Los resultados a las 24 horas no mostraron cambios
en la proliferación celular en ninguna de las presenta-
ciones ni en ninguna concentración al ser comparada
con el grupo control de ±GH (Fgura 2). ¸os resultados
del EEC y del enjuague a las 48 horas mostraron una
leve inhibición de la proliferación, comparados con el
grupo control. La TC en las concentraciones de 150
y 100 μg/ml inhibió el crecimiento celular, al com-
pararla con las demás concentraciones y las demás
presentaciones (Fgura 3).
±I²URA 2
E³´CTO µ´
C. Of±INALIS
¶OBR´ ±GH A LA¶ 24 ·ORA¶
±I²URA 3
E³´CTO µ´
C. Of±INALIS
¶OBR´ ±GH A LA¶ 48 ·ORA¶
0
50
100
200
750 μg/ml
500 μg/ml
150 μg/ml
100 μg/ml
Proliferación
150
Extracto etanólico
Tintura
Enjuague
0
50
100
200
750 μg/ml
500 μg/ml
150 μg/ml
100 μg/ml
Proliferación
150
Extracto etanólico
Tintura
Enjuague
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Madrid MA, Mahecha LC, Oviedo VA, Chaves M, Roa NS, García DA, Moreno GC
Univ Odontol. 2010 Jul-Dic; 29(63): 107-112. ISSN 0120-4319
Los resultados obtenidos mostraron que el enjua-
gue de
C. ofcinalis
en general no mostró efectos
proliferativos sobre los FGH con las diferentes con-
centraciones, a las 12 y 24 horas. A las 48 horas se
produjo una inhibición que no superó el 10% tanto en
concentraciones como en tiempos.
DISCUSIÓN
La
C. ofcinalis
es una planta muy usada en la medi-
cina popular de Centroamérica, Suramérica, Europa y
Asia occidental, y está contenida en medicamentos de
origen vegetal que incluyen enjuagues orales, cremas
dentales, ungüentos, entre otros. Dentro de las activi-
dades biológicas de la
C. ofcinalis
se ha probado su
efecto inmunomodulador,
11,12
antitumoral,
8
antibacte-
riano, antiinfamatorio
8,12
y antiviral. Este estudio tuvo
como objetivo observar los efectos que producen
tres presentaciones de la
C. ofcinalis
en diferentes
concentraciones en el proceso de proliferación de los
Fbroblastos gingivales humanos. Las tres presenta
-
ciones fueron EEC, TC y enjuague K-Trix®.
La obtención de extractos de
C. ofcinalis
varía en
los procesos de extracción que puede lograrse por
trituración, maceración o una mezcla de los dos, y la
separación de los componentes se realiza utilizando
agua o alcoholes, principalmente etanol y metanol
en diferentes concentraciones. En consecuencia, se
obtienen extractos acuosos,
12
etanólicos,
11
metanóli-
cos
8
o hidroalcohólicos. En la presente investigación
el extracto de
C. ofcinalis
fue obtenido con etanol,
y para retirar el componente alcohólico sin perder la
solubilidad de los metabolitos de la planta se realizó
un proceso de evaporación con rotavapor. La tintura
utilizada fue una preparación magistral al 20%; entre
tanto, el enjuague K-Trix®, cuyo componente activo
es EEC, se obtuvo comercialmente.
Los resultados mostraron que el EEC fue el único
producto que produjo efectos proliferativos; por el
contrario, el enjuague mostró inhibición a las 48 horas,
y la TC no alteró el crecimiento de los Fbroblastos
gingivales en cultivo. Esto sugiere que los procesos de
obtención de la tintura (fórmula magistral) y el enjua-
gue K-Trix® (producción industrial) pudieron afectar
los metabolitos activos de la planta. Aunque en el
proceso de extracción del etanol con el rotavapor se
utiliza una temperatura de 60 ºC, la obtención indus-
trial del extracto para el enjuague probablemente usa
temperaturas que degradan estos metabolitos, tal
como lo señalan Jiménez-Medina y colaboradores,
12
quienes muestran que temperaturas de 80 ºC y 120 ºC
para esterilizar el extracto acuoso de
C. ofcinalis
tu-
vieron un efecto inhibitorio en la proliferación celular.
Más recientemente se ha estudiado un nuevo método
de extracción acuosa que utiliza el láser para po-
tenciar la extracción de los metabolitos activos de la
C. ofcinalis
y mejorar signiFcativamente los e±ectos
proliferativos de la planta.
12
Valdría la pena utilizar
este método con
C. ofcinalis
cultivada en Colombia,
considerando que la concentración y el tipo de meta-
bolitos en la planta pueden variar por las condiciones
ambientales.
8
En este estudio, todas las presentaciones de la
C. of
-
cinalis
se evaluaron en dosis entre 100 y 750 μg/ml
sobre cultivos de FGH. Estas concentraciones tomaron
como punto de partida el estudio de Matysik y colabo-
radores, quienes reportaron efectos proliferativos del
extracto metanólico de
C. ofcinalis
sobre Fbroblastos
de piel humana de diferentes extractos de
C. ofcinalis
(etanólicos, etilacetato y heptano), en concentraciones
entre 25 y 250 μg/ml. Dicho estudio mostró un efecto
diferencial asociado con la concentración y con el pico
de mayor efectividad a los 125 μg/ml. Otras investiga-
ciones han probado un efecto diferencial al usar con-
centraciones entre 15,52 μg/ml y 2 mg/ml, asociado al
tipo celular sobre el que se genere el estímulo.
8,12
La presente investigación permitió observar el mayor
efecto proliferativo del EEC en una concentración de
500 μg/ml. En concentraciones menores no tuvo nin-
gún efecto proliferativo. Jiménez-Medina y colabora-
dores reportan que la concentración de mayor efec-
tividad antitumoral correspondió al extracto acuoso
de láser activado
Calendula Extract,
que fue de 250
μg/ml, al estimular seis líneas celulares diferentes.
12
También encontraron que los linfocitos proliferaron
dos y tres veces más en concentraciones de 150, 250
y 500 μg/ml, al observar una proliferación del 36%
en concentraciones de 250-500 μg/ml y del 17% en
concentraciones de 15,62 μg/ml.
12
Con referencia al tiempo, en esta investigación se
observó un efecto proliferativo del EEC a 500 y 750
μg/ml sobre FGH a las 12 horas, efecto que se perdió
a partir de las 24 horas. Este hallazgo es interesante,
si se considera que los objetivos de base de este pro-
yecto son mejorar los procesos de cicatrización pe-
riodontal con el uso de la
C. ofcinalis
, cuyo proceso
de obtención no altere la actividad de los metabolitos,
e identiFcar el e±ecto de estímulos consecutivos del
extracto de
C. ofcinalis
.
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Proliferación Fbroblasto en
Calendula
111
La actividad farmacológica de la
C. ofcinalis
se aso-
cia con metabolitos como ±avonoides,
12
±avonoides
glicosilados, carotenoides,
13
triterpenos,
14
polisacári-
dos arabinogalactanos
14
y betaamilinas,
8
aunque no
es claro en la literatura cuál o cuáles metabolitos son
responsables del efecto proliferativo. Se ha mostra-
do que el extracto acuoso de
C. ofcinalis
favorece
la entrada de linfocitos de sangre periférica al ciclo
celular (efecto proliferativo) y que en líneas celulares
tumorales inhibe el crecimiento, al controlar el ciclo
celular por activación de la caspasa-3, que favorece
que las células tumorales entren en apoptosis.
12
El estudio farmacológico de plantas se constituye en un
campo de investigación interesante que se basa en sus
propiedades terapéuticas y la facilidad de obtención.
Este estudio da comienzo a una serie de trabajos que
buscan profundizar en los efectos terapéuticos en
odontología de la caléndula obtenida en Colombia.
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
El EEC mostró acción proliferativa en FGH a las 12
horas en las concentraciones más altas establecidas
para esta investigación (750 y 500 μg/ml), sin com-
prometer la viabilidad en las concentraciones meno-
res. La actividad proliferativa en FGH se asoció con la
presentación, con la concentración y con el tiempo
de exposición.
Se recomienda estudiar el efecto de la
C. ofcinalis
en el ciclo celular de FGH, al igual que el efecto de
estimulaciones repetidas de
C. ofcinalis
en el FGH.
AGRADECIMIENTOS
A la doctora Sandra Gutiérrez, directora del Centro de
Investigaciones odontológicas (CIO) de la PontiFcia
Universidad Javeriana, por facilitar el desarrollo de la
investigación.
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CORRESPONDENCIA
Gloria Cristina Moreno Abello
PontiFcia Universidad Javeriana
Facultad de Odontología
Carrera 7 # 40-62
Bogotá, Colombia
gcmoreno@javeriana.edu.co
Nelly Stella Roa Molina
nelly.roa@javeriana.edu.co
112
Madrid MA, Mahecha LC, Oviedo VA, Chaves M, Roa NS, García DA, Moreno GC
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Margarita Chaves Clavijo
margarita.chaves@javeriana.edu.co
Dabeiba Adriana García Robayo
garciad@javeriana.edu.co
María Alejandra Madrid Ahumada
maleja_86@hotmail.com
Luis Carlos Mahecha Donato
d_mahec@hotmail.com
Viviana Andrea Oviedo Peñaloza
vivi_oviedo@hotmail.com
logo_pie_uaemex.mx