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Sistema de Información Científica
Red de Revistas Científicas de América Latina y el Caribe, España y Portugal
Rev. Int. Contam. Ambient. 11
(2),
99-103,
1995
María Alejandra
vÁZQUEZ y
~uan
MORETTON
Cátedra de Higiene y Sanidad, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Junín 956,4 piso 11 13, Buenos
Aires, Argentina
(Recibido mayo 1994, aceptado diciembre 1995)
Palabras clave: genotoxicidad, contaminación, aguas residuales, industria gráfica
RESUMEN
Se estudió la genotoxicidad de las aguas residuales de una industria gráfica en etapas previas y posterio-
res a su tratamiento de depuraci6n. Las muestras de la primera cámara de tratamiento y de la cámara de
toma de muestras fueron extraídas secuencialmente en wlumnas de resinas
XAD2
con los disolventes
áter etílico y alcohol metílico, luego de la evaporacibn de los disolvenies, los extractos remanentes fueron
suspendidos en dimetilsulf6xido para los ensayos biolbgiws. El microorganismo de prueba utilizado fue
Saccharomyces cerevisiae
D7 que permitih evaluar en forma simultánea la inducci6n de conversión génica
mitótica y de reveni6n gtnica. Los extractos de la fraccibn no polar (éter) de las muestras de la primera
cámara produjeron efectos genotóxicos moderados que tambián se manifestaron con los extractos de las
fracciones Cter y metanol obtenidas de la cámara de toma de muestras donde se observó principalmente la
inducci6n de reversibn gtnica. Los resultados logrados indican que el tratamiento fisicoquimiw para la
depuración de efluentes no fue efectivo en reducir la genotoxicidad de los mismos.
ABSTRACT
The genotoxic potential of samples from a printing office waste water was evaluated by means of mitotic
gene conversion and point (reverse and suppresor) mutation induction in
Saccharomyces cerevisiae
D7
strain. Waste samples from two dzerent sites of the waste treatment plant were passed through an
XAD2
resin wlumn. The wlumn was sequentially eluted with ethyl ether and methanol. After evaporation to
dryness the extracts were suspended in dimethylsulfoxide for their use in biological tests. The result
obtained showed a moderate genotoxic response induced by the non-polar fraction (ether extract) obtained
from samples of the pretreatment area. Ether arid methanol extracts from samples obtained afler wastc
water purification treatment, induced increases in point mutation frequencies. The results obtained showed
that the physiwchemical treatment for waste water purification was ineffective in decreasing genotoxic
activity.
Al continuar con la serie de determinaciones realizadas en
este laboratorio destinada a la detección de efectos genotóxicos
en cursos de aguas contaminadas y en efluentes de distintas
industrias (Moretton
et al.
1990,199 1,1992), en este trabajo se
estudiaron las aguas residuales de una industria
gráfíca
ubicada
en la Ciudad de Buenos Aires, dedicada a la impresión de
revistas y de material grflico diverso. Sus líquidos de desecho
son mezclas de fijadores, reveladores fotográficos, detergenles,
etc. La composición cualitativa declarada por la imprenta para
estos líquidos es la siguiente:
-Revelador concentrado positivo EP 3
1
(Hoechst), solución
acuosa alcalina de óxido de sílice, pH 13-14
-Sensibilizador
RN
81
(Hoechst), sales minerales diazotadas
-Solución copiadora
RN
82
(Hoechst)
-Laca reveladora RC 55 (Hoechst), solución a base de
ciclohexano, ácido acético y propilenglicol
-Corrector de planchas positivas KC 23 (Hoechst)
-Fijador concentrado para películas de acceso rápido
G
3330
(Agfa), solución de metanol, hidroquinona, sulfito de sodio,
hidróxido de sodio, hidróxido de potasio con 0.025 ppm de
plomo
-Revelador de películas G 10 1 (Agfa)
-Lavador de mantilla
VWM
(Primatest)
El pH del efluente es de 6.5 y el volumen diario eliminado
M.A. Vázquez y J. Moreiion
de aproximadamente 0.8 metros cúbicos. Otros productos
empleados, tales como tintas para imprimir y agentes para el
lavado de rodillos de impresión (Aqualess, Quimeco y
Aquagraf, Grafex) no llegan al efluente en estudio. Los
efluentes son volcados a una primera cámara de tratamiento
donde se mezclan, de allí pasan a una segunda cámara de
tratamiento donde se agrega coagulante y se permite la sedi-
mentación. Los barros resultantes de dicha sedimentación son
acumulados y desechados periódicamente como residuos só-
lidos. El agua de la última cámara pasa por rebalse a la cáma-
ra de toma de muestras de donde se vuelcan al sistema cloaca1
de la ciudad.
Del efluente se consiguen muestras de la primera cámara y
de la cámara de toma de muestras, ya que el contenido de la
segunda cámara no resulta homogéneo y puede proporcionar
resultados anómalos por residuos de material coagulado.
El uso de resinas XAD2 permite realizar extracciones
secuenciales con disolventes de distintas polaridades. El mi-
croorganismo que se emplea para los ensayos biológicos es
Saccharomyces cerevisiae
D7, una levadura usada por distintos
autores para estudios de muestras ambientales (Bronzetti
et al.
1980, Moretton
e! al.
1990,199 1, Houk 1992).
El microorganismo de prueba permite detectar simultánea-
mente mutación reversa, conversión mitótica y entrecruzarnien-
to mitótico (Zimmerman
et al.
1975). La conversión mitótica
involucra a los alelos
trp
5-12 y
trp
5-27y la mutación reversa
al par
ilu
1-92/
ilu
1-92. Para más detalles sobre este ensayo
pueden consultarse a Zimmerman
et al.
(1 975)
y
a Sora
et al.
(1979).
Los residuos líquidos se colectaron de los diversos secto-
res de la planta mencionados en la introducción. Muestras de
500 m1 de agua se pasaron por columnas de resinas de inter-
cambio XAD2 (Rohm and Haas, Filadelfía, EUA) purifica-
das de acuerdo con Dressler (1979). Dichas resinas han sido
utilizadas por otros autores para la extracción de compuestos
presentes en efluentes industriales (Fracasso
et al.
1992,
Omura
et al.
1992). La velocidad de flujo a través de una
columna de 12 cm de alto por 1 cm de diámetro fue de 2 ml/
min. Luego del pasaje de las muestras, las columnas se lavaron
con agua destilada para eliminar las fracciones solubles y se
procedió a la extracción secuencia] con éter etílico (Merck) y
alcohol metílico (Merck). Los extractos se evaporaron a seque-
dad en un evaporador rotatorio con presión reducida a 28-30
grados centígrados. El residuo remanente se redisolvió en
dimetilsulfósido (DMSO) para ser usado en las pruebas de
genotosicidad.
La cepa de levadura empleada pertenece a la colección de
cultivos microbianos de la Cátedra de Higiene y Sanidad y
fiie proporcionada originalmente por el Dr. Giorgio Bronzetti
del Istituto di Mutagenesi e Differeziamento CNR, Pisa, Italia.
Los cultivos de la levadura, en fase logarítmica tardía de
crecimiento, fueron puestos en contacto con diferentes dilu-
ciones de los extractos en medio líquido de amortiguador
fosfato 0.1 M pH 7.4, durante 2 y 6 horas, en bailo térmico a
28 grados centígrados con agitación. Después de estos perío-
dos se tomaron alícuotas que se lavaron dos veces con igual
volumen de amortiguador y se inocularon por triplicado en la
superficie de los medios selectivos correspondientes (Sora
e!
al.
1979). Las placas se incubaron durante 48 horas para el
recuento de totales y de 72 a 96 horas para el registro de
revertantes y convertantes. Los resultados se consideraron
positivos cuando la frecuencia de conversión o de reversión
génica superaron en más de dos veces la frecuencia del testi-
go @e Serres 1981).
RESULTADOS
En la primera etapa se realizaron pruebas de sobrevivencia
de la cepa en estudio con distintas diluciones de los extractos,
los porcentajes logrados aparecen en las tablas
1
y
11.
En todos
los casos las muestras de extractos puros provocaron una caída
del 50 al 60% en la viabilidad de las levaduras. Con el extracto
éter obtenido de aguas de la primera cámara el porcentaje de
sobrevivencia se mantuvo bajo al incubar durante 2 horas
cualquiera de las diluciones. Al incubar por 6 horas la viabilidad
se recuperó a partir de la dilución a1 0.5. El extracto metanol del
mismo origen solo mostró diferencias significativas entre los
porcentajes de viabilidad alcanzados al ensayar la muestra pura
y la diluida al 0.5; para las diluciones se pudo observar una
menor toxicidad que la encontrada con el extracto éter.
Con los extractos de la cámara de toma de muestras el patrón
se invierte resultando más tóxico el metanólico, sin variacio-
nes notables entre las 2 y las 6 horas de incubación.
TARLA 1. SOBREVIVENCIA DE
Saccharomyces cerevisiae
D7
EN
EXTRACTOS OBTENIDOS DE MUESTRAS DE
AGUAS
DE LA PRIMERA CAMARA
CC
SOBREVIVENCIA
%
Extracto éter
2 horas
6 horas
0.0
1
00
1 O 0
O.
1
76
1
O0
0.2
66
85
0.5
65
80
1
.O
62
48
Extracto metanol
0.0
1
O0
1 0 0
o.
1
93
93
0.2
80
80
0.5
90
81
1.0
5 8
58
CC* 0.0: 4 ml de suspensión de levadura de 108cel./ml (SL)
+
1 m l d e s o l u c i ó n
amortiguadora; 1.0, 0.5, 0.2 y 0.1: 4 m1 SL
+
1 m 1 d e e x tr a c to p u r o o
diluido al 50%. 20%
ó
lo%, respectivamente, con una solución
amortiguadora
**
Se consideran itnicamente aqiiellos recitenios en los qite no se encontró
una variación mayor al 5% entre los promedios de experiencias
AGENTES GENOT~XICOS
EN EFLUENTES DE LA INDUSTRA GRÁF~CA
TABLA 11. SOBREVIVENCIA DE
Saccharomyces cerevisiae
D7
EN EX-
al diluir la muestra así como al incubar durante 6 h. En 10
TRACTOS OBTEN1'OS
DE MUESTRAS DE AGUAS DE LA
referente a las frecuencias de conversión sólo se lograron
CAMARA DE TOMA DE MUESTRAS
valores indicadores de efectos genotóxicos cuando se
CC*
SOBREVIVENCIA
%
Extracto éter
2
horas
6
horas
0.0
1 O0
1 O0
o. 1
1 O0
1 O0
0.2
1 O0
1 O0
0.5
85
80
1
.o
54
45
Extracto metanol
0.0
1 O0
1 O0
O. 1
90
79
0.2
65
65
0.5
71
70
1
.O
39
60
CC** V9,
de la tabla 1
Debe considerarse que cuando la sobrevivencia cae a valo-
res inferiores al 40% de los obtenidos en los testigos, el efecto
genotóxico que pueda hallarse es dudoso ya que podría ser
enmascarado por la citotoxicidad.
Los valores de las frecuencias de conversión génica mitótica
y reversión génica en
Saccharomyces cerevisiae
D7 pueden
verse en las tablas
ilI
y
IV.
En la tabla
IiI
se observa que, con el
extracto éter de la primera cámara se incrementó notablemente
la reversión con respecto al testigo; dicho aumento desapareció
ensayaron extractos diluidos al 0.2
0.1 e incubando duran-
te 2 horas.
Para el extracto metanol de la primera cámara se demostró
genotoxicidad con la muestra pura y con la dilución al 0.2,
luego de 2 y 6 horas de exposición, respectivamente. En este
caso no se detectaron variaciones significativas en las fre-
cuencias de conversión génica. En el extracto éter de esta
cámara se localizó la actividad genotóxica más importante.
El agua residual de la cámara de toma de muestras arrastra
componentes de las dos cámaras anteriores. En la tabla
IV
puede verse que el extracto de éter produjo una elevación en
las frecuencias de reversión génica con las diluciones altas ya
a las 2 horas de contacto. En las formas menos diluidas de
dicho extracto el incremento sólo se detectó con los mayores
tiempos de exposición.
El extracto metanol también causó un aumento notorio en
las frecuencias de reversión genica que se acentuó (en parti-
cular con la dilución al 0.5) al incubar durante 6 horas, en
este caso la dilución disminuyó los valores acercándolos a los
del testigo. Las frecuencias de conversión génica aumentaron
en las primeras horas de contacto con el extracto metanólico
puro, dicho aumento desapareció al incrementarse el tiempo
de incubación.
TABLA 111. ENSAYOS DE GENOTOXICIDAD CON EXTRACTOS DE AGUAS DE LA PRIMERA CAMARA
CCa
FR(XI
DE)
V
FC(
X*
DE)
V
2 horas
Extracto
0.0
0.15
*
0.03
1
.O
0.22
*
0.05
1.0
éter
O. 1
0.21
i
0.03
1.4
0.43
*
0.06
1.9
0.2
0.19
*
0.05
1.3
0.47
*
0.01
2.2
O. 5
0.43
*
0.02
2.8
0.28
*
0.06
1.3
1
.O
0.34
i
0.04
2.3
0.29
*
0.06
1.3
Extracto
0.0
0.05
I
0.02
1.0
0.20
*
0.03
1
.O
metano1
O. 1
0.06
*
0.01
1.2
0.26
*
0.03
1.3
0.2
0.07
i
0.05
1.4
0.24
*
0.02
1.2
0.5
0.08
I
0.02
1.6
0.23 + 0.03
1.2
1.0
0.10
i
0.03
2.0
0.24
i
0.01
1.2
6 horas
Extracto
0.0
0.22
*
0.00
1.0
0.26
*
0.05
1
.O
6ter
O. 1
0.28
i
0.03
1.3
0.33
*
0.05
1.3
0.2
0.31
i
0.01
1.4
0.31
*
0.03
1.2
0.5
0.37
i
0.01
1.7
0.28
*
0.07
1.1
1.0
0.32
*
0.02
1.5
0.43
*
0.06
1.6
Extracto
0.0
0.10
*
0.01
1.0
0.27
i
0.08
1.0
metano1
0.1
0.10
i
0.00
1.0
0.28
*
0.06
1.0
0.2
0.21
i
0.02
2.1
0.32
0.07
1.2
O. 5
0.16
0.01
1.6
0.31
*
0.05
1.1
*
Ver pie de la tabla
1;
FR frecuencia de reversión génica x
10';
FC frecuencia de conversión génica
x 10';
V frecuencia ensayolfrecuencia testigo;
X
promedio entre frecuencias de experiencias independientes; DE desviación estándar
M.A. Vázquez
y
J. Moreiion
TABLA IV. ENSAYOS DE GENOTOXICIDAD CON EXTRACTOS DE AGUAS DE LA CAMARA DE TOMA DE MUESTRAS
CC*
FR(XI DE)
V
FC(XI DE)
V
2 horas
Extracto
0.0
0.12
*
0.03
1.0
0.27
*
0.07
1
.O
éter
O. 1
0.31
*
0.02
2.6
0.36
*
0.07
1.3
0.2
0.32
í
0.01
2.7
0.27
*
0.05
1.0
O. 5
0.21
í
0.05
1.8
0.37
&
0.06
1.4
1.0
0.18
*
0.00
1.5
0.38
*
0.08
1.4
Extracto
0.0
0.15 IO.01
1.0
0.15
*
0.05
1.0
metano1
O. 1
0.18
*
0.01
1.2
0.16
k
0.05
1.1
0.2
0.31
*
0.02
2.1
0.26
i
0.05
1.7
O. 5
0.28
i
0.01
1.9
0.25
*
0.03
1.7
1
.O
0.36
*
0.01
2.4
0.39
*
0.04
2.6
6 horas
Extracto
0.0
0.10
*
0.02
1.0
0.26
*
0.03
1.0
éter
O. 1
0.30
0.01
3.0
0.36
*
0.03
1.4
0.2
0.30
*
0.02
3.0
0.26
í
0.05
1.0
O. 5
0.25
í
0.03
2.5
0.38
*
0.02
1.5
1.0
0.29
*
0.03
2.9
0.47
*
0.03
1.8
Extracto
0.0
0.15
*
0.01
1 .O
0.20
í
0.05
1.0
metano1
O. 1
0.19
*
0.01
1.3
0.36
*
0.05
1.8
0.2
0.26
i
0.03
1.7
0.29
0.03
1.4
O. 5
0.45
*
0.01
3.0
0.36
*
0.04
1.8
1.0
0.41
*
0.02
2.7
0.37
+
0.04
1.8
*
Ver pie de la tabla 111
El sistema empleado por esta industria
gráfica
para la elimina-
ción de efluentes líquidos es similar al de muchos de los
establecimientos medianos de este tipo y se encuentra regla-
mentado por las autoridades municipales tanto en lo referente a
su construcción como a su funcionamiento. El proceso de
impresión también guarda semejanza con el utilizado por
numerosos talleres que arrojan sus aguas residuales al sistema
cloacal de la ciudad. Dadas estas características puede conside-
rarse al efluente estudiado como representativo de los residuos
líquidos de miles de empresas semejantes ubicadas en la zona
urbana de Buenos Aires.
Las
aguas de la primera cámara muestran el efecto del efluente
crudo. En estos ensayos la genotoxicidad no desapareció con la
dilución, sino que se manifestó en forma de conversión génica
antes que reversión génica. En cualquier caso, se trata
principalmente de la acción de compuestos no polares lo que
se verifica con la baja genotoxicidad evidenciada por el
extracto metanólico. La desaparición de efectos genotóxicos,
luego de 6 horas de incubación, podría atribuirse a la inter-
vención de sistemas de reparación exentos de error, de la
molécula de ADN (Moretton 1986), en una mezcla cuya acción
tóxica no depende del tiempo de contacto. Este último punto
se demuestra claramente con los datos de sobrevivencia de
la
tabla 1
que resultaron mayores luego de
6
horas de contac-
to que durante las primeras horas, indicando la presencia en
la mezcla de componentes poco polares que penetraron rápi-
damente en las células.
Al ser sometidas las aguas residuales a un proceso de
coagulación en la segunda cámara, el líquido obtenido cambia
sus características genotóxicas. Con tiempos cortos de ex-
posición se manifestaron principalmente los efectos de los
agentes genotóxicos más polares presentes en el extracto
metanólico, estos efectos se mantuvieron a las 6 horas se-
guramente debido a una penetración mas lenta del agente
tóxico a las células. Sólo se registraron resultados positivos
con el extracto éter al diluirlo, lo que indicaría un posible
antagonismo ejercido por ciertos componentes de la mezcla
a elevada concentración. Al incubar por mas tiempo se
incrementó la frecuencia de reversión debido al aumento del
contacto. No aparece en este caso la actividad de los siste-
mas de reparación de la molécula de ADN lo que refuerza el
concepto de diferente composición del extracto obtenido de
esta cámara.
Debe considerarse que este líquido es eliminado a través
del sistema cloacal y que su efecto genotóxico no disminuye
luego de los procesos de sedimentación y coagulación a
que es sometido. Tampoco es afectado por la dilución así
que puede estimarse un importante aporte a los efectos
genotóxicos detectados en cursos de agua del área urbana
(Moretton
et
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