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Red de Revistas Científicas de América Latina y el Caribe, España y Portugal
Rev. Int. Contarn. Ambient.
13
(2),
63-71
METODOLOG~ EN LÍNEA PARA LA DETERMINACIÓN DE TRAZAS DE LOS
HERBICIDAS
2,4-D Y 2,4-DB EN AGUA
Luz ~lena
VERA-ÁVILA,
osé Luis MERAZ-LIRA y ~atricia
PADILLA-CORTÉS
Departamento de Química Analítica, Facultad de Química, Universidad Nacional Autónoma de México, Ciudad Universitaria,
Coyoacán 045 10 D.F., México
(Recibido ngosto
199
7, aceptado diciembre
1997)
Palabras clave: 2,4-D, 2,4-DB, preconcentración en línea, análisis de agua.
RESUMEN
Se desarrolló
un
método analítico, basado en la Extracción en Fase Sólida acoplada en línea con
la
Cromatografia de Líquidos, para la determinación de trazas de los herbicidas
2,4-D
y
2,4-DB
en agua. Los
soliitos fueron extraidos de
la
matriz acuosa mediante una fase reversa polimerica empacada en una
pequeiia precolumna, posteriormente el extracto se purificó por transferencia de los solutos ionizados a
una segunda precolumna empacada con un intercambiador de aniones. Finalmente, esta última fue eluida en
línea con
la
columna analítica para la separación
y la
detección
en
UVde los analitos. La precisión (<3%),
exactitud (recuperacióii -100%)
y
los límites de detección
(5 1
pgíi) del método, aunados
a
sus posibilida-
des de autoniatización, lo Iiacai idóneo para el nioiutoreo regular de estos dos herbicidas
en
aguas naturales
y
tratadas.
ABSTRACT
An
analytical method based on Solid Phase Extraction on-line coupled
to
Liquid Chromat~graphy was
developed for the trace determination of the herbicides
2,4-D
and
2,4-DB
in water.
A
small precolumn
packed with a polyrneric reversed phase was used for the extraction ofthe solutes from the aqueous matrix.
Further cleanup of the extract was performed by the transfer of the ionized solutes toa second precolumn
packed
with
an
anion
exchanger. Finally, the latter \vas coupled
to
the analytical column for the on-line
elution, separation and UV detection of the analytes. The precision
(<
3%), recovery (-100%)
and
detection limits
(5
lpgll)
of
the method, joined to the possibility of its automation, render
it
as an ideal
iiieaii for the regular monitoring of these two herbicides innatural
and
treated waters.
Los ácidos
2,4-diclorofenoxiacético
(2,4-D) y 4-(2,4-
diclorofenoxi) butanoíco (2,4-DB) se encuentran entre los herbi-
cidas más utilizados en México para el control de maleza en los
campos de cereales y en las presas. En la agricultura el 2,4-D se
emplea, principalmente, en cultivos de arroz, avena, caña de azú-
car, centeno, espárrago, maíz, trigo y sorgo; mientras que el 2,4-
DB se usa en los de alfalfa, cacahuate y soya. Estos herbicidas,
por ser moderadainente hidrosolubles, se introducen en las aguas
superficiales y subterráneas por el drenado natural de los suelos
debido a las lluvias o por infiltración (Schmidt
et al.
1983).
Adicionalmente, en México el 2,4-D se utiliza sistemáticamente
para el control de hierbas acuáticas en lagunas y presas que
sirven como suministro de agua para las plantas potabilizadoras
@OF 1991).
Aunque uno de estos compuestos está clasificado como mo-
deradamente tóxico (2,4-D) y el otro como ligeramente tóxico
(2,4-DB)
(bn der Leeden et
al.
1990), el estudio de su ciclo en el
agua muestra una gran persistencia debida a la baja actividad de
biodegradación para este tipo de contaminantes (Hamann y
Kettrup 1987). Por ello, es necesario monitorear regularmente
sus niveles de concentración en este medio natural. El método
oficial más empleado para determinar los ácidos clorofenoxi en
agua es el método 8 150 de la USEPA (Agencia de Protección
Ambiental de EUA, Keith 1990), que se basaen una doble extrac-
ción líquido-líquido seguida por evaporación del disolvente or-
gánico, derivación de los solutos y análisis por cromatograiia de
gases. Este método es largo y tedioso, implica una contínua
manipulación de la muestra y requiere del uso y posterior evapo-
ración de volúmenes relativamente grandes de disolventes or-
gánicos de alta pureza.
En aÍíos recientes, el empleo de la Extracción en Fase Sólida
(EFS) para la preparación de muestras acuosas ha tenido gran
éxito, tanto en la modalidad en diferido (cartuchos y discos)
coino en línea (precoluinnas). En el caso particular de los acidos
clorofenoxi se lian utilizado diversos materiales para su aisla-
miento y preconcentración por EFS coino las resinas
intercambiadoras de aniones (Ohno y Aoyama 1992), las fases
apolares C-18 (Hoké
et
al.
1986, Wells y Michael 1987) y las
resinas estireno-divinilbenceno no iónicas (Geerdink
et
al.
1989
y 1991, Betti
et
al.
1990, Chiron
et
al.
1994). Sin embargo, muchos
de los métodos reportados presentan aún algunas desventajas.
En los métodos en diferido persisten los riesgos de pérdida o
contaminación de la muestra durante su manipulación y, ade-
más, no son automatizables. Los métodos en línea presentan el
problema de la falta de selectividad de los adsorbentes (princi-
palmente de las fases reversas), ya que éstos extraen y concen-
tran no sólo a los compuestos de interés sino a toda la materia
orgánica de polaridad media o baja presente en la muestra acuo-
sa. Por lo tanto, en el cromatograma obtenido al eluir en linea la
precolumna con la columna analítica se observa una matriz de
fondo muy grande que dificulta o imposibilita la determinación
de los herbicidas a bajos niveles de concentracion.
Para resolver el problema de la baja selectividad en la EFS en
línea se han propuesto dos tipos de sistemas: la elución fraccio-
nada de la precolumna, enviando solamente la fracción que con-
tiene los solutos de interés a la columna analítica (Geerdink
et
al.
1991) y el uso de arreglos de varias precolumnas con diferentes
empaques (Nielen
et
al.
1985, Hennion
et
al.
1991). Esta última
opción, ya utilizada anteriormente con acidos clorofenoxi (Vera-
Avila
et
al.
1996), es la que se propone en este trabajo para
determinar los lierbicidas 2,4-D y 2,4-DB Iiasta niveles de con-
centración del orden de partes por billón (pgll) o inferiores, se-
gún el tipo de agua que se va a analizar.
wpo
La figura 1 muestra el diagrama del arreglo experimental utili-
zado, el cual está constituido por dos sistemas unidos mediante
válvulas de conmutación. El sistema de analisis consta de un
croinatógrafo de líquidos Gilson (P1 en la
Pig.
l), equipado con
dosbombas modelos 305 y 306, un mezclador dinámico modelo
8 1 1B y un medidor de presión modelo 805; una válvula de inyec-
ción Rheodyne 7 125 (válvula C) con rizo de 22 p1 calibrado
in
situ
(Vera-Avila
et
al.
1994); una columna analítica (RP-HPLC);
un detector
UV
con arreglo de diodos Spectromonitor 5000
(UV)
y un integrador-graficador Hewlett-Packard modelo 3396A (1). El
sistema de preparación de muestra, intercalado entre el inyector
y la columna analítica, consta de una bomba isocrática Beckman
2 10A (P2) y dos válvulas de conmutación Rheodyne 7000 (vál-
vulas A y B), con la precolumna de concentración (m) y la
precolumna de limpieza del extracto (AX) colocadas respectiva-
mente entre las puertas 1 y 4 de cada válvula.
Columnas y fases móviles
Las dos precolumnas utilizadas, de acero inoxidable 20 X 2
Fig.
1. Diagrama del montaje experimental utilizado para la extracción,
concentración, limpieza y análisis cromatográfico de 2,4-D y 2,4-
DB en agua
P,: crornatógrafo para gradiente binario, P,: bomba isocrática, A y
B: válvulas de conmutación de alta presión, C: inyector, UV: detec-
tor,
1:
integrador, D: desechos, RP: precolumna de concentracion
(20x2 mm D.1.) empacada con fase CHP-3C de 10 pm, AS:
precolumna de limpieza (20x2 mrn D.1.) empacada con fase PRP-
XlOO de 10 pm, RP-HPLC: columna analitica (150~4.6 mm D.1.)
empacada con fase Spherisorb ODS-2 de 5 pm.
mm D.I. de Upchurch Scientific, fueron empacadas en el labora-
torio con una bomba Haskel modelo 29426. La precolumna de
concentración
(RP)
se empacó a 2 10 bar con la fase reversa poli-
mérica CHP3C, 10
pm,
de Mitsubishi en suspensión metanólica
ligeramente acidificada. La precolumna de limpieza del extracto
(AX) se empaci, a 150 bar con la resina intercambiadora de aniones
PRP-X 100,lO pm, de Hamilton en una suspensión metanol-NaOH
@H 13) 60:40vh! La columna analítica (RP-HPLC), de acero inoxi-
dable 150 X 4.6 mm D. I., se empacó en el laboratorio a 500 bar con
la fase reversa Spherisorb ODS-2,s pm, de Phase Separations en
una suspensión etanol-acetona 50:50 vlv.
DETERMINACION DE 2,4-D Y 2.4-DB
EN AGUA
65
La elución y separación de los coinpuestos se efectuó con un
gradiente binario de fase móvil a flujo de 1 mllinin y temperatura
ambiente. Las fases inóviles débil (fase A) y fuerte (fase B) fue-
ron inezclas acetonitrilo-agua @H 3.8) 20:80 vlv y 80:20 vlv, res-
pectivamente; la parte acuosa en ambas fases contenía HClO,
0.01 M, HCOOH 0.01 My NaOH para ajustar el pH al valor indi-
cado. El programa de gradiente empleado fue: fase móvil B, O min
=
O%, 5 min
=
5%, 20 inin
=
35% 2 1 min
=
40%~
40 inin
=
45%.
aplicado para volúmenes de muestra entre 120 y 130
m1
sin nin-
guna modificación.
En la
figura
2 aparece el diagrama de bloques del procedi-
miento para el tratamiento previo de la muestra. La filtración se
realizó con una membrana de Nylon
66,
de poro 0.4 pm, colocada
en un sistema de filtración Millipore modelo OM027; el filtrado
Filtración y acidificación
de la muestra
Reactivos y disoluciones
El acetonitrilo y el inetanol fueron grado croinatográííco de
Prolabo. El agua utilizada para la preparación de fases inóviles y
inuestras fortificadas para el estudio de certificación del inétodo
fue grado reactivo tipo 1, obtenida de un desionizador Nanopure
de Bamstead Tlierinolyne. Otros coinpuestos grado reactivo ana-
lítico fueron: liidróxido de sodio y ácido fóniuco de Merck y ácido
perclórico de Aldricli, todos empleados sin purificación ulterior.
Los ácidos 2,4-D @Ka
=
2.61) y 2,4-DB (pKa
=
4.8) se adquirieron
de Chein Service con un grado de pureza certificada del 99%.
Se preparó una inezcla patrón de los liehicidas a una concen-
tración de 990 mdl cada uno en inetanol. A partir de esta disolu-
ción se prepararon las disoluciones estándar de trabajo a dife-
rentes concentraciones de los analitos, igualmente en metanol.
Tratamiento ~)reMo
de la muestra
Para la aplicación del inétodo propuesto en este trabajo, el
inuestreo se realizó con un frasco áinbar de -125 inl el cual fue
llenado liasta cerca del borde con el agua probleina. Antes de
comenzar el análisis, se marcó el inenisco del agua en el frasco
para determinar posteriormente el volumen exacto de muestra y
poder realizar los cálculos cuantitativos. Este inétodo puede ser
Muestra
disponible
en frasco
4
5 ml al frasco
de muestra
lavado con
Frasco
Adici6n de agua
2 ml al frasco de
lavado
muestra
Adición de HC104
concentrado
Operaciones
en línea
Fig. 2. Tratamiento previo de la muestra (operaciones fuera de línea)
Equilibrar RP
Cargar en RP
Lavar RP con
agua (0.2 ml)
Equilibrar AX
Transferir de RP a AX
con S2 (20 ml)
con S2 (6 ml)
Lavar AX con
agua (0.5 ml)
Equilibrar RP-HPLC
Eluir y analizar
con fase móvil A
(12 ml)
Equilibrar AX
+
RP-HPLC con fase
J
Inyectar estándar
móvil A (12 ml)
en AX
+
RP-HPLC
Regenerar RP con
H20 (20 ml) y MeOH (20 ml)
Regenerar AX
+
RP-HPLC
con fase móvil B (10 ml)
Flg. 3. Operaciones en línea para la determinación de trazas de 2.4-D y
2,4-DB en agua
RP: precolumna de concentración,
U:
precolumna de limpieza,
RP-HPLC: columna analitica, S,: metanol-HCIO, (pH 1) 5:95 viv,
S,: acetonitrilo-NaOH (pH 10) 10:90 viv, MeOH: metanol, fase
niovil A: acetonitrilo-agua (pH 3.8) 20:80 viv con HCIO, 0.01 M,
HCOOH 0.01 M y NaOH para ajustar el pH, Fase móvil B:
acetonitrilo-agua (pH 3.8) 80:20 viv con HCIO, 0.01 M, HCOOH
0.01 M y NaOH para ajustar el pH
se recibió en un matraz kitazato de vidrio de 150 ml, que fue des-
pués utilizado directamente como reservorio de la boinba P2 du-
rante las operaciones en Iínea. Antes de usarse, la membrana se
sumergió por 1 a 2 horas en metanol, luego
se
colocó en el sisteina
de filtración y
se
lavó con 10 ml de metanol
fresco
y 20
ml
de agua.
Después de filtrar la muestra, el frasco
se
enjuagó con inetanol
y
agua como
se
indica en el diagrama y ambos disolventes se pasa-
ron a través de la misma membrana y se colectaron en el rnisino
matraz htazato que el agua problema. Al terminar el tratamiento
indicado en la
figura
2
se
tienen, aproximadamente. 133
inl
de una
disolución con 3.75% de metanol y pH cercano a 1.
Concentración y análisis
El diagrama de la
figura
3 muestra las operaciones en Iínea
efectuadas para la extracción y la concentración de los lierbici-
das,
la limpieza del estracto y el análisis cromatográfico, emplean-
do el arreglo experimental presentado en la
figura
1. La posición
de las válvulas A y B (carga o inyección) y el estado de las
bombas P 1 y P2 (en operación o detenida) durante los diferentes
pasos de esta parte del método se indican en la
tabla 1.
TABLA
1.
POSICIÓN DE LAS V~CYLAS
((A))
Y «B» Y ESTADO DE
LAS BOMBAS P, Y P, DURANTE LOS DIFERENTES PASOS
.
A
DEL LIÉTODO
Paso
Operación
Válvula
Válvula
Bomba
Bomba
1
Equilibrar RP
L
1
ON
ON
Regenerar AX+RP-HPLC
2
Cargar RP
L
I
ON
ON
Equilibrar AX+RP-HPLC
y analizar estándar
3
Enjuagar RP con agua
L
1
OFF
ON
4
Equilibrar
AX
1
L
OFF
ON
5
Transferir de RP a
AY
L
L
ON
ON
Equilibrar RP-HPLC
6
Enjuagar
AX
con agua
1
L
OFF
ON
7
Analizar muestra
L
1
ON
ON
Regenerar RP
8
Regresar a 1 para la
sieuiente muestra
RP: precoIumna de concentración,
U:
precolumna de limpieza, RP-
HPLC: columna analítica, L: posición «carga», 1: posición cinyec-
ciónn, ON: en operación, OFF: ctdeteiiida))
La bomba P1 sólo se usa para enviar las fases móviles hacia el
sistema de análisis. La bomba P2 se utiliza para enviar 5 disolu-
ciones diferentes: agua, metanol, mezcla metanol-HC10, @H 1)
5:95 v/v (S l), mezcla acetonitrilo-NaOH @H 10) 10:90 v/v (S2) y
la muestra, hacia el sistema de preparación de muestra. El equili-
brio de las precolumnas RP y AX (pasos 1 y 4) se realiza a flujo
de 2 ml/min, el enjuague de las mismas con agua (pasos 3 y 7) se
efectúa a 0.2 mitmin, las demás operaciones se llevan a cabo a 1
mitrnin. En la
tabla
1
se observa que algunas operaciones se
realizan simultáneamente (en los pasos 1,2,5 y 7) para disminuir
el tiempo de análisis; en estos casos, al terminar una de las ope-
raciones, la bomba correspondiente
se
detiene y se espera a que
la otra operación termine antes de proceder con el siguiente paso.
Al terminar cada paso, la cabeza de la bombaP2 y las tuberías del
sistema de preparación de la muestra deben enjuagarse y Ilenar-
se con la siguiente disolución a utilizar. lo cual se lleva a cabo
bombeando con P2 la nueva disolución durante 3 minutos a un
flujo de 5 ml/min y manteniendo las válvulas
A
y B en posición
((inyección))
y la bomba P 1 detenida.
El conjunto de operaciones en Iínea se puede trabajar en
se-
ries de ciclos contínuos para el análisis rutinario de muestras. En
cada ciclo están incluidas operaciones de regeneración de las
precoluinnas y la columna analítica para eliminar compuestos
presentes en las muestras que hayan podido quedar atrapados
en ellas y así evitar problemas de contaminación cruzada. Para
mayor protección de las columnas
AX
y RP-HPLC se recomien-
da, al finalizar el dia de trabajo, lavarlas con 20 ml de agua y 20
ml
de una mezcla acetonitrilo-agua 80:20 v/v, sin sales. Asimismo,
para mantener la capacidad de retención de la precolumna
AX
es
necesario reactivarla, después de cada 10 muestras analizadas,
con 20 m1 de una disolución acuosa de NaOH a pH 12 seguidos
por un abundante lavado con agua. Esta operación debe reali-
zarse conectando la precolumna directamente a la bomba
isocrática, ya que la disolución de NaOH a pH 12 daña las válw-
las de conmutación.
Las operaciones en línea pueden ser completamente
automatizadas adaptando una válvula selectora de baja presión
con 5 canales a la entrada de la bomba isocrática. Todas las
válvulas, incluyendo el inyector, deberán ser neumáticas y de-
berán estar controladas por un microprocesador al igual que el
detector y las bombas F1 y P2.
La duración total del análisis, incluyendo el llenado y enjua-
gado de tuberías con cada nueva disolución (no indicado en la
Tabla l),
es de aproximadamente 3 horas. Durante este tiempo el
analista puede realizar el tratamiento previo de las muestras (fil-
tración y acidificación) si las operaciones en línea están
automatizadas.
Operaciones fuera de Iínea
Los ácidos 2,4-D y 2,4-DB en su forma molecular son bastante
hidrofóbicos y tienden a adsorberse sobre la superficie de cual-
quier material que se encuentre en contacto con sus disolucio-
nes acuosas (Walsh
et
al. 1988). De hecho, en un trabajo previo
(Vera-Avila
et
al. 1996) se comprobó que el 2,4-DB puede
adsorberse sobre los filtros o las paredes internas de los reci-
pientes que contienen la muestra, aún estando en su forma
ionizada. Por ello, es necesario tener algunas precauciones du-
rante la preparación de la muestra para evitar pérdidas de los
analitos. Después de filtrar la muestra deben enjuagarse cuida-
dosamente con metanol, el frasco y la membrana de filtración,
para recuperar solutos adsorbidos y un poco de agua para arras-
trar los últimos residuos del disolvente orgánico; ambos
disolventes deben añadirse a la muestra. Se debe utilizar un vo-
lumen peque50 de los disolventes de enjuague para no diluir
demasiado la muestra y no limitar, en operaciones posteriores, el
volumen de ésta que puede ser cargado en la precolumna RP. Por
otra parte, se ha observado que en presencia de disolventes
DETERMINACION DE 2,4-D Y 2,4-DB EN AGUA
orgánicos, la membrana de filtración de Nylon 66 libera algunos
compuestos que pueden interferir posteriormente en el análisis
de los solutos de interés. Si la membrana se trata previamente
coino se indicó en la parte de ((materiales y métodos» se evitan
estos problemas de contaminación. La adición del ácido se reali-
za en el matraz kitazato que contiene la muestra y los disolventes
de enjuague; el pequeíío contenido de metano1 en esta mezcla
permite reducir drásticamente la tendencia de los solutos
moleculares a adsorberse en las paredes del recipiente.
Los resultados de recuperación de los solutos, reportados
posteriormente, demuestran que con las precauciones mencio-
nadas se puede evitar totalmente la pérdida de analitos durante
el tratamiento inicial de la muestra.
Análisis cromatográfico
Los ácidos 2,4-D y 2,4-DB difieren muclio en hidrofobicidad y
por lo tanto en retención sobre una columna de fase reversa.
Adicionalmente, el soluto más hidrofóbico (2,4-DB) es también
el ácido más débil, por lo que no es posible lograr disminuir la
diferencia en retención de los dos analitos mediante ajustes del
pH de la fase móvil. Por otra parte, es bien sabido que en el
análisis de aguas naturales siempre se obtiene al inicio del
cromatograma un gran ((pico de matriz» que desciende lenta-
mente a la línea base y puede interferir en la determinación de los
solutos si estos eluyen a tiempos de retención muy cortos. Con-
siderando lo anterior, para obtener picos estrechos y simétricos
y controlar adecuadamente los tiempos de elución de los solutos,
fue necesario realizar la separación cromatográfica con un
gradiente de elución. El programa de gradiente propuesto en la
parte experimental inicia con un eluyente relativamente débil y
una pendiente de gradiente pequeña para eluir al ((pico de ma-
triz» y retardar al 2,4-D; a los 20 minutos la pendiente aumenta
rápidamente por un minuto y luego se mantiene una composi-
ción casi constante lo que permite eluir al 2,4-DB y evitar la
interferencia de los ((picos fantasma)) o ((picos de gradiente)),
que se obse~an
comúnmenteal final de los cromatogramas cuan-
do hay cambios bruscos en la composición del eluyente. En la
figura
4 se muestra la forma del gradiente usado y la separación
obtenida al inyectar un estándar de los ácidos clorofenoxi.
La inyección de los estándares siempre se debe hacer con la
precolumna
AX
acoplada a la columna analítica, para tener con-
diciones idénticas a las del análisis de las muestras. Sin embar-
go, el acoplamiento de dos fases estacionarias diferentes con
mecanismos de retención también distintos, puede provocar la
deformación y el ensanchamiento de los picos. En este trabajo lo
anterior se evitó con el gradiente de elución diseñado y aííadien-
do percloratos a las fases móviles. El efecto del perclorato se
atribuye a la fuerte afinidad de este ion por los intercambiadores
de aniones, lo que permite desplazar más fácilmente a los solutos
de este soporte disminuyendo el coleo y evitando el desdobla-
miento de los picos.
Los ácidos clorofenoxi presentan máximos de absorción en el
100
--
80
--
70
--
60-
-
G
40--
I I 1
1
1
I*
O 1 0 2 0 3 0 4 # 0 ( m i n )
Fig. 4. Separación cromatográfica (S) y gradiente de elución
(G)
Solutos: (1) 2,4-D, (2) 2,4-DB; gradiente empleado: fase móvil B, O min
=
O%, 5 mili
=
5% 20 min
=
350/ó, 2 1 min
=
40% y 40 min
=
45%;
velocidad de flujo 1 mllmin; columna analítica y precolumna de intercambio de aniones acopladas; detección a 280 nm; estándar conteniendo 3.36
mgll de cada herbicida; volumen inyectado 22 p1
L. E. Vera-Ávila
el
al
UV
a 230 y 280
nm
con una relación 9: 1 en el coeficiente de
extinción molecular entre estas dos longitudes de onda (Betti et
al. 1990). En este trabajo se optó por seleccionar la longitud de
onda de 280 nm por dos razones: para tener una detección más
selectiva y para que la deriva de la línea base debida al gradiente
fuera menor y con ello tener mayor precisión en la integración de
los picos.
Operaciones en línea y certificación del método
La sensibilidad del método depende en gran medida del volu-
men de muestra cargado en la precolumna de extracción y con-
centración (precolumna RP). Este volumen depende a su vez de
la solvofobicidad de los analitos en la muestra preparada; entre
más grande es la solvofobicidad, mayor es la retención en la fase
reversa polimérica y también es mayor el volumen de muestra
que puede cargarse sin que se fuguen los compuestos de interés
de la precolumna. Los estudios preliminares realizados con una
disolución de 2,4-D en agua grado reactivo acidificada a pH 1
mostraron que es posible cargar hasta 200 m1 sin que hayapérdi-
da del soluto. Sin embargo, al añadir un poco de metanol a la
muestra y agregar otros compuestos se observó una disminu-
ción notable del volumen de fuga del 2,4-D. Dado que las mues-
tras de aguas superficiales y subterráneas contienen general-
mente altas concentraciones de compuestos orgánicos diversos
y, además, durante su tratamiento previo es necesario afiadir
metanol,
se
optó por limitar el volumen de carga a 75
mí.
Con esta
condición no se tuvo evidencia de fuga de los solutos en ningu-
na de las muestras analizadas posteriormente.
El paso de transferencia de los analitos de la precolumna RP a
la precolumna
AX
es el más delicado y dificil de optimizar. El
volumen y la fuerza del disolvente utilizado para la transferencia
deben ser adecuados para desorber los solutos de la primera
precolumna sin provocar su fuga de la segunda. Al mismo tiem-
po, estos parámetros deben de ser suficientemente pequefios
para no comprometer la selectividad del método al transferir otros
compuestos interferentes que hayan quedado atrapados en la
primera precolumna. Considerando que la retención en la
precolumna
AX
es debida a interacciones eléctricas de los solutos
ionizados y a efectos hidrofóbicos, mientras que la retención en
la precolumna
RP
es debida sólo a estos últimos, se ensayaron
diversos volúmenes de mezclas acetonitrilo-NaOH (pH 10) en
diferentes proporciones para la transferencia. De las condicio-
nes probadas se seleccionó aquella que permitió obtener los
resultados deseados con el mínimo volumen de mezcla (6
mí)
y la
menor proporción (10%) de acetonitrilo.
La optimización de condiciones en cada paso del método
se realizó utilizando el montaje completo (Fig. 1 ) y
monitoreando en cada ensayo el porcentaje de recuperación
de los solutos. Éste se determinó por comparación de las áreas
de los picos obtenidos al analizar una muestra con las condi-
ciones del ensayo y los logrados por inyección directa de una
cantidad conocida de los solutos. La cantidad inyectada se
calculó multiplicando el volumen de inyección por la concen-
tración de los solutos en el estándar, por lo que se requirió
calibrar previamente el inyector. El porcentaje de recupera-
ción
(%
R) para cada soluto se calcula mediante la relación
siguiente:
%
R
=
(Am
x Qs x 100)/(As x Qm)
(1)
donde, Ames el
área
del pico del soluto en la muestra analizada,
As
es el
área
del pico del soluto obtenido al inyectar el estándar, Qm es
la cantidad de soluto teóricamente presente en el volumen de mues-
tra analizado (volumen cargado en la precolumna RP) y
Qs
es la
cantidad de soluto inyectado. Para una mayor precisión en la deter-
minación de
%
R,
la cantidad inyectada
debe
ser similar a la cantidad
teóricamente analizada, por lo que para cada ensayo
se
debe inyec-
tar un estándar de concentración apropiada con respecto a la con-
centración y el volumen de carga de la muestra a analizar.
Los resultados de la evaluación del método finalmente esta-
blecido se reportan en las tablas
y
IíI.
La tabla
11
muestra la
exactitud y la precisión del método, medidas como recuperación
de los solutos y desviación estándar relativa de recuperación,
obtenidas por el análisis de siete réplicas de agua grado reactivo
fortificada a 4.67 pg/l de cada herbicida. A un nivel de incerti-
dumbre del S%, la recuperación de los dos solutos es
estadísticamente igual al 100%. La precisión obtenida, inferior al
3%, es excelente para el nivel de concentración estudiado.
TABLA 11.
EXACTITUD
Y
PRECISI~N UNINIVEL DEL MÉTODO.
LIMITE DE DETECCIÓN
Compuesto
R
DER
LDM
(N)
(?'o)
(~~11)
2,4-D
100.5
2.2
0.3
2,4-DB
101.6
2.5
0.4
Número de réplicas: 7
Concentación de solutos: 4.67 pgll
R: recuperación, DER: desviación estándar relativa de la recuperación
LDM: limite de detección del método
La linealidad y la exactitud multinivel del método
se
evaluaron
por el análisis de 9 muestras de agua grado reactivo fortificadas a
diferentes concentraciones de los analitos, en el intervalo de 0.5 a
80 pg/l. Para los dos solutos, la relación Respuesta vs. Concentra-
ción presentó una tendencia lineal con un coeficiente de correla-
ción de 0.998 y una ordenada al origen estadísticamente igual a
cero. La tabla III presenta los resultados de estos experimentos
como relaciones de Cantidad Recuperada vs. Cantidad Teórica-
mente Analizada. A un nivel de incertidumbre del 5% la ordenada
al origen de las rectas que representan esta relación es igual a cero
y la pendiente igual a uno. Esto significa que, con las muestras de
agua grado reactivo fortificadas, el método no presenta eviden-
cias de errores sistemáticos y las recuperaciones del 2,4-D y 2,4-
DB son del 100% en el intervalo de concentraciones estudiado.
TABLA III.
EXACTITUD MULTINIVEL DEL MÉTODO (CANTIDAD
RECUPERADA
vs
CANTIDAD TE~RICAMENTE ANA-
LIZADA)
Compuesto
00
Pendiente
r
Intervalo
(M?
0%)
2,4-D
0.037
1.013
0.9994
0.037-7.466
2,4-DB
0.006
1.012
0.9998
0.037-7.466
Número de muestras analizadas: 9
00:
ordenada al origen, r: coeficiente de correlación
DETERMINACION DE 2.4-D Y 2.4-DB
EN
AGUA
Para evaluar el límite de detección del método (LDM) se utili-
zó el procedimiento recoinendado por la USEPA (Keith 1991).
Dicho procediiniento se basa en el análisis de al inenos 7 mues-
tras idénticas, fortificadas a una concentración de analito cerca-
na al Iíinite de detección esperado. El límite de detección del
inétodo se estiina a partir de la ecuación:
donde, S es la desviacióii estándar de los valores de concentra-
ción obtenidos (pgll) y t(n-l,a=0.99)
es el valor de la t de Student
para un nivel de confianza del 99% y n-1 grados de libertad,
siendo n el número de réplicas. La
tabla
il
muestra los limites de
detección del método obtenidos utilizando los datos del análisis
de las 7 réplicas fortificadas a 4.67 pg~l.
Estos resultados mues-
tran la gran sensibilidad del método que pennite determinar ron
certeza concentraciones inferiores a una parte por billón (1 pgA)
Fig. 5.
Cromatogramas del análisis de agua de pozo. A: blanco de agua
grado reactivo, B: blanco de agua de pozo, C: agua de pozo fortifi-
cada a 2
pg/l
de cada herbicida. Soliitos: (1) 2,4-D, (2) 2,4-DB.
b
iii
?O
(min)
Fig. 6.
Cromatogramas del análisis de agua de río. A: blanco de agua grado
readivo, B: blanco de agua de no, C: agua de río fortificada a 4 pgll
de cada herbicida. Solutos: (1) 2.4-D, (2) 2,4-DB.
en aguas relativainente limpias, como el agua de beber o la de
grifo.
Análisis
de
aguas superficiales y subterráneas
La aplicabilidad del método para el análisis de matrices acuo-
sas más complejas se probó con una muestra de agua de pozo,
colectada en una zona agrícola cercana a la localidad de Texcoco,
Estado de México y con una muestra de agua de río de la misma
zona. Ambas aguas son utilizadas para riego.
Las
figuras
5 y
6
presentan los cromatogramas obtenidos al
analizar las muestras blanco, las misnias muestras dopadas a 2
pg/i (agua de pozo) y 4 pgA (agua de no) y, por comparación, un
blanco de agua grado reactivo analizada bajo las mismas condi-
ciones. Aunque los cromatogramas de las muestras blanco pre-
sentan varias seííales, ninguna de ellas corresponde a los herbi-
cidas estudiados, lo que se corrobora al comparar con los
cromatogramas de las muestras fortificadas. Por tanto, se dedu-
ce que el 2,4-D y el 2,4-DB no están presentes, en cantidades
70
L.
E. vera-Ávila
et
al.
detectables? en el agua de pozo ni en la de río. No obstante, los
resultados del análisis de.las muestras foríificadas (Tabla
IV)
permiten concluir que en este tipo de matrices acuosas sería
posible determinar con exactitud bajas concentraciones de los
herbicidas. De hecho, el límite de detección del método en estas
aguas, estimado con base en el ruido de fondo, es de alrededor
de 1 pgll para ambos herbicidas.
TABLA IV.
ANÁLISIS DE AGUA DE POZO Y AGUA DE RIO
Compuesto
Agua de pozo
Agua de no
2,4-DB
99.8
99.5
Agua de pozo fortificada a 2 pg/l de cada herbicida
Agua de rio fortificada a 4 &¡de
cada herbicida
R: recuperación
En la tabla V se comparan las recuperaciones y los límites de
detección del método desarrollado con algunos resultados, des-
critos en la literatura, que fueron obtenidos utilizando otros mé-
todos.
TABLA V.
DETERMINACIÓN
DE
2,4-D Y 2,4-DB EN MUESTRAS DE
AGUA. CO~IPARACIÓN
DE RESULTADOS
Compuesto
Muestra
R
LDM
Referencia
(método)
(O/')
(~gfl)
2,4-D
Aguaderío
80
1
Ohno y Aoyama
(EFS diferido)
1992
2,4-D
Agua de río
92
Wells y Michael
(EFS diferido)
1987
2,4-D
Agua pura
80
10
Hoke
et
al.
1986
(EFS diferido)
2,4-D
Agua de río
74-82
0.05
Chiron et al. 1994
(EFS en linea)
2,4-D
Agua de rio
103
Hama~
y Kcttrup
2,4-DB
1 O0
1987
2,4-D
Agua de río
>85
0.03-0.1
Geerdink
er
al
2,4-DB
(EFS en linea)
1991
2,4-D
Agua pura
101
1 O
Betti
et
al.
1990
2,4-DB
(EFS diferido)
99
50
2,4-D
Agua pura
93
0.91
Keith 1991
2,4-DB
(ELL)
75
1.2
(Método 81 50
USEPA)
2.4-D
Agua pura
100
0.3
Este
2,4-DB
(EFS en línea)
10 1
0.4
trabajo
2,4-D
Agua de pozo
99-102
1
Este
2,4-DB
y no
99-100
1
trabajo
(EFS en linea)
ELL: extracción liquido-iquido. EFS: extracción en fase sólida.
R: reciiperación. LDhl: límite de detección del metodo
do la manipulación de la muestra es mínima, lo que reduce los
riesgos para el analista y las posibilidades de contaminación de
la muestra o pérdida de los analitos durante el proceso.
Adicionalmente, el método resulta bastante econóinico para los
análisis de rutina ya que no requiere del consuino de grandes
volúmenes de disolventes orgánicos de alta pureza y las
precolumnas utilizadas en la preparación de la muestra son
regenerables, muy durables y, eventualmente, pueden
reempacarse con alrededor de 30 miligramos de los adsorbentes.
La calidad de los resultados obtenidos por este inétodo, en lo
que se refiere a exactitud, precisión y límites de detección, se
compara favorablemente con la mayoría de los métodos reporta-
dos para la determinación de 2,4-D y 2.4-DB en agua.
Para el desarrollo de este trabajo se contó con el apoyo finan-
cierode la Dirección General de Asuntos del Personal Académi-
co, Universidad Nacional Autónoma de México y del Consejo
Nacional de Ciencia y Tecnología de México.
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