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Red de Revistas Científicas de América Latina y el Caribe, España y Portugal
BIODEGRADACIÓN DE ASFALTENOS POR UN CONSORCIO MICROBIANO
AISLADO DE PETRÓLEO CRUDO “MAYA”
Gabriel PINEDA-FLORES
1
, Gisella BOLL-ARGÜELLO
1
y Ana María MESTA-HOWARD
2
Laboratorios de
1
Ecología Microbiana y
2
Microbiología General, Departamento de Microbiología, Escuela Nacional de
Ciencias Biológicas, IPN. Prol. Carpio y Plan de Ayala s/n, Apartado Postal CON-174, México D.F. 06400, México.
Correo electrónico pifloga@hotmail.com
(Recibido agosto 2001, aceptado enero 2002)
Palabras clave: asfaltenos, consorcio microbiano, mineralización, oxidación, petróleo
RESUMEN
Los asfaltenos son hidrocarburos del petróleo que provocan la contaminación de los ecosistemas
al derramarse el petróleo de manera accidental o inducida, y ocasionan una serie de problemas
relacionados con la extracción y el transporte del petróleo crudo. La eliminación de los asfaltenos
por biodegradación es un proceso efectivo que puede reducir los problemas que causan, espe-
cialmente cuando se involucra la actividad metabólica de microorganismos autóctonos de los
pozos petroleros, que están en contacto permanente con este tipo de compuestos. Para apoyar
lo anterior, el objetivo del presente trabajo consistió en determinar la oxidación y la mineralización
de asfaltenos, por un consorcio microbiano aislado de petróleo “Maya” al utilizar asfaltenos
como única fuente de carbono y energía. El consorcio microbiano se aisló de una muestra de
crudo y se estabilizó su crecimiento en un reactor de columna con asfaltenos como fuente de
carbono y energía, posteriormente se utilizó como inóculo para evaluar por triplicado en siste-
mas independientes, el consumo de oxígeno (técnica de Winkler) y la producción de dióxido de
carbono (método ISO9439) con 0.1 % de asfaltenos durante 20 y 13 días respectivamente. El
crecimiento del consorcio se estabilizó en 1x10
6
UFC mL
-1
(+/- 10 %) durante tres semanas de
incubación. El consumo de oxígeno y la producción de dióxido de carbono fueron
significativamente mayores (100 % en 15 días y 800 ìmol CO
2
, respectivamente) cuando el
consorcio
estuvo en contacto con los asfaltenos. Los procesos de oxidación y mineralización
realizados por el consorcio microbiano estabilizado son procesos fundamentales para reducir y
eliminar a los asfaltenos de los ecosistemas afectados por estos compuestos.
Key words: asphaltenes, microbial consortium, mineralization, oxidation, petroleum
ABSTRACT
Asphaltenes are hydrocarbons that pollute ecosystems by either accidental or intentional oil
spills, and cause a number of problems related to the extraction and transportation of crude.
Biodegradation–mediated elimination of asphaltenes is an effective process that might reduce
these problems. This process could be favored by the metabolic activity of microorganisms
naturally found in
petroleum wells as they are permanently exposed to this kind of compounds.
In order to support this statement,
the objective of the research was to determine both oxidation
and mineralizing of asphaltenes by a microbial consortium isolated from “Maya” petroleum,
using asphaltenes as the only source of carbon and energy. The microbial consortium was
isolated from a crude sample, and its growth was stabilized in a column reactor with asphaltenes
as source of carbon and energy. Afterwards, it was used as inoculum to carry out triple evaluation
both oxygen consumption (Winkler’s technique) and carbon dioxide production (ISO9439 method)
Rev. Int. Contam. Ambient.
18
(2) 67-73, 2002
G. Pineda-Flores
et al.
68
in separate systems with 0.1 % asphaltenes during 20 and 13 days respectively. Growth of the
consortium was stabilized at 1x10
6
UFCmL
-1
(± 10 %) during 3-week inoculation period. Oxygen
consumption and carbon dioxide production were significantly greater (100 % at day 15 and 800
µ
mol CO
2
, respectively), when the consortium was exposed to asphaltenes. The oxidation and
mineralizing processes carried out by the stabilized microbial consortium are fundamental to
reduce and eliminate asphaltenes from the affected ecosystems.
INTRODUCCIÓN
Los asfaltenos son un grupo de hidrocarburos del pe-
tróleo que contienen diferentes proporciones de nitróge-
no, azufre y oxígeno (Mitra-Kirtley
et al.
1993). Estos
compuestos presentan una M
r
de 600 a 2,000,000 y una
estructura molecular extremadamente compleja, confor-
mada por diferentes estructuras aromáticas, alicíclicas y
heterocíclicas unidas por cadenas de hidrocarburos
alifáticos de longitud variable (Kawanaka
et al.
1989,
Murgich
et al.
1999, Strausz
et al.
1999).
Los asfaltenos causan diversos problemas relaciona-
dos con la extracción, el transporte y el procesamiento
del petróleo, debido a que se incrustan en los espacios
porosos del yacimiento y en las paredes de las tuberías
de extracción y transporte, dificultando su libre movimiento
(Kaminski
et al.
2000, Wu
et al.
2000), además cuando
un crudo presenta concentración elevada de estos com-
puestos, aumentan
los costos para su refinación y dismi-
nuye su aprovechamiento económico en general (Rogel
1997, Shirokoff
et al.
1997). Por otra parte, la compleja
estructura molecular que poseen los asfaltenos ocasiona
que sean sumamente resistentes a la degradación micro-
biana lo que provoca su acumulación en los ecosistemas
donde se derraman el petróleo y los productos de
refinación de manera accidental o inducida (Atlas 1981,
Guiliano
et al.
2000).
Los microorganismos que han estado en
contacto
con los asfaltenos durante largos períodos de tiempo, po-
drían llevar a cabo procesos de biodegradación de estos
compuestos, tal es el caso de los microorganismos que
se desarrollan en los pozos petroleros (Premuzic y Lin
1999). Al poner en contacto a estos microorganismos
con asfaltenos como única fuente de carbono y energía,
expresarían su capacidad para oxidarlos y mineralizarlos
ya que estos compuestos contienen los elementos quími-
cos necesarios para el desarrollo de cualquier microor-
ganismo, como carbono, nitrógeno, azufre y oxígeno, sin
embargo presentan baja disponibilidad ya que se encuen-
tran incluidos en una compleja estructura molecular de
anillos aromáticos y alicíclicos, además su solubilidad en
agua es muy reducida (Nishijima
et al.
1997).
Es posible la biodegradación de asfaltenos mediante
el uso de consorcios microbianos aislados de suelo y de
sedimentos contaminados con hidrocarburos, en propor-
ciones reducidas de 0.55 a 35 % (Venkateswaran
et al.
1995, Thouand
et al.
1999). Sin embargo, no se ha eva-
luado la biodegradación de estos hidrocarburos empleando
consorcios microbianos aislados de petróleo, los cuales
podrían reducir o eliminar en una mayor proporción
este
tipo de compuestos. En consecuencia, el principal objeti-
vo de este trabajo se centró en evaluar la oxidación y la
mineralización de asfaltenos por un consorcio microbiano
aislado de un pozo petrolero.
MATERIALES Y MÉTODOS
Extracción de asfaltenos
Se utilizó una muestra de 4 L de petróleo crudo tipo
“Maya” obtenida del pozo Blasillo-61, localizado en el
estado de Veracruz, México. El pozo posee una profun-
didad total de 3323 m, temperatura de fondo 60
°
C, su-
perficial 20
°
C y salinidad de 180,000 ppm.
Los asfaltenos contenidos en la muestra se extraje-
ron por precipitación con n-heptano (Sigma ACS) en
proporción de 50:1 (n-heptano/muestra). La mezcla se
mantuvo en agitación con barra magnética por 18 h, pos-
teriormente se filtró al vacío empleando papel Whatman
No. 42. Los asfaltenos precipitados se separaron del papel
y se transfirieron a una cápsula de porcelana para secar-
los en horno a 70
°
C durante 12 h (British Standard 1971).
A continuación se colocaron en
recipientes color ambar
y estériles, para su uso posterior.
Determinación del mejor medio de cultivo mineral
para el crecimiento del consorcio
Se probaron los medios de cultivo ISO9493, DHC y
M-9, su composición se muestra en la
tabla I
. Para de-
terminar el mejor medio de cultivo se realizaron cinéticas
de crecimiento de los microorganismos presentes en una
muestra de petróleo crudo, utilizando tres series de tres
matraces Erlenmeyer de 250 mL con 100 mL de medio
de cultivo mineral a probar en cada uno. Se inocularon
con 1% (v/v) de petróleo y se incubaron a 55
°
C (tempe-
ratura aproximada a la del fondo del pozo Blasillo-61). El
crecimiento de los microorganismos se determinó por
cuenta viable en cajas Petri con agar Casoy (Merck 5458)
aplicando la técnica de dispersión del inóculo (0.2 ml)
con varilla de vidrio estéril cada 48 h durante 16 días.
Las cajas se incubaron a 37
°
C durante 48 h, posterior-
mente se contó el número de colonias presentes.
BIODEGRADACIÓN DE ASFALTENOS POR UN CONSORCIO MICROBIANO
69
El mejor medio de cultivo fue el que contuvo el mayor
número de microorganismos y diferente estadísticamente
a los otros empleados.
Estabilización del crecimiento del consorcio
microbiano
Se utilizó un reactor de columna de vidrio Pyrex de
12 cm de diámetro por 73 cm de alto, que contenía esco-
ria volcánica de 10.7 mm de diámetro como material de
soporte hasta ¾ partes de su capacidad (esterilizado por
calor húmedo a 1.02 kg cm
-2
durante 30 min), 2.4 L de
medio de cultivo mineral ISO9439 (ISO 1990) (esterili-
zado a 1.02 kg cm
-2
durante 15 min) más 1 % de
asfaltenos (p/v) como única fuente de carbono y ener-
gía.
El reactor se inoculó con los microorganismos pre-
sentes en una muestra de 1 % de crudo del pozo men-
cionado (v/v) y se mantuvo con aireación estéril cons-
tante de 1 L min
-1
, temperatura de 25
°
C, pH de 7.4 y
salinidad de 100 ppm durante 56 días. Para determinar
la estabilidad del consorcio se evaluó su crecimiento
cada dos días de la manera descrita en la determina-
ción del mejor medio de cultivo. Se realizaron tres re-
peticiones por muestreo.
Cuantificación de la oxidación de asfaltenos
Este proceso se determinó en cuatro sistemas de cinco
botellas de vidrio de 150 mL con tapón esmerilado. Los
sistemas evaluados fueron (todos más medio mineral):
consorcio estabilizado (0.1 % v/v), asfaltenos (0.1 % p/v)
y consorcio estabilizado (0.1 % v/v) más asfaltenos (0.1%
p/v). Se mantuvieron a 20
°
C en la oscuridad y el consu-
mo de oxígeno disuelto se determinó con la técnica de
Winkler al tiempo inicial y a los 5, 10, 15 y 20 días (Hanson
1973) y se comparó con un testigo que contenía medio
de cultivo mineral exclusivamente (blanco) que se man-
tuvo en las mismas condiciones. Se realizaron tres repe-
ticiones por cada sistema evaluado, incluyendo al testigo.
Determinación de la mineralización de asfaltenos
Se utilizaron reactores de columna de vidrio Pyrex de
3.2 cm de diámetro por 20 cm de alto, los cuales conte-
nían 60 mL de medio mineral ISO9439 además del mis-
mo material de soporte y en la misma proporción que el
reactor empleado para la estabilización.
Los sistemas evaluados fueron los mismos que para
la cuantificación de la oxidación de asfaltenos, las condi-
ciones de incubación fueron las mismas mantenidas du-
rante la estabilización del consorcio.
Para determinar la mineralización se midió la produc-
ción de CO
2
en cada sistema diariamente durante 13 días,
utilizando el dispositivo
ISO9439 (ISO 1990), que consta
de una botella-trampa para capturar CO
2
atmosférico
(100 mL NaOH 1M), botella indicadora del funciona-
miento de la trampa (100 mL KOH 0.1M), reactor y dos
sistemas de captación de CO
2
producido por
mineralización (cada uno con 100 mL KOH 0.1M). To-
das las partes del dispositivo están conectadas por tube-
ría de vidrio y de hule latex de 0.5 cm de diámetro.
El CO
2
producido por mineralización se cuantificó por
titulación con HCl 0.1M de alícuotas de 10 mL de la
solución de KOH 0.1M
más 40 mL de agua destilada.
Se adicionó 2 mL de BaCl
2
más cinco gotas de indicador
de fenolftaleína. El gasto obtenido se sustituyó en la si-
guiente fórmula:
µ
mol CO
2
=
[
(B-P) x M
HCl
x 1000
]
/2
En donde:
µ
mol CO
2
= micromoles de CO
2
producidos
B = gasto del sistema blanco (medio mineral)
P = gasto del problema
M
HCl
= molaridad del HCl
Análisis estadístico
Para determinar las diferencias significativas entre
los sistemas evaluados, se hicieron análisis de varianza
(ANOVA) a los datos obtenidos en los diferentes experi-
mentos, empleando el programa GLIM 3.77. Para los
datos de determinación del mejor medio de cultivo y de
estabilización se aplicó un ajuste logarítmico y se
compararon las UFC mL
-1
de cada tipo de medio de cultivo
y muestreo, respectivamente. Para los datos de oxidación
y mineralización se utilizó un ajuste normal y se
compararon los diferentes sistemas evaluados.
RESULTADOS
Al observar las cinéticas de crecimiento de los
microorganismos presentes en el crudo en los diferentes
medios de cultivo (
Fig. 1
), se aprecia que el número de
UFC mL
-1
que se desarrollaron a 55
°
C fue reducido
(entre 10 y 150 UFC mL
-1
) y no aumentó hasta después
Compuesto
Concentración (g L
-1
)
ISO 9439
DHC
M-9
KH
2
PO
4
0.085
5.7
3.0
K
2
HPO
4
0.21
2.3
-
Na
2
HPO
4
·2H
2
O
0.33
-
6.0
NH
4
Cl
0.005
-
1.0
MgSO
4
·7H
2
O
0.0225
2.25
0.49
CaCl
2
0.0275
-
0.011
FeCl
3
·6H
2
O
2.5x10
-3
--
(NH
4
)
2
SO
4
-
7.0
-
NH
4
Cl
0.005
-
1.0
NaCl
-
-
0.5
TABLA I.
COMPOSICIÓN QUÍMICA DE LOS MEDIOS DE
CULTIVO EMPLEADOS
- compuesto ausente
G. Pineda-Flores
et al.
70
de 10 días de incubación.
Al final del tiempo de desarrollo de las cinéticas se
encontró el crecimiento más abundante con el medio
ISO9439 y posteriormente con el DHC. El medio M-9
no favoreció el crecimiento de los microorganismos.
Durante las evaluaciones de microorganismos en la
estabilización, se observó que el consorcio está integrado
por cuatro cepas bacterianas, identificadas como
Corynebacterium
sp.,
Bacillus pumilus
,
Brevibacillus
brevis
y
Staphylococcus
sp. (identificadas por pruebas
bioquímicas, los resultados no se muestran) y su creci-
miento con asfaltenos como única fuente de carbono y
energía, aumentó notablemente durante las dos primeras
semanas de incubación (
Fig. 2
), después el número de
microorganismos disminuyó hasta mantenerse en
aproximadamente 1x10
6
UFC/mL a partir del día 20
de
desarrollo de la cinética, posteriormente las variaciones
no fueron significativas, de acuerdo con
el ANOVA
(los datos no se muestran) y se observó cualitativamente
la presencia constante
de las cuatro cepas identificadas.
El consumo de oxígeno del sistema consorcio más
asfaltenos es notablemente mayor comparado con los
otros sistemas (
Fig. 3
) y alcanzó un valor máximo a
partir del día 15. El consumo de oxígeno del sistema
que contenía asfaltenos exclusivamente también presentó
disminución importante, sin embargo es significativamen-
te menor que el sistema consorcio más asfaltenos. Los
sistemas blanco y consorcio no presentaron diferencias
significativas entre sí (
Tabla II
).
Con respecto a la mineralización, la mayor
producción de CO
2
fue cuando estuvieron en contacto
el consorcio microbiano más los asfaltenos y fue en
aumento conforme transcurrió el tiempo (
Fig. 4
), en
los otros dos sistemas evaluados la producción de CO
2
fue muy reducida y diferente significativamente
comparada con el sistema consorcio-asfaltenos (
Tabla
II
). El ligero aumento en la producción de CO
2
mostrado
al final de la cinética en el sistema que contenía exclusi-
vamente asfaltenos no fue signficativo.
DISCUSIÓN
De acuerdo con la
figura 1
es posible considerar que
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
0
2
4
6
8
10
12
14
16
días
16
14
12
10
8
6
4
2
0
Días
ISO9439
DHC
M-
9
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
Log UFC ml
-1
ig. 1
.
Cinéticas de crecimiento del consorcio aislado de petróleo en
tres diferentes medios de cultivo
0
2
4
6
8
10
12
0
4
8
12
16
20
24
28
32
36
40
44
48
52
56
Días
Lo
g
UF
C
ml
-1
Adición de
asfaltenos
Adición de medio de
cultivo
mineral
Días
56
52
48
44
40
36
32
28
24
20
16
12
8
4
0
0
2
4
6
8
10
12
Log UFC ml
-1
Adición de asfaltenos
Adición de medio de
cultivo mineral nuevo
Fig. 2
. Estabilización del crecimiento del consorcio microbiano con
asfaltenos como única fuente de carbono y energía en reactor
de columna de vidrio
Fig. 3
. Consumo de oxígeno por el consorcio estabilizado al utilizar
asfaltenos como única fuente de carbono y energía
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0
5
10
15
20
Ox
íg
en
o
di
su
elt
o
(m
g
-1
)
Asfaltenos más consorcio
Asfaltenos
Blanco
Consorcio
Días
0
5
10
15
20
Asfalteno más consorcio
Asfalteno
Blanco
Consorcio
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Oxígeno disuelto (mg L
-1
)
BIODEGRADACIÓN DE ASFALTENOS POR UN CONSORCIO MICROBIANO
71
el medio de cultivo mineral ISO9439 es el que permite el
crecimiento más abundante del consorcio y el efecto de
este medio es estadísticamente diferente a los otros dos
empleados (los datos no se muestran), por tal motivo se
le utilizó para estabilizar al consorcio en el reactor de
columna de vidrio.
Debido al reducido número de microorganismos que
se observaron a temperatura similar a la del fondo del
pozo Blasillo-61, se optó por cambiar la temperatura de
incubación para la estabilización del consorcio a 25
o
C, la
cual favorecería el crecimiento al ser una temperatura
menor y más parecida a la superficial del pozo (20
o
C).
Para poder evaluar la biodegradación de los asfaltenos
es muy importante obtener microorganismos que sean
capaces de utilizar estos compuestos como única fuente
de carbono y energía, además de que su crecimiento se
mantenga a lo largo del tiempo (Sukesan y Watwood 1998,
Kanaly y Harayama 2000), ya que se favorece la rapidez
con la cual puede ser biodegradado un compuesto
orgánico (Leahy y Colwell 1990). El crecimiento del
consorcio microbiano aislado de petróleo fue abundante
y se consideró estabilizado a partir del día 20, ya que no
se presentaron diferencias significativas entre el número
de microorganismos presentes y cualitativamente se
observaron los mismos géneros bacterianos, de esta
manera se dispone de un consorcio microbiano adaptado
a utilizar asfaltenos como única fuente de carbono y
energía.
Se ha demostrado que los asfaltenos pueden oxidarse
por la actividad metabólica de microorganismos, produ-
ciendo estructuras con grupos ceto e hidroxilo después
de diez días de incubación (Rontani
et al.
1985),
estructuras que también pueden presentarse en el sistema
que contenía al consorcio estabilizado más asfaltenos.
La oxidación observada como consumo de oxígeno en
ausencia de microorganismos puede explicarse en función
de la composición química de los asfaltenos, que presentan
diversos átomos de azufre y nitrógeno, susceptibles de
reaccionar con el oxígeno disuelto en el medio mineral
(F. Vázquez-Dávila, comunicación personal). Este
proceso de oxidación se favorece cuando los grupos con
nitrógeno y azufre se encuentran expuestos en las
moléculas de asfaltenos, ya que carecen de la estructura
micelar que normalmente los cubre al estar en contacto
con el resto de los hidrocarburos del petróleo (Acevedo
et al.
1999, Premuzic
et al.
1999). La estructura micelar
de los asfaltenos empleados fue eliminada con n-heptano
al ser extraídos de la muestra de crudo. Es importante
señalar que los métodos donde se evalúa el consumo de
oxígeno con la técnica de Winkler o empleando electrodos
específicos para oxígeno, se han aplicado para evaluar la
oxidación de petróleo crudo e hidrocarburos poliaromá-
ticos (Govind
et al.
1997), sin embargo estos métodos se
limitan a aportar información sobre el consumo de oxígeno
para oxidar parcialmente a los sustratos. Es necesario
aplicar otra técnica complementaria a la anterior para
evaluar de una forma más completa el proceso de
degradación de los asfaltenos, como lo es la cuantificación
de la producción de CO
2
ya que ésta permite evaluar la
mineralización del sustrato (Stringfellow y Aitken 1995).
La elevada producción de CO
2
por el consorcio
estabilizado al estar en contacto con asfaltenos sugiere
que estos compuestos son utilizados como fuente de
carbono y energía, en donde existen fracciones de la
molécula muy susceptibles de mineralizarse como son
0
200
400
600
800
1000
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
μm
ol
CO
2
Asfaltenos más consorcio
Asfaltenos
Consorcio
Días
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13
Asfaltenos más consorcio
Asfaltenos
Consorcio
0
200
400
600
800
1000
µ
mol CO
2
Sistemas
Consumo de oxígeno
Producción de CO
2
comparados
ANOVA
Resultado
ANOVA
Resultado
(t
0.05, 60
=2.0)
(t
0.05, 123
=1.98)
Consorcio más
7.45
S
NC
NC
asfaltenos vs.
blanco
Consorcio más
4.77
S
5.65
S
asfaltenos vs.
consorcio
Consorcio más
2.45
S
187.49
S
asfaltenos vs.
asfaltenos
Asfaltenos vs.
2.31
S
0.97
NS
consorcio
Blanco vs.
0.87
NS
NC
NC
consorcio
Blanco vs.
4.07
S
NC
NC
asfaltenos
TABLA II.
ANÁLISIS DE VARIANZA CALCULADO POR EX-
PERIMENTO
S=Diferencia significativa, NS=Diferencia no significativa, NC=Dato
no calculado
Fig. 4
. Producción acumulada de CO
2
por el consorcio microbiano
estabilizado al utilizar asfalteno como única fuente de carbo-
no y energía
G. Pineda-Flores
et al.
72
las cadenas alifáticas laterales, posteriormente las
estructuras aromáticas y en mucho menor grado las
estructuras policondensadas (Rontani
et al.
1985).
El consorcio microbiano estabilizado fue capaz de
realizar la oxidación y la mineralización de los asfaltenos
extraídos de petróleo, los cuales son mecanismos involu-
crados en la biodegradación de estos compuestos. La
oxidación y la mineralización
son procesos que pueden
ser de utilidad en la reducción de los asfaltenos en los
ecosistemas donde se acumulan y ocasionan problemas
de contaminación o en la extracción y procesamiento del
petróleo crudo. Por otro lado, estos procesos pueden ser
cuantificados
evaluando el consumo de oxígeno por la
técnica de Winkler y la producción de CO
2
aplicando el
dispositivo ISO 9439, procedimientos que además de
aportar resultados reproducibles son sencillos y
económicos.
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo es parte del proyecto Degradación de
Hidrocarburos de Alto Peso Molecular DEPI970520. El
primer autor está
muy reconocido al CONACyT por la
beca otorgada.
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