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Red de Revistas Científicas de América Latina y el Caribe, España y Portugal
Rev. Int. Contam. Ambient. 19 (2) 73-81, 2003
INMOVILIZACIÓN DE UNA PEROXIDASA DE CHAYOTE [
Sechium edule
(Jacq.) Sw] Y SU
POTENCIAL APLICACIÓN EN LA REMOCIÓN DE SUSTANCIAS FENÓLICAS
EN AGUAS CONTAMINADAS
María Lioba Osnelda VILLEGAS-ROSAS
1
, Gunther GEISSLER
1
,
Anabella HANDAL-SILVA
3
y Enrique GONZÁLEZ-VERGARA
2,3
1
Posgrado en Ciencias Ambientales,
2
Centro de Química,
3
Laboratorio de Investigaciones Biológicas. Instituto de
Ciencias
de la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla. 14 sur 6301, C.U., Jardines de San Manuel, Puebla 72570 Pue.,
México. Correo electrónico: ovillega
@
siu.buap.mx
(Recibido marzo 2002, aceptado mayo 2003)
Palabras clave: remoción, derivados fenólicos, aguas contaminadas, peroxidasas, inmovilización.
RESUMEN
Se presenta la inmovilización de una peroxidasa obtenida a partir de chayote [
Sechium edule
(Jacq.) Sw] en un soporte funcionalizado adecuadamente y con activación
previa, lo que impide
que la enzima
pierda sus propiedades catalíticas. También se realizaron estudios para demostrar
su potencial aplicación en la descontaminación de aguas artificialmente contaminadas con sus-
tancias fenólicas. Los resultados obtenidos muestran que una de las peroxidasas de chayote es
inmovilizada con éxito en el soporte orgánico poliestireno-divinilbenceno funcionalizado con
triglicina
y activado con 1,1’carbonildiimidazol hasta valores alrededor de 100 %, sin perder su
actividad de peroxidasa. El tratamiento de aguas artificialmente contaminadas con fenol, 2-
metoxifenol ó 3-clorofenol, sujetas a la formación de sus polímeros mediada por peroxidasa en
presencia de peróxido de hidrógeno, muestra que los porcentajes de remoción de estos contami-
nantes se encuentran entre
75 y 100 %, mientras que la eliminación de los polímeros, provenien-
tes de fenol y 2-metoxifenol están entre 65 y el 80 % en el mismo ensayo mediante filtración. Con
3-clorofenol
no se observó la formación de los polímeros y por lo tanto su efectividad no pudo
ser determinada y requiere de una investigación subsecuente. La peroxidasa de chayote puede
tener gran utilidad para la descontaminación de aguas con compuestos fenólicos en su forma
inmovilizada como aquí se describe.
Key words: removal, phenolic compounds, waste water, peroxidase, immobilization
ABSTRACT
Immobilization of a peroxidase from chayote [
Sechium edule
(Jacq.) Sw] using an adequately
functionalized and previously activated support which allows to preserve enzymatic activity is
here presented. Studies were also carried out to show its potential for decontamination of
artificial waste waters containing phenolic compounds. The peroxidase was successfully immo-
bilized onto the organic support polystyrene-divinylbenzene copolymer functionalized with
triglycine and activated with 1-1’carbonyldiimidazol with almost a 100% yield and with not
apparent loss of enzymatic activity. Artificially contaminated waters containing phenol, 2-
methoxyphenol or 3-chlorophenol, were subjected to peroxidase mediated polymer formation in
the presence of
hydrogen peroxide. The removal of
the contaminants are in the range from 75
to 100 %, while the removal percentages of polymers using filtration are in the range from 65 to 80
% in the case of phenol and 2-methoxyphenol, however, for 3-clorophenol this was not possible to
evaluate and needs further investigation. Thus, peroxidase from chayote could have a great
potential for decontamination of waste waters containing phenolics while immobilized onto an
insoluble organic support as here described.
M.L.O. Villegas-Rosas
et al.
74
INTRODUCCIÓN
El deterioro ambiental causado por el crecimiento in-
dustrial y urbano ha creado la necesidad de tratar el agua
para disminuir la concentración de contaminantes arro-
jados en ella. Para eliminar a los contaminantes es nece-
sario utilizar métodos que dependen en gran medida de
la calidad del agua que quiera tratarse y desee obtenerse.
Por otro lado, crear una conciencia del reuso del agua,
sería de gran beneficio a todas las personas. No es difícil
deducir, que si se logra reusar toda el agua que se utiliza,
sólo se requeríría un volumen mínimo de entrada de agua:
recircular una y otra vez el agua que empleamos, sería
suficiente
, de aquí la importancia de buscar métodos
alternativos para el tratamiento de aguas residuales, tan-
to de tipo municipal como industrial. Todos los esfuerzos
encaminados a la prevención del deterioro de la calidad
del agua en los cuerpos receptores y al empleo racional
de la misma, merecen ser impulsados y promovidos des-
de los aspectos económico, social, político y cultural.
Compuestos aromáticos como los fenoles están pre-
sentes en aguas residuales provenientes de un gran nú-
mero de industrias tales como: blanqueo de papel, refina-
miento del petróleo, resinas y plásticos, farmacéutica,
textil, etc. (Maloney
et al.
1984). Tales compuestos
hidroxiaromáticos pueden ser tóxicos cuando se encuen-
tran en altos niveles y se sabe o se sospecha que son
carcinogénicos (Kilbanov
et al.
1983, Milánd
et al
. 1996).
Además algunos derivados fenólicos tienen sabor y olor
desagradables en el agua para beber cuando están pre-
sentes a niveles de partes por billón (Wolkoff y Larose
1974, Buikerma
et al
. 1979). En la actualidad se están
desarrollando métodos enzimáticos muy prometedores
para la remoción de estos contaminantes, cuando no pue-
den ser eliminados por tratamientos biológicos o físicos,
mediante el uso de peroxidasas y peróxido de hidrógeno
(Klibanov
et al
. 1983, Al/Kassim
et al
. 1994, Bodzek
et
al
. 1994, Wada
et al
. 1995, Kinsley y Nicell 2000,
Masuda
et al
. 2001, Singh y Singh 2002, Villalobos y
Buchanan 2002, Villegas-Rosas
et al
. 2002).
Las enzimas inmovilizadas también han presentado
elevada eficiencia en la degradación de fenoles (Shewale
y Naik 1991, Ruckenstein y Wang 1994, Peralta-Zamora
et al
. 1997). Una de las grandes ventajas de inmovilizar
enzimas para el tratamiento de aguas residuales y en
otros procesos es que pueden recuperarse y reutilizarse,
situación que no se logra cuando la enzima es usada di-
rectamente en solución. De aquí la importancia de bus-
car soportes adecuados para inmovilizar las enzimas sin
que éstas pierdan sus propiedades catalíticas.
Aquí se presentan los estudios realizados para la in-
movilización de una peroxidasa obtenida a partir de cha-
yote [
Sechium edule
(Jacq.) Sw] en los soportes Baker-
bond Glutaraldehído-P
(J.T. Baker) y el soporte orgánico
poliestireno-divinilbenceno funcionalizado con triglicina
(PS/DVB-3G) (Gómez-Cárdenas
et al
. 2001), así co-
mo los estudios de remoción en este último, de los
contaminantes fenol, 2-metoxifenol y 3-clorofenol en
aguas residuales artificialmente preparadas.
Fueron determinadas las condiciones para obtener
porcentajes de inmovilización de alrededor del 100 % de
una de las peroxidasas de chayote en el soporte
poliestireno-divinilbenceno funcionalizado con triglicina,
mediante el uso de meta-mioglobina. Los estudios de-
mostraron que con la peroxidasa inmovilizada se logra
remover entre 75 y 100 % de los contaminantes analiza-
dos, abriendo la posibilidad de aplicar esta metodología a
otros derivados y contaminantes similares.
MATERIALES Y MÉTODOS
Selección del soporte para la inmovilización
Debido a que no existe un soporte universal para la
inmovilización de una enzima, éste tiene que ser selec-
cionado con base en algunas de sus características, como
tipo de enzima a inmovilizar y
proceso en que se desea
usar. Aquí se describe la utilización de Bakerbond
Glutaraldehído-P (J. T. Baker) como ejemplo de soporte
inorgánico y del poliestireno-divinilbenceno (PS/DVB) (al
2.0 % de divinilbenceno, con una malla de 200 a 400,
Polisciences, Inc.) como ejemplo de matriz orgánica in-
soluble en agua. Éste último fue modificado por incorpo-
ración del péptido glicilglicilglicina o triglicina (PS/DVB-
3G) (González-Vergara
et al
. 1996, Gómez-Cárdenas
et
al
. 2001, González-Vergara 2001), funcionalizando así la
matriz original con grupos carboxilo.
El soporte funcionalizado se activó con 1,1´-
carbonildiimidazol (CDI, SIGMA). Para esto se agrega-
ron 4 meq (0.646 g) del activador CDI disueltos en 5 mL
de acetona por cada gramo de resina funcionalizada a
activar. La reacción se llevó a cabo durante 2:30 h a 40
o
C en un rotavapor (marca Heidolph WB 2000), conclui-
do el tiempo de reacción, el soporte activado se lavó con
acetona.
Selección de una proteína reportera
Para estimar algunos parámetros que permitieran es-
tablecer las condiciones iniciales para la inmovilización
de la peroxidasa de chayote (POCh), se utilizó como pro-
teína reportera a la meta-mioglobina (m-Mb), con pro-
piedades espectroscópicas y catalíticas conocidas y de
bajo costo, capaz de iniciar con ésta la factibilidad de la
inmovilización de enzimas peroxidasas en ambos sopor-
tes. Para la obtención de la m-Mb, se partió de mioglobina,
extraída a partir de carne de res y posteriormente, me-
diante la adición de ferricianuro de potasio fue llevada a
su forma meta (Bylkas y Andersson 1997).
INMOVILIZACIÓN DE UNA PEROXIDASA Y SU APLICACIÓN EN AGUAS CONTAMINADAS
75
Estimación de los parámetros para la inmoviliza-
ción de m-Mb
Para estimar algunos parámetros iniciales como ve-
locidad de agitación (V, rpm), tiempo de reacción de in-
movilización (t, h), temperatura (T,
o
C), cantidad de so-
porte (mg), volumen del reactor (Vr) y volumen de la
solución de la proteína reportera, para la inmovilización
de la POCh, se llevaron a cabo diferentes experimentos
por triplicado utilizando m-Mb, inicialmente en el soporte
comercial Bakerbond Glutaraldehído-P (BBG-P) en reac-
tores de teflón colocados en un matraz de bola de 100 ml
y en un rotavapor.
Para determinar la concentración adecuada de m-Mb
se registraron los espectros de absorción ultravioleta-vi-
sible (UV-VIS) (espectrofotómetro UV-VIS-NIR,
Shimadzu UV-31000S) a diferentes diluciones de ésta
con amortiguador de fosfato de sodio 100 mM, pH 7.0.
También, fueron probados diferentes reactores en forma
y volumen considerando que iban a ser sometidos a agi-
tación y calentamiento a distintas temperaturas, además,
que las cantidades de soporte y de proteína reportera no
fueran muy grandes. La cantidad del soporte BBG-P fue
variada desde 50 a 100 mg.
Para estimar los valores de los parámetros de V, T y
t, se fijaron dos de ellos y se varió el tercero. Concluido
cada experimento (3 reactores), el sobrenadante se se-
paró cuidadosamente del soporte y cada uno se trató de
manera independiente. Al sobrenadante se le realizó su
espectro UV-VIS, mientras que el soporte se lavó con
una solución de NaCl 2M para eliminar la m-Mb que no
fue inmovilizada. Al sobrenadante y al soporte con la
m-Mb inmovilizada se les realizó el ensayo de actividad
tipo peroxidasas diseñado para hemoglobinas (Everse
et
al
. 1994). Posteriormente, se graficó el parámetro de-
terminado contra la concentración de la m-Mb en el
sobrenadante después de la reacción de inmovilización.
El valor elegido para el parámetro en estudio fue aquel
donde la concentración de m-Mb en el sobrenadante fue
menor (Villegas-Rosas
et al
. 1999).
El experimento de inmovilización de la m-Mb en BBG-
P fue realizado con los mejores parámetros selecciona-
dos en su conjunto. Se estimó el porcentaje de inmovili-
zación a partir de la absorbancia a 409 nm de m-Mb
antes y después del proceso de inmovilización. A la m-Mb
inmovilizada se le aplicó la prueba de actividad tipo
peroxidasa como se mencionó anteriormente.
Inmovilización de una peroxidasa patrón y la
peroxidasa de chayote [
Sechium edule
(Jacq.) Sw]
Bajo las condiciones utilizadas para la inmovilización
de m-Mb en el soporte BBG-P, se procedió a inmovilizar
a la peroxidasa de rábano blanco o rábano picante
(Horseradish, HRP) (ya que esta peroxidasa se usa a
nivel industrial y se ha estudiado con más detalle,
tomándose como referencia o patrón para el estudio de
peroxidasas obtenidas de nuevas fuentes) y la peroxidasa
de chayote (POCh). Sin embargo, debido a los bajos
rendimientos y a la liberación de sustancias coloridas en
el proceso de inmovilización se decidió descartar este
soporte y concentrar el estudio en el soporte PS/DVB-3G
activado. La metodología implementada se transfirió al
nuevo soporte y se obtuvieron mejores resultados bajo
las condiciones ya determinadas.
Se realizaron pruebas de actividad enzimática para
peroxidasas al soporte PS/DVB-3G sin activar y activa-
do (Pütter 1974). A continuación se procedió a inmovili-
zar en éste a la peroxidasa patrón y la POCh, las cuales
presentaron un índice de pureza o R.Z. (A
403nm
/A
280nm
)
de 1.0 (SIGMA) y 0.77 (Villegas-Rosas 1993), respecti-
vamente. Se utilizó una masa de 100 mg del soporte al
cual se les añadieron 800
µ
L de solución de enzima
(A
403nm
:~0.8). La HRP y POCh inmovilizadas (HRP-PS/
DVB-3G y POCh-PS/DVB-3G, respectivamente), se
lavaron con NaCl 2M hasta que la solución de lavado no
presentó actividad de peroxidasa y a las enzimas
inmovilizadas se les realizó el ensayo de actividad para
peroxidasas (Pütter 1974).
Pruebas de remoción de los contaminantes fenó-
licos mediante la POCh inmovilizada en PS/DVB-3G
Se utilizaron fenol, 2-metoxifenol y 3-clorofenol
como
contaminantes de prueba para poder comparar este es-
tudio con los reportados en la literatura.
Para determinar la cantidad de H
2
O
2
(12.3 mM) ne-
cesario para la reacción de polimerización del contami-
nante a estudiar, se preparó un agua residual artificial
con 3 ml del amortiguador de fosfatos 100 mM a pH 7.0
(usando agua destilada y desionizada), 50
µ
l de 2-
metoxifenol (20.1 mM) como contaminante, como se
muestra en la
tabla 1
. Se adicionaron 5
µ
l de POCh
(RZ:0.77) en solución con una actividad volumétrica de
7233 unidades por litro (U/L) y 30
µ
l de H
2
O
2
(12.3 mM)
como iniciador de la reacción. Se registraron cada cua-
tro minutos los espectros de absorción UV-VIS en el
intervalo de 700 a 230 nm, hasta que en el espectro no se
observaron más cambios en la absorbancia de las ban-
das presentes. Posteriormente, se adicionó una alícuota
de 120
µ
l de H
2
O
2
y se procedió a registrar nuevamente
los espectros de absorción UV-VIS como se indicó an-
teriormente. Este procedimiento se repitió hasta que ya
no se notaron más modificaciones en el espectro de ab-
sorción de la reacción de polimerización.
La formación de los polímeros del derivado fenólico
fue observada mediante el registro de las bandas de ab-
sorción en el intervalo de 360 a 520 nm. Posteriormente,
los polímeros formados en la solución fueron removidos
mediante filtración usando un microfiltro de 0.22 mm de
diámetro de poro (Gelman). Se calculó el porcentaje de
eliminación del contaminante mediante los valores de
absorbancia (
λ
: 274.5 nm) antes y después de la reac-
M.L.O. Villegas-Rosas
et al.
76
ción de polimerización. De manera similar se procedió a
calcular el porcentaje de remoción de los polímeros for-
mados a la longitud de onda de 416.5 nm, en que se ab-
sorben estos.
Algunas de las condiciones de prueba de la POCh en
solución con el sustrato 2-metoxifenol, se adecuaron
cuando se usó la POCh-PS/DVB-3G para el estudio de
remoción de los contaminantes fenol, 2-metoxifenol y 3-
clorofenol. Se utilizaron 10 mg del soporte con la enzima
inmovilizada, 25
µ
L del contaminante a estudiar y 300
µ
L
de H
2
O
2
, para el caso del 3-clorofenol, también se reali-
zaron experimentos empleando 150
µ
L de este contami-
nante y 610
µ
L de H
2
O
2
. Los
espectros de absorción
UV-VIS se registraron a diferentes intervalos de tiempo
hasta que ya no hubo variación en la absorbancia de las
bandas presentes. A continuación la enzima inmovilizada
se separó del sobrenadante que contiene a los polímeros
formados. La POCh-PS/DVB-3G fue lavada con solu-
ción de NaCl 2M y amortiguador de fosfatos 10 mM, pH
7.0, para posteriormente hacerle pruebas de su
reutilización. La remoción de los polímeros formados se
realizó mediante filtros de 0.22 y 0.40
µ
m.
El porcentaje de remoción de los contaminantes se
determinó a partir de su espectro de absorción UV-VIS
antes y después del proceso de polimerización a longitud
de onda de 270, 274.5 y 273.5 nm para fenol, 2-me-
toxifenol y 3-clorofenol, respectivamente. De manera si-
milar los porcentajes de remoción para los polímeros de
los contaminantes analizados se determinaron a las lon-
gitudes de onda de 397.5, 416.5
y 273.5 nm para fenol,
2-metoxifenol y 3-clorofenol, respectivamente, antes y
después de haber filtrado el sobrenadante.
RESULTADOS
Estimación de los parámetros para la inmoviliza-
ción de m-Mb
Mediante el uso de la proteína reportera m-Mb y el
soporte BBG-P se seleccionó la velocidad de agitación
de 210 rpm, 3 h de tiempo de reacción, 30
o
C de tempe-
ratura, 100 mg de soporte, 800
µ
L de la solución de m-
Mb con una absorbancia de ~1.0 y un reactor de 1mL de
volumen, como parámetros iniciales para el proceso de
inmovilización de esta proteína en dicho soporte. Con
estos y a partir de los espectros de absorción UV-VIS se
determinó el 86 % de m-Mb inmovilizada en el soporte
BBG-P (
Fig. 1
), mientras que a partir de la actividad
enzimática se determinó el 46 %. La m-Mb inmovilizada
después de haber sido lavada con NaCl 2M, presentó ac-
tividad peroxidasa en el ensayo de hemoglobinas (
Fig. 2
).
TABLA I.
COMPOSICIÓN DEL AGUA RESIDUAL ARTIFI-
CIALMENTE PREPARADA
Reactivo
Volumen
Amortiguador de fosfato de sodio 0.1 M, pH 7.0
3mL
Contaminante fenólico (20.1 mM)
25
µ
L
H
2
O
2
(12.3 mM) (como iniciador de la reacción)
300
µ
L
1.400
Fig. 1.
Espectros UV-VIS de m-Mb
para la
determinación del
porcentaje
de inmovilización en el soporte
BBG-P. (
g
)
Solución de
partida (A
409nm
: 1.35) y (
n
) Sobrenadante
después del proceso de inmovilización (A
409nm
: 0.18).
El porcentaje de inmovilización calculado mediante este
método fue de 86 %.
350
400
500
600
700
nanómetros
Absorbancia
0.000
0.500
1.000
Fig. 2.
Cinética de m-Mb inmovilizada para determinar su acti-
vidad enzimática en el soporte BBG-P. (
g
) Solución de
partida (actividad volumétrica: 2259.54 U/L) y (
n
)
Sobrenadante después del proceso de inmovilización
(actividad volumétrica: 99.97 U/L). La longitud de onda
utilizada fue 470 nm. El porcentaje de inmovilización
calculado mediante este método fue de 46 %.
Absorbancia
0.500
0.250
0.000
0.750
0
500
900
segundos
INMOVILIZACIÓN DE UNA PEROXIDASA Y SU APLICACIÓN EN AGUAS CONTAMINADAS
77
Inmovilización de una peroxidasa patrón y la per-
oxidasa de chayote (
Sechium edule
(Jacq.) Sw)
Se determinaron porcentajes de inmovilización del
12.60 % y 2.73 % para HRP y POCh en el soporte BBG-
P, respectivamente.
El soporte PS/DVB-3G sin activar y activado resultó
negativo a las pruebas de actividad para peroxidasas. En
este soporte se obtuvo
64.16 % de inmovilización para
HRP y
~100 % para POCh (
Fig. 3
), sin perder su acti-
vidad enzimática. La
figura 4
, muestra la actividad
enzimática de la POCh después de su inmovilización. La
cantidad de POCh-PS/DVB-3G utilizada para realizar el
ensayo de actividad peroxidasa fue de 10 mg y como
sustrato se usaron 30
µ
l del contaminante 2-metoxifenol.
Pruebas de remoción de los contaminante fenólicos
mediante la POCh-PS/DVB-3G
La composición del agua residual artificialmente pre-
parada para los estudios de remoción de los contaminan-
tes fenólicos se muestra en la
tabla I
. Las
figuras 5, 6
y
7
, indican los espectros de absorción UV-VIS de la for-
mación de polímeros de los contaminantes fenol, 2-
metoxifenol y 3-clorofenol, respectivamente, a diferen-
tes tiempos de reacción usando a la POCh-PS/DVB-3G.
La
figura 8
, muestra los espectros de absorción UV-
VIS de la remoción del contaminante fenol antes y des-
pués de haber sido tratada con la POCh-PS/DVB-3G.
La
tabla II
, presenta los datos de los porcentajes de re-
Fig. 3.
Espectros de
absorción
UV-VIS de
la
peroxidasa
de
chayote para determinar el porcentaje de
inmoviliza-
ción en PS/DVB-3G a
30 °C, 210 rpm y 3 h de reacción.
(
g
) Solución de partida (
A
403nm
: 0.330, diluida de 1:1)
y
(
n
) Sobrenadante
después del proceso de inmoviliza-
ción (
A
403nm
: ya no se observa la banda de absorción).
Fig. 4.
Cinética de la POCh inmovilizada para determinar su
actividad enzimática
en el soporte PS/DVB-3G. (
g
) de 0
a 180 s y (
n
) de 181 a 360 s. La longitud de onda utilizada
fue
436 nm.
Fig. 5.
Espectros de absorción UV-VIS de
la
formación
de
polímeros
del contaminante
fenol con respecto al tiem-
po, mediante el uso
de
la
POCh-PS/DVB-3G. (
±
) 0 min,
(
g
) 5 min, (
±
) 10 min y (
n
) 25 min.
Fig. 6.
Espectros de absorción UV-VIS de la formación de los
polímeros del contaminante 2-metoxifenol
con respecto
al tiempo, mediante el uso de la POCh-PS/DVB-3G. (
g
) 0
min,
(
n
) 5 min, (
±
) 10 min y (
±
) 25 min.
Absorbancia
Absorbancia
nanómetros
nanómetros
nanómetros
nanómetros
Absorbancia
0.500
0.400
0.200
0.000
275 300
400
500
600
700
0.100
0.075
0.050
0.025
0.000
0
50
100
150
180
0.220
0.100
0.000
500
230
300
400
600
700
0.000
0.100
0.200
0.300
230
300
400
500
600
700
M.L.O. Villegas-Rosas
et al.
78
moción de los contaminantes estudiados y la
tabla III
muestra los porcentajes de remoción mediante filtración
de los polímeros obtenidos, además, en esta tabla se indi-
can los tiempos en que fueron registrados los espectros
de la formación máxima de dichos polímeros.
DISCUSIÓN
El soporte comercial BBG-P utilizado fue elegido de-
bido a que contiene grupos funcionales aldehído que
pue-
den unirse directamente a la enzima que se desea inmo-
vilizar. Los parámetros determinados con este soporte y
la proteína reportera, permitieron obtener un porcentaje
alto de inmovilización de la misma. Sin embargo, debido
a los bajos porcentajes de inmovilización encontrados para
la HRP y la POCh, se decidió descartar dicho soporte y
se continuó con el soporte desarrollado en nuestro labo-
ratorio (PS/DVB-3G).
La metodología implementada para la inmovilización
de m-Mb fue transferida al nuevo soporte con la finali-
dad de probar si ésta permitía obtener buenos resultados
en la inmovilización de HRP y POCh, además de ahorrar
tiempo y disminuir los costos de la investigación.
El soporte PS/DVB utilizado como matriz orgánica
se funcionalizó con el péptido glicilglicilglicina con la fi-
nalidad de tener un
espaciador
o
brazo
que le permi-
ta a la enzima unirse al soporte (ya que sin éste, el sopor-
te sería inerte a la unión con cualquier enzima o proteína),
además, de no estar tan cerca de la superficie del mismo y
tratar de impedir que el espacio a su alrededor después de
su inmovilización afecte sus propiedades catalíticas. Así,
el PS/DVB-3G posee un grupo carboxilo terminal, que des-
pués de haber sido tratado con CDI queda activado debido a
la formación de un grupo carbamato-imidazolil que puede
reaccionar con los grupos amino de la enzima y permitir su in-
movilización a través de la formación de un enlace peptídico.
Fig. 7.
Espectros de absorción UV-VIS de
la formación de los
polímeros del contaminante 3-clorofenol con respecto
al tiempo, mediante el uso de
la POCh-PS/DVB-3G. (
g
) 0
min, (
n
) 5 min, (
±
)
15 min y (
±
) 25 min. No se observó la
aparición de nuevas nuevas bandas en la región visi-
ble, pero sí un cambio con
respecto al espectro inicial.
Fig. 8.
Espectros de absorción UV-VIS del agua artificialmente
contaminada con fenol. Antes (
n
) y después (
±
) de
haber sido tratada con la POCh-1PS/DVB-3G y filtrada
(después de 15 min de concluido el experimento de
polimerización).
Absorbancia
Absorbancia
TABLA II.
PORCENTAJE DE REMOCIÓN DE CONTAMINANTES FENÓLICOS MEDIAN-
TE EL USO DE LA POCh-PS/DVB-3G
Contaminante
Absorbancia
Porcentaje
Fenol
Inicial : 0.229
Final: 0.06
70.0
(
λ
: 270 nm)
(absorbancia al tiempo
(se filtró después de
0 min ó antes de ini-
15 min de concluida
ciar la reacción
la reacción)
2-metoxifenol
Inicial: 0.204
Final: 0.043
78.92
(
λ
: 274.5 nm)
(absorbancia al tiempo
(se filtró después de
0 min ó antes de ini-
15 min de concluida
la reacción)
la reacción)
3-clorofenol
*
Inicial: 1.140
Final: 0.222
80.52
(
λ
: 273.5 nm)
(absorbancia al tiempo
(se filtró después de
0 min ó antes de ini-
15 min de concluida
ciar la reacción)
la reacción)
* se usaron 150
µ
L del sustrato y 610
µ
L de
H
2
O
2
(como iniciador de la reacción)
nanómetros
0.100
0.050
0.000
230
300
400
500
600
700
230
300
400
500
600
700
0.000
0.100
0.200
0.300
nanómetros
INMOVILIZACIÓN DE UNA PEROXIDASA Y SU APLICACIÓN EN AGUAS CONTAMINADAS
79
La proteína reportera seleccionada fue de fácil ob-
tención y purificación, además, el costo de obtención fue
relativamente bajo. La selección de esta proteína repor-
tera de masa molecular pequeña (16,980 daltones) se
hizo con la finalidad de que este parámetro no influyera
significativamente en su inmovilización, ya que una pro-
teína de mayor masa pudiera tener problemas para
interactuar con el espaciador triglicina añadido al sopor-
te. Por otro lado, el espectro electrónico de absorción
UV-VIS similar al de una peroxidasa permitió monitorear
los diferentes experimentos realizados mediante esta he-
rramienta espectroscópica tan útil y accesible para mu-
chos laboratorios industriales.
Mediante el uso de la proteína reportera (m-Mb) se
realizaron experimentos por triplicado suficientes para la
estimación de los parámetros de inicio de la inmoviliza-
ción de la POCh en el soporte PS/DVB-3G, además, el
costo de estos fue más bajo que si se hubiera tenido que
emplear la enzima patrón o la POCh en la búsqueda de
las condiciones adecuadas para su inmovilización.
La cantidad de PS/DVB-3G utilizada para la inmovi-
lización así como el volumen de la solución de la proteína
reportera fueron pequeños pero suficientes para realizar
posteriormente las pruebas de actividad peroxidante. La
inmovilización de la m-Mb en el soporte no afectó
sustancialmente dicha actividad.
Las pruebas de actividad peroxidasa realizadas al PS/
DVB-3G sin activar y activado resultaron negativas, lo
que garantizó que no interfiriera éste en el ensayo de
actividad de la enzima inmovilizada.
Las condiciones utilizadas en la inmovilización de m-Mb
y el grado de pureza de la POCh a inmovilizar fueron
adecuadas para lograr el alto porcentaje de inmoviliza-
ción de la peroxidasa de chayote. Los porcentajes de
inmovilización de la POCh en el soporte seleccionado
son muy similares a los reportados en la literatura para el
caso de la peroxidasa patrón (Schewale y Naik 1991,
Peralta-Zamora
et al
. 1997). Es importante mencionar
que la actividad de la POCh inmovilizada no fue afectada
significativamente .
La composición del agua residual artificialmente pre-
parada para demostrar la actividad de la peroxidasa inmo-
vilizada, así como para los estudios de remoción de los
contaminantes fenólicos, permitió registrar los experimen-
tos mediante espectroscopía UV-VIS utilizando pequeñas
cantidades tanto de la enzima en solución como de la
POCh-PS/DVB-3G.
El monitoreo de los experimentos mediante la obten-
ción de los espectros de absorción electrónica mostró
claramente las modificaciones que sufrió el espectro ini-
cial del contaminante analizado y la formación de los
polímeros de los contaminantes fenol y 2-metoxifenol en
dependencia del tiempo. Para el caso del contaminante
3-clorofenol, cuando se usaron 25
µ
L de éste, los espec-
tros no permitieron examinar la presencia de las bandas
debido a la formación de los polímeros, pero sí se eviden-
ció un cambio en la forma de su espectro original duran-
te la reacción de polimerización. Con la finalidad de ob-
servar las bandas de los polímeros, se incrementó la canti-
dad del sustrato a 150
µ
L, y aunque tampoco pudieron ser
advertidas, se determinó la cantidad de sustrato removido.
El tiempo de polimerización para el 2-metoxifenol fue
el más bajo (5 min), mientras que para el fenol fue el
doble y para el 3-clorofenol fue cuatro veces mayor. Los
porcentajes de eliminación de los contaminantes estudia-
dos se encuentran en el mismo intervalo de los reporta-
dos en la literatura utilizando a la peroxidasa de rábano
picante (HRP) u otras peroxidasas, tanto inmovilizadas
como sin inmovilizar (Maloney
et al
. 1984, Al/Kassim
et
al
. 1994, Arseguel y Baboulene 1994, Bodzek
et al
. 1994,
Ruckenstein y Wang 1994, Wada
et al
. 1995, Peralta-
Zamora
et al
. 1997, Kinsley y Nicell 2000, Masuda
et al.
2001, Singh y Singh 2002, Villalobos y Buchanan 2002,
Villegas-Rosas
et al.
2002, Wagner y Nicell 2002).
TABLA III.
PORCENTAJE DE REMOCIÓN DE LOS POLÍMEROS DE LOS CONTA-
MINANTES FENÓLICOS MEDIANTE FILTRACIÓN.
Contaminante
Absorbancia
Porcentaje
Fenol
Inicial : 0.250
Final: 0.081
67.60
(
λ
: 397.5 nm)
(tiempo de reacción para
(se filtró
después
de
la formación
máxima de los
15 min de concluida la
polímeros: 10.0 in)
reacción)
2-metoxifenol
Inicial: 0.204
Final: 0.043
68.92
(
λ
: 416.5 nm)
(tiempo
de reacción para
(se filtró
después
de
la formación máxima de los
15 min de concluida la
polímeros: 5.0 min)
reacción)
3-clorofenol
Inicial: N.D.
Final: N.D.
N.D.
(
λ
: N.D.)
(tiempo de reacción:
20 min)
N.D.: no determinada
M.L.O. Villegas-Rosas
et al.
80
Los porcentajes de remoción de los polímeros forma-
dos para los contaminantes fenol y 2-metoxifenol son
semejantes, pero para el caso del 3-clorofenol no pudo
ser determinado a pesar de haber incrementado su con-
centración en la mezcla de reacción, por lo que es impor-
tante continuar el estudio de este contaminante.
Por otro lado, es de mencionarse que los métodos
comunes para la remoción de este tipo de contaminantes
fenólicos como degradación microbiana, adsorción so-
bre carbón activado, oxidación química (usando agentes
tales como ozono, peróxido de hidrógeno o dióxido de
cloro), métodos de incineración, extracción por disolventes
e irradiación, que aunque efectivos, presentan desventa-
jas como son costos altos, remoción incompleta, forma-
ción de subproductos peligrosos y su aplicación en
intervalos limitados
de concentración (Klibanov
et al
.
1983, Chang
et al.
1995, Miland
et al
. 1996). Por otro
lado, la capacidad de las peroxidasas de remover fenoles
aún a concentraciones muy bajas y en amplios intervalos
de pH (Klibanov
et al.
1983, Nicell
et al
. 1993, Wagner
y Nicell 2002), indica que podrían ser aplicadas en méto-
dos secundarios y/o terciarios para el tratamiento de aguas
residuales y reducir la concentración de este tipo de com-
puestos hasta valores no mayores a 0.001 mg/L en aguas
potables (Norma Oficial Mexicana 1994).
CONCLUSIONES
La actividad enzimática de la peroxidasa de chayote
[
Sechium edule
(Jacq.) Sw] fue preservada durante su
inmovilización en el soporte orgánico poliestireno-divinil-
beceno funcionalizado
para este fin. Los sustratos fenol
y 2-metoxifenol fueron polimerizados por la enzima inmo-
vilizada con altos porcentajes de remoción, abriendo así
un amplio campo para ser probada con otros contami-
nantes similares y peligrosos para el ambiente.
El soporte comercial Bakerbond Glutaraldehído-P no
resultó adecuado para la inmovilización de las peroxidasas
y fue descartado para el estudio subsecuente de descon-
taminación con peroxidasas inmovilizadas. Por otro lado,
el soporte PS/DVB-3G resultó adecuado para el estudio
aquí reportado y se revela como un soporte de gran utili-
dad en procesos de inmovilización de proteínas.
El fruto de chayote es un producto de origen meso-
americano de bajo costo desafortunadamente subutilizado
(Lira-Saade 1996), tiene gran potencial para la obten-
ción de peroxidasas y éstas ya inmovilizadas son exce-
lentes candidatas para su uso como método para la des-
contaminación de aguas residuales con contaminantes
de tipo fenólico. El reuso de estas aguas después de su
descontaminación es factible utilizando la metodología
descrita, por lo que actualmente se hacen esfuerzos para
optimizar y aplicar ésta a aguas residuales reales y pos-
teriormente escalar dicho proceso.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen al Sistema de Investigación
Regional Ignacio Zaragoza del CONACyT por el finan-
ciamiento del proyecto denominado “Uso de la peroxidasa
de chayote inmovilizada en el tratamiento de aguas con-
taminadas con fenoles” (clave: 970602002). Al Posgrado
en Ciencias Ambientales y al Centro de Química del Ins-
tituto de Ciencias de la Benemérita Universidad Autóno-
ma de Puebla por el financiamiento otorgado a este pro-
yecto. A los alumnos Delfino Méndez Hernández de la
Universidad de Autónoma de Tlaxcala, Nadia Silvestry
Rodríguez de la Universidad de Occidente, Campus Los
Mochis y Alejandro Isaías Alonso Calderón, del Instituto
Tecnológico de Puebla, por su apoyo.
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