Artículo en PDF
Cómo citar el artículo
Número completo
Más información del artículo
Página de la revista en redalyc.org
Sistema de Información Científica
Red de Revistas Científicas de América Latina y el Caribe, España y Portugal
Rev. Int. Contam. Ambie. 27(3) 231-239, 2011
BACTERIAS REDUCTORAS DE Cr
+6
Y SU POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO
Marina ISLAS-ESPINOZA
*
y Rocío BOJÓRQUEZ-AGUILAR
Centro Interamericano de Recursos del Agua, Universidad Autónoma del Estado de México, Carretera Toluca-
Atlacomulco Km. 14.5, Toluca 50200, Edo. de México, México. *Correo electrónico; marinaislas@ymail.com
(Recibido junio 2010, aceptado junio 2011)
Palabras clave: bacterias resistentes, Cr
+6
, aislamiento, curso alto del río Lerma, reducción de Cr
RESUMEN
Las bacterias que sobreviven a las condiciones de mezcla de contaminantes del curso
alto de la cuenca alta del río Lerma (CARL) requieren de un metabolismo especiali-
zado para poder sobrevivir. Bajo este precepto se tomaron sedimentos de tres sitios
del CARL como fuente de bacterias resistentes a Cr
+6
. En el sitio identiFcado como
Lerma se aislaron la mayor variabilidad de especies reductoras de Cr
+6
dentro del
grupo de bacterias seleccionadas. En Tultepec se aisló la mayor cantidad de bacterias
reductoras de Cr
+6
. Se aislaron seis cepas morfológica y bioquímicamente diferentes
de los sedimentos capaces de resistir concentraciones de hasta 1000 mg L
–1
de Cr
+6
en medio líquido. Las cepas estudiadas fueron Gram negativas y presentaron una con-
centración mínima inhibitoria superior a la encontrada en otros trabajos. Estas cepas
fueron capaces de reducir Cr
+6
a Cr
+3
en porcentajes entre 7 y 40, después de 7 días,
sometidas a 200 mg L
–1
de Cr
+6
. La capacidad de transformación de cada cepa en orden
descendente fue: ±, A, B, C, E y D
.
Se estableció la cinética de reducción de la cepa
± que presentó la mayor transformación de Cr
+6
a Cr
+3
, obteniéndose una reducción
del 33.59 % a los 12 días. La biomasa de la cepa ± no fue afectada por la presencia de
Cr
+6
. Es importante señalar que el medio de cultivo por sí mismo representó un medio
abiótico de reducción de Cr
+6
(17.21 %). La utilización del equipo API-20E fue útil
en la determinación de algunas reacciones bioquímicas de las cepas, sin embargo, esta
identiFcación no resultó concluyente ya que presentó porcentajes de similitud bajos
(83.1 a 90.7 %). Estas cepas representan un potencial biotecnológico para su aplicación
en sistemas de tratamiento para reducción de Cr
+6
a Cr
+3
e incluso en ensayos sobre
otros metales pesados.
Key words: resistant bacteria, Cr
+6
, isolation, Cr
+6
-reduction, contaminated water body
ABSTRACT
Bacteria that survive the pollutant mixing conditions of the upper basin of the Lerma
river (CARL) require a specialized metabolism for survival. Under this postulation,
sediment was taken from three sites of the CARL as a source of bacteria resistant to
Cr
+6
. At the site identiFed as Lerma, greater variability of species was found in the
group of selected bacteria that reduced Cr
+6
. In Tultepec, the highest population of
Cr
+6
reducing bacteria was isolated. Six strains with different morphological and
biochemical characteristics were isolated from the sediments. These strains tolerated
concentrations up to 1000 mg L
–1
of Cr
+6
in liquid media. Also they reduced Cr
+6
to
M. Islas-Espinoza y R. Bojórquez-Aguilar
232
Cr
+3
in percentages between 7 and 40, following 7 days, supplemented with 200 mg
L
–1
of Cr
+6
. The strains studied were Gram negative and showed a minimum inhibitory
concentration greater than that found in other studies. The transformation capacity of
each strain in descending order were: F, A, B, C, E and D. The kinetics of reduction
of strain F showed the highest transformation of Cr
+6
to Cr
+3
, obtaining a reduction of
33.59 % at 12 days. The biomass of strain F was not affected by the presence of Cr
+6
.
It is important to note that the medium itself represented a reduction of Cr
+6
(17.21
%). The use of the API-20E kit was helpful in determining some biochemical reac-
tions of strains, however, this identi±cation was not conclusive because it presented
low percentages of similarity (83.1 to 90.7 %). These strains represent a potential of
biotechnology for use in treatment systems to reduce Cr
+6
to Cr
+3
, and even in trials
of other heavy metals.
INTRODUCCIÓN
Los problemas de contaminación de acuíferos a
nivel mundial son motivo de preocupación y requieren
opciones tecnológicas de remediación que permitan
cubrir las demandas futuras y crecientes de agua. Uno
de estos sitios contaminados corresponde al curso alto
de la cuenca alta del río Lerma (CARL) que está ubi-
cado dentro de la subcuenca Antonio Alzate (Cuenca
río Lerma 1, según denominación publicada en el DOF
con fecha 15 de octubre de 2003). Esta subcuenca se
ubica al sur-oriente de la cuenca Lerma-Chapala y
comprende el área de aportación al río Lerma, desde su
nacimiento en la Laguna de Chignahuapan, municipio
de Almoloya del Río, hasta la cortina de la presa José
Antonio Alzate.
Esta subcuenca está integrada por 22
municipios correspondientes al Estado de México,
entre los que destaca la zona metropolitana de Toluca,
conformada por los municipios de Toluca, Lerma,
Metepec, Ocoyoacac, Xonacatlán y Zinacantepec. En
esta subcuenca se ubica el corredor industrial Valle
de Toluca-Lerma que es la segunda concentración
industrial más grande en el Estado de México. La in-
dustria asentada alrededor de dicho corredor muestra
un proceso de crecimiento acelerado y los tipos de
actividad industrial de esta subcuenca se caracterizan
por un consumo alto de agua durante sus procesos
productivos, provocando con ello un aumento en los
niveles de extracción registrados. Destacan en este co-
rredor industrial la producción de alimentos, productos
químicos derivados del petróleo y productos metálicos.
También se observa una producción importante de
textiles, madera, bebidas, hule y plástico, entre otros.
Al elevado patrón industrial de consumo de agua, se
agrega el problema del aporte de contaminantes al
CARL, ocasionado por la insu±ciente capacidad de
tratamiento de las descargas industriales, los insu±-
cientes niveles de reuso y la gran producción de aguas
residuales municipales (SEMARNAT
et al.
2007).
La contaminación del agua en el CARL se ha
convertido en un problema de salud pública y a su
vez han surgido diversas propuestas para su sanea-
miento. Los organismos públicos reguladores de
agua han sugerido que los principales productores de
aguas residuales en la subcuenca desarrollen sistemas
de saneamiento, independientemente de su cuerpo
receptor. Hasta el momento, no se ha vislumbrado
la posibilidad de aislar a los microorganismos que
se han adaptado a este medio acuático contaminado
para aplicaciones en otros procesos. Dichos micro-
organismos resistentes a concentraciones elevadas
de contaminantes podrían ser adaptables a procesos
de tipo industrial o para el tratamiento de aguas resi-
duales. En un tratamiento biológico de agua e±ciente
se requiere una acción microbiana especializada, la
cual probablemente se pueda encontrar como una
forma de adaptación biológica en el mismo río.
Particularmente, las bacterias son ampliamente uti-
lizadas en biotecnología debido a que poseen altas
tasas de reproducción y de mutación, lo cual resulta
en una gran diversidad de subespecies, adaptaciones
y sistemas enzimáticos especializados.
En la subcuenca del CARL se han detectado fuer-
tes concentraciones de metales en varias secciones
del río. La zona que presenta la mayor cantidad de
metales es la de México-Toluca y Tultepec, en donde
se encuentra la máxima acumulación de metales en
sedimento y se considera que la contaminación es
principalmente industrial (Fall
et al.
2007). La con-
centración de metales está controlada principalmente
por las variaciones de caudales en el río, por los arras-
tres de suelos aledaños y sedimentos de ríos tributa-
rios, así como por aportes antrópicos. Los metales en
el CARL se encuentran asociados principalmente a
los sólidos suspendidos y a los sedimentos (Colombo
et al.
1990), de ahí que se eligieran los sedimentos
para el análisis prospectivo y así aprovechar el po-
tencial de encontrar bacterias resistentes a metales,
BACTERIAS REDUCTORAS DE Cr
+6
Y SU POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO
233
particularmente al cromo hexavalente (Cr
+6
). El
cromo hexavalente es un metal pesado ampliamente
utilizado en la industria del corredor Valle de Toluca-
Lerma (dentro del área del CARL), lo cual incluye
curtido de pieles, electrogalvanizado, manufactura
de pinturas y pigmentos, e industria de fertilizantes.
El Cr
+6
es muy soluble y tóxico para muchas plantas,
animales y bacterias que habitan sistemas acuáticos,
principalmente vertebrados mayores (McGrath y
Smith 1990). La dosis letal 50 (LD
50
) en ratones es
de 137-177 mg kg
–1
de peso corporal (Saxena
et al.
1990). Dada su peligrosidad, diversas agencias re-
guladoras como: International Agency for Research
on Cancer (IARC), World Health Organization
(WHO), Environmental Protection Agency (EPA)
y Food and Drugs Administration (FDA), clasi±can
al Cr
+6
como un tóxico prioritario (IARC 2008,
WHO 2000, 2004, EPA 2008, FDA 2007, 2008). En
el tratamiento de aguas residuales la concentración
umbral inhibidora sobre microorganismos hetero-
tró±cos para Cr total es de 10 mg L
–1
y para Cr
+6
es
de 1 mg L
–1
(Tchobanoglous
et al.
2003). El Cr
+6
inhibe la mayoría de las actividades enzimáticas
bacterianas e induce mutaciones (Ehrlich 1986).
Sin embargo, algunas especies de bacterias han sido
encontradas sobreviviendo en sitios contaminados
con Cr
+6
:
Pseudomonas putida
MK1 y
Escherichia
coli
(Cheung y Gu 2007),
Pseudomonas aeruginosa
(Aguilera
et al.
2004),
Shewanella alga
BrY-MT
(Camargo
et al.
2003),
E. coli
ATCC 33456 (Guha
et al.
2001) y
Bacillus
spp. (Shakoori
et al.
1999) y
Staphylococcus cohnii
que bioacumula Cr
+6
a una
concentración inicial de 1000 mg L
–1
(Donmez y
Kocberber 2004).
En un estudio realizado por la Universidad Au-
tónoma del Estado de México en colaboración con
el Instituto de Investigaciones Nucleares (ININ), se
determinó que las tres zonas de mayor contribución
y acumulación de Cr en el CARL son: Tultepec,
Mezapa y el puente de la carretera México-Toluca,
en los meses de febrero y mayo. La concentración
promedio de Cr en sedimento de la CARL durante el
estudio fue de 297 mg kg
–1
(Zarazúa, 2008).
En este sentido, el objetivo de la presente inves-
tigacion fue cultivar, aislar y seleccionar bacterias
reductoras de Cr
+6
. Primeramente se hizo un análisis
prospectivo de bacterias resistentes a altos niveles
de Cr
+6
, tomando muestras de sedimentos de las tres
zonas de mayor contribución y acumulación de Cr
en el CARL. La composición química del agua en
el CARL es compleja debido al origen variable de
las aguas residuales que lo contaminan, por lo cual
sólo se eligieron los tres sitios con mayor presencia
de Cr para la selección de las bacterias. En segundo
lugar, se seleccionaron aquellas bacterias capaces
de reducir el Cr
+6
del agua. La intención de obtener
bacterias resistentes y capaces de reducir el Cr
+6
, es
explorar su potencial biotecnológico para depurar
aguas residuales que contengan Cr en las plantas de
tratamiento y así obtener aguas ya tratadas antes de
ser descargadas al río.
MATERIALES Y MÉTODOS
Las bacterias resistentes son aquéllas que pueden
desarrollarse bajo condiciones ambientales adver-
sas, en las cuales la mayoría de los organismos
no podrían sobrevivir. Este tipo de adaptaciones
permiten su aislamiento selectivo en presencia del
compuesto de interés. Gracias a esto se pueden
obtener cultivos bacterianos en medios selectivos
determinados. Dados los diversos orígenes de las
descargas de agua en el CARL, se seleccionaron
solamente los tres sitios registrados con la mayor
contaminación por Cr
+6
en los sedimentos (Ávila
et al.
1999, Fall
et al.
2007, Zarazúa 2008). Los
sedimentos se han convertido en un gran almacén
de metales pesados pues es donde se precipitan y
acumulan debido a la mayor cantidad de materia
orgánica. Además, la sedimentación de estructuras
bacterianas de resistencia y la presencia de medios
de soporte en el fondo de los cuerpos de agua, hacen
que la comunidad bacteriana sea más diversa en el
sedimento que en la columna de agua. El muestreo
de sedimento se realizó en abril del 2009 y los pun-
tos de muestreo se ubicaron en: a) Tultepec: calle
Alfredo del Mazo y Villa Mar, Puente peatonal Tul-
tepec b) Lerma: puente peatonal, Col. Isidro Fabela,
500 m aguas arriba de la empresa Reciclagua y c)
Toluca: puente de la carretera Toluca-Naucalpan
(
Cuadro I
).
Las muestras de sedimento se colectaron con una
draga tipo ponar. Para evaluar la presencia de bac-
terias aerobias en el sedimento colectado se evaluó
la presencia de biomasa como unidades formadoras
de colonias (UFC) utilizando siembra en placa por
dilución y se eligieron las placas con un rango de
colonias entre 20 y 200 UFC, para calcular una con-
centración aproximada de UFC/g peso húmedo de
sedimento, aplicando la Ecuación (1).
Factor de
dilución
1mL
x
placa
10mL dilución
1g
sedimento inicial
UFC
x
placa
g
sedimento
UFC
x
=
(1)
M. Islas-Espinoza y R. Bojórquez-Aguilar
234
Inicialmente se sembró 20 % de cada muestra
de sedimento en 50 mL de medio mínimo de sales
(MSM), composición (mg L
–1
): 11, MgSO
4
7H
2
O;
14, CaCl
2
; 340, KH
2
PO
4
; 670, Na
2
HPO
4
7H
2
O;
22, FeCl
3
6H
2
O; y 500, NH
4
Cl. La incubación en
medio líquido se llevó a cabo en un agitador orbital
a 100 rpm a temperatura ambiente (20-23 ºC). Antes
de aclimatar a la comunidad bacteriana al Cr
+6
, se
realizaron 6 resiembras para eliminar las partículas
de sedimento. Después de esta etapa y en delante
se utilizó para el cultivo, medio tripticaseína y soya
(MTS) composición (g L
–1
): 15, peptona de caseína;
5, peptona de soya; 5, NaCl. Para la selección de bac-
terias resistentes se realizaron 5 resiembras en MTS
con 50 mg L
–1
de Cr
+6
, posteriormente se inocularon
con 10 % de cultivo en matraces con MTS estéril
adicionados con 100, 250, 500 y 1000 mg L
–1
de
Cr
+6
. La obtención de bacterias resistentes a Cr
+6
se
llevó a cabo por ciclos de siembra en placa en MTS
más 15 g L
–1
de agar-agar y 50 mg L
–1
de Cr
+6
, hasta
obtener colonias morfológicamente distintas.
Para determinar la concentración mínima inhibi-
dora (CMI), que es la concentración de contaminante
en la cual no se observa crecimiento bacteriano, se
sembraron las cepas puras con 1 % de inóculo en MTS
por triplicado en concentraciones de 250, 300, 500, 750
y 1000 mg L
–1
de Cr
+6
y se contaron las células los días
0 y 7 de cultivo utilizando una cámara de Neubauer.
Para determinar el porcentaje de reducción de
Cr
+6
se sembraron las cepas por triplicado en MTS
con 200 mg L
–1
de Cr
+6
y 1 % de inóculo, un testigo
positivo (MTS+Cr
+6
sin inóculo), un testigo positivo
con agua (H
2
O+Cr
+6
) y un testigo negativo (MTS). Las
concentraciones de Cr
+6
y Cr total se midieron los días
0 y 7 de cultivo, conforme a la APHA (APHA 1998).
Después de obtener el porcentaje de reducción
de Cr
+6
a Cr
+3
, se eligió la cepa con mayor capaci-
dad de reducción y se realizó su cinética, utilizando
MTS con una concentración de 200 mg L
–1
de Cr
+6
.
Se midieron las concentraciones de Cr
+6
(Conc) y
densidad óptica (DO) a 600 nm en un espectrofotó-
metro UV-Visible, Varian® modelo Cary 1E, para
cuanti±car el crecimiento bacteriano.
Para la caracterización bioquímica de las cepas
aisladas se utilizó el equipo API 20E bioMerieux,
Inc.
®
. El tamaño de las células se obtuvo con una
retícula calibrada a 1 µm. Se realizó además tinción de
Gram y prueba oxidasa, así como observación
in vivo
en microscopio de contraste de fases y crecimiento
sobre agar MacConkey. La identi±cación se llevó a
cabo aplicando la base de datos incluida en el equipo
API 20E contrastando con las características de cada
especie dadas en el manual de clasi±cación de bacte-
riología sistemática de Bergey (Brenner
et al.
2008).
RESULTADOS
Cuantifcación de las comunidades bacterianas
iniciales
Se evaluó la presencia de biomasa como unidades
formadoras de colonias (UFC) utilizando siembra en
placa por dilución y se eligieron las placas con un
rango de colonias entre 20 y 200 UFC. Dada la alta
cantidad de células que fueron capaces de crecer en
medio sólido y bajo condiciones aerobias (
Cuadro
II
), se concluyó que las muestras contaban con su±-
ciente número de bacterias para selección y cultivo.
Se obtuvieron un total de 12 cepas resistentes
a Cr
+6
, en los tres sitios de muestreo, de las cuales
seis resultaron tener características distintas (A, B,
C, D, E y F). Las cepas A, B, y F se aislaron del
sitio denominado Lerma, las cepas D y E fueron
aisladas del sitio denominado Tultepec, y la cepa
C se encontró en el sitio denominado Toluca. En el
sitio identi±cado como Lerma se encontró una mayor
variabilidad de especies resistentes a Cr, dentro del
CUADRO I
. SITIOS DE OBTENCIÓN DE SEDIMENTO DEL RÍO LERMA
Ubicación del sitio
de muestreo
Coordenadas
UTM
Geográ±cas
X
Y
Latitud
Longitud
(a) Tultepec, Edo. Méx.
2117578
448303
19º9’.044”
99º29’.044”
(b) Lerma, Edo. Méx.
2132630
431052
19º17’.174”
99º39’.373”
(c) Toluca, Edo. Méx.
2142669
441678
19º22’.637”
99º33’.323”
CUADRO II.
NÚMERO DE UFC/g DE SEDIMENTO
Muestra
UFC/g sedimento
(a) Tultepec, Edo. Méx.
294 118
(b) Lerma, Edo. Méx.
2 857 143
(c) Toluca, Edo. Méx.
1 904 762
BACTERIAS REDUCTORAS DE Cr
+6
Y SU POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO
235
grupo de bacterias seleccionadas. En el sitio identi-
fcado como Tultepec se encontró la mayor cantidad
de bacterias resistentes a Cr
+6
dentro del grupo de
bacterias seleccionadas. A continuación se muestra
la proporción de la diversidad de especies resistentes
a Cr
+6
seleccionadas (
Cuadro III
).
Concentración mínima inhibidora de Cr
+6
en
cepas seleccionadas
La CMI para las bacterias resistentes a Cr
+6
Fueron:
para la cepa D, 250 mg L
–1
; para las cepas A, C, E y
±, 500 mg L
–1
y para la cepa B, 1000 mg L
–1
. Estas
concentraciones Fueron superiores a las reportadas
por Srinath
et al.
(2002) que registran una CMI de
151 mg L
–1
(3.0 mM) sólo en el 13 % de las cepas
aisladas, a diFerencia del presente estudio en donde
las CMI Fueron mayores a 250 mg L
–1
(4.8 mM) para
las 6 cepas aisladas.
Cinética de crecimiento y reducción de Cr
+6
En la determinación del porcentaje de reducción
de Cr
+6
a Cr
+3
(
Cuadro IV
), se obtuvo que la cepa
más efciente Fue la ±. Por lo que Fue seleccionada
para determinar el modelo cinético de reducción.
En la cinética de crecimiento y reducción de Cr
+6
de la cepa ± (
Fig. 1
) se observó que después del
doceavo día las concentraciones de Cr
+6
se estabili-
zaron. La cepa ± creció adecuadamente en presencia
del contaminante, sin embargo, su crecimiento Fue
más lento en comparación con la misma cepa sin
contaminante (testigo negativo). El porcentaje de
reducción total de Cr
+6
por la cepa ± Fue de 66 % al
doceavo día, mientras que el del medio de cultivo se
estableció entre 14 y 18 % de reducción máxima a
partir del quinto día.
La presencia de Cr
+6
aumentó la Fase Lag (etapa
de adaptación al medio) de la cepa ± sembrada en
el medio adicionado con Cr
+6
, esta reacción estuvo
directamente relacionada con una mayor concentra-
ción del contaminante en el medio.
Caracterización morfológica, ±siológica y bio-
química de las cepas reductoras de Cr
+6
En el grupo de bacterias reductoras de Cr
+6
se
encontraron bacterias entéricas en Forma de bacilos
(A, B, D, E, ±) y cocobacilos (C) clasifcadas como
Gram negativas metabólicamente distintas. Algunas
de estas bacterias Fueron móviles (A, D, ±) y otras
inmóviles (B, C, E) (
Cuadro V
).
La cepa C dio positivo en la prueba de agar eosina
y azul de metileno para bacterias como
Escherichia
coli
, y
Klebsiella sp
. La colonia E presentó una agru-
pación de estreptobacilus y el resto de las cepas se
agruparon como diplobacilus. Las colonias A, B, C,
D y ± presentaron una Forma circular, en tanto que la
cepa E Fue irregular. Las cepas A y C presentaron una
elevación convexa y el resto Fueron lisas o planas. La
caracterización bioquímica de las cepas utilizando el
equipo API 20E proporcionó porcentajes de especies
CUADRO IV.
REDUCCIÓN DE Cr
+6
(%) DE LAS
CEPAS
PURAS, DESPUÉS DE 7 DÍAS
Origen de la muestra
ID
%Reducción Cr
+6
→Cr
+3
Lerma
A
37.69 %
Lerma
B
36.93 %
Toluca
C
15.82 %
Tultepec
D
7.54 %
Tultepec
E
15.46 %
Lerma
±
40.80 %
MTS+Cr
+6
17.21 %
H
2
O+Cr
+6
9.93 %
Fig. 1.
Cinética de crecimiento y transFormación de Cr
+6
a Cr
+3
de la cepa ±
0
20
40
60
80
100
120
140
0
46
51
70
78
92
102
118
128
144
152
168
176
192
216
240
264
Concentración de Cr
6+
(mg L
–1
)
288
Tiempo (horas)
Cepa F (Conc)
testigo + Medio de cultivo (Conc)
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
Densidad óptica a 600 nm
Cepa F (DO)
Cepa F (testigo-) (DO)
CUADRO III.
PROPORCIÓN DE BACTERIAS RESISTEN-
TES A Cr
+6
DE LAS CEPAS SELECCIONA-
DAS EN LOS TRES SITIOS DE MUESTREO
Cepas bacterianas (ID)
Proporción (%)
A
14
B
14
C
5
D
29
E
24
±
14
M. Islas-Espinoza y R. Bojórquez-Aguilar
236
relacionadas entre 81.7 y 92.0 %
,
lo cual es limitado
para establecer una identifcación concluyente; sin
embargo, utilizando la clasifcación del sistema API
20E y analizando las características morFológicas de
cada cepa se incluye una identifcación presuntiva
con especies como
Bordetella, Alcaligenes, Moraxe-
lla
spp. y
Pantoea
spp. 4.
DISCUSIÓN
En el sitio identifcado como Lerma se encontró
una mayor variabilidad de especies resistentes a Cr,
probablemente por ser un sitio de los más contamina-
dos, ya que se encuentra aFectado por las descargas de
las plantas de tratamiento de la zona de Lerma y las
canalizadas por el río Atarasquillo, por lo que recibe
gran cantidad y diversidad de aportes bacterianos
y de contaminantes. En el sitio identifcado como
Tultepec se encontró la mayor cantidad de bacterias
resistentes a Cr
+6
dentro del grupo de bacterias selec-
cionadas. Esta especialización Funcional de las cepas
se debe tal vez a que esta zona se encuentra aFectada
por las descargas de zonas agrícolas como Zinacan-
tepec, que aportan mucha materia orgánica y las de
plantas industriales como las de San Mateo Atenco
cuya industria metal-mecánica domina la actividad
económica y, por tanto, hay una especialización en
descargas de metales. Estos cambios en la diversidad
bacteriana son resultado de los aportes de contami-
nantes que llegan al CARL. Por ejemplo, Chaerum
et
al.
(2010) determinaron que en suelos contaminados
con aguas residuales con elevadas concentraciones
de metales durante 31 años, la diversidad Funcional,
biomasa microbiana y la respiración aumentaron en
comparación con suelos no contaminados. Esto pudo
haber sucedido en los sitios donde la presencia de
Cr, compensado con los aportes de materia orgánica
ha inducido la especialización y la adaptación de
especies bacterianas resistentes.
CUADRO V.
CARACTERIZACIÓN MOR±OLÓGICA, ±ISIOLÓGICA Y BIOQUÍMICA DE LAS CEPAS
AISLADAS
Características
MorFológicas/fsiológicas/bioquímicas
Cepas bacterianas
A
B
C
D
E
±
Tinción de Gram
-
-
-
-
-
-
±orma celular
B
1
B
CB
2
B
B
B
Tamaño celular(
µm)
1
x
.75
1.75
x
1
2
x
.75
1.5
x
1
1
x
0.5
1
x
0.5
Borde
Entero
Rizado
Entero
Rizado
Lobado
Rizado
Movilidad
+
-
-
+
-
+
Crecimiento sobre agar MacConkey
+
+
+
+
-
+
Prueba indol
-
-
-
-
-
-
Producción de betagalactosidasa
-
-
-
+
-
-
Utilización de arginina
-
-
-
-
-
-
Utilización de lisina
-
-
-
-
-
-
Utilización de ornitina
-
-
-
-
-
-
Utilización de citrato
+
-
-
-
-
+
Utilización de urea
-
-
-
-
-
-
Utilización de triptóFano
-
-
-
-
-
-
Utilización de gelatina de Kohn
-
-
-
-
-
-
Utilización de glucosa
-
-
-
+
-
-
Utilización de manitol
-
-
-
+
-
-
Utilización de inositol
-
-
-
-
-
-
Utilización de sorbitol
-
-
-
+
-
-
Utilización de ramnosa
-
-
-
+
-
-
Utilización de sacarosa
-
-
-
-
-
-
Utilización de melibidiosa
-
-
-
-
-
-
Utilización de amigdalina
-
-
-
+
-
-
Utilización de arabinosa
-
-
-
+
-
-
Producción de H
2
S
-
-
-
-
-
-
Prueba oxidasa
-
-
-
-
-
-
No Fermentador spp.
90.7 %
3
88.3 %
87.6 %
90.7 %
Bordetella/Alcaligenes/Moraxella
spp.
87.5 %
83.1 %
Pantoea
spp. 4
86.9 %
1
B: Bacilar;
2
CB: Cocobacilar;
3
Porcentaje de certeza en la identifcación utilizando el sistema API 20E
BACTERIAS REDUCTORAS DE Cr
+6
Y SU POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO
237
De acuerdo con otros estudios (Donmez y Koc-
berber 2004, Bader
et al.
1999) el 80 % de las cepas
aisladas en esta investigación resultaron resistentes
a concentraciones superiores a 1000 mg L
–1
, sin
embargo, la CMI fue mayor a 250 mg L
–1
para todas
las cepas aisladas, a diferencia de la calculada por
Srinath
et al.
(2002) que reportan CMI superiores a
151 mg L
–1
sólo en el 13 % de las cepas que aislaron.
Considerando la concentración umbral inhibidora
sobre microorganismos heterótrofos para Cr
+6
(1 mg
L
–1
), las cepas aisladas resultaron todas resistentes.
Por lo tanto es factible aplicar las cepas aisladas en
sistemas de tratamiento de agua, por su resistencia
y capacidad de crecimiento aun en concentraciones
elevadas de Cr
+6
.
Las cepas resistentes a Cr
+6
: A, B
y F, fueron ca-
paces de reducir Cr
+6
a Cr
+3
. El resto de las cepas no
presentaron esta capacidad, ya que a pesar de tener
porcentajes de transformación positivos consideran-
do el sistema completo (bacterias+medio de cultivo)
estos resultaron menores que el medio de cultivo
sin inóculo. Por lo tanto, las cepas C, D y E,
fueron
resistentes a la presencia de Cr
+6
pero no pudieron
transformarlo.
En lo que concierne a la transformación de Cr
+6
,
algunos trabajos coinciden en una reducción de la
concentración de Cr
+6
en el sobrenadante entre 80-
98 %, con una fase estacionaria entre 24-48 h (Don-
mez y Kocberber 2004, Srinath
et al.
2002), a dife-
rencia de este estudio, en donde la fase estacionaria
se inició a las 168 h y la reducción mayor de Cr
+6
para la cepa F fue del 33.59 % a los 12 días. Esto
último puede atribuirse a las condiciones de cultivo,
ya que a diferencia de los estudios mencionados que
manejan temperaturas ±siológicas (alrededor de 38
ºC), en esta investigación se trabajó a temperatura
ambiente (18-20 ºC). Es importante señalar que el
medio de cultivo por sí mismo representó un medio
abiótico de reducción de Cr
+6
del 17.21%, el cual
fue sustraído del porcentaje de reducción de Cr
+6
de la cepa F. Para este caso la cantidad de biomasa
±nal no fue muy afectada por la presencia de conta-
minante en comparación con la biomasa generada sin
presencia del mismo, contrario a lo que encuentran
Srinath
et al.
(2002), donde existe una diferencia de
aproximadamente 50 % entre la biomasa con y sin
contaminante para las cepas
Bacillus megaterium
y
B. circulans
.
En este estudio la técnica de identi±cación bioquí-
mica vía API 20E fue limitada y no concluyente. En
este caso se sugiere realizar un análisis molecular que
ayude a con±rmar la identi±cación obtenida vía API
20E. Las características bioquímicas obtenidas en las
cepas aisladas en este estudio fueron distintas a las
de las bacterias reportadas como reductoras de Cr
+6
por otros autores, sin embargo, al igual que la pre-
sente investigación en varios estudios, las bacterias
identi±cadas capaces de resistir altas concentraciones
de Cr
+6
pertenecen a la familia Enterobacteriaceae
(Shakoori
et al.
1999, Guha
et al.
2001, Camargo
et
al.
2003, Aguilera
et al.
2004, Cheung y Gu 2007).
Esta familia de bacterias Gram negativas contiene
más de 100 especies que pueden tener morfología de
bacilos, cocobacilos y otros pleomór±cos. Los miem-
bros de esta familia forman parte de la microbiota del
intestino (llamados coliformes) y de otros órganos
del ser humano y de otras especies animales. Algu-
nas especies pueden vivir en tierra, en sedimentos,
plantas o en animales acuáticos. Son de fácil cultivo,
oxidasa negativos, es decir, carecen de la enzima
citocromo oxidasa, capaces de reducir nitrato en
nitrito, son anaeróbicos facultativos, fermentadores
de carbohidratos en condiciones anaeróbicas con o
sin la producción de gas, muchos géneros tienen un
²agelo que sirve para desplazarse, aunque algunos
géneros no son móviles. Adicional a ello, las Ente-
robacteriaceae no forman esporas, algunas producen
toxinas y pueden ser encapsuladas y son organismos
catalasa positivos. Son quimioautótrofos, y necesitan
para su crecimiento compuestos simples de carbono y
nitrógeno, generalmente sólo con D-glucosa, aunque
algunas requieren aminoácidos y vitaminas. La tem-
peratura óptima de crecimiento es entre 22 y 37 ºC.
Es importante señalar que al igual que las cepas
reportadas en varios estudios como resistentes a Cr
+6
(McLean
et al.
2000, Valls
et al.
2000, Aguilera
et al.
2004, Donmez y Kocberber 2004, Vaneechoutte
et
al.
2004), se encontraron únicamente bacilos Gram
negativos, esto puede deberse entre otros aspectos
metabólicos, a la resistencia de su doble membrana
celular ausente en las bacterias Gram positivas, así
como a la capacidad de agruparse en pares o cadenas,
común en los bacilos.
Respecto a las especies identi±cadas en este es-
tudio y a las encontradas por otros autores, Anderl
et
al
. (2000) demostraron la resistencia a antibióticos de
una biopelícula de
Klebsiella pneumoniae
formando
complejos con metales pesados entre los cuales se
encontraba el Cr
+6
. Filali
et al
. (1999) aislaron de
agua residual a las cepas
Pseudomonas aeruginosa,
Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis
y
Staphylo-
coccus,
bacterias que resultaron resistentes a metales
pesados y antibióticos. En esta línea de investigación,
Sultana
et al.
(2003), encontraron que las especies
Salmonella typhi
,
Klebsiella pneumoniae, Proteus
vulgaris
y
Streptococcus faecalis
fueron resistentes
M. Islas-Espinoza y R. Bojórquez-Aguilar
238
al complejo antibiótico-metal cefradina-cromo, estas
cepas fueron susceptibles a concentraciones superio-
res a 128 μg mL
–1
. Sharma
et al.
(2000) aislaron una
cepa de
Klebsiella
muy resistente al Cd con capacidad
de precipitarlo, por lo que se plantea a estos organis-
mos como potenciales agentes para biorremediación
de contaminación por metales pesados.
A pesar de las diferencias bioquímicas y mor-
fológicas coloniales, varias de las cepas analizadas
en este estudio resultaron ser de la misma especie,
esto se debe a la alta tasa de mutación presente en
bacterias, donde pequeñas diferencias en el material
genético, producto de las condiciones del medio am-
biente, pueden generar desde afectación en funciones
especíFcas hasta cambios metabólicos importantes.
Las especies identiFcadas en este estudio son am-
bientales, sapróFtas y epíFtas.
CONCLUSIONES
Seis cepas Gram negativas con diferentes carac-
terísticas morfológicas y bioquímicas fueron aisladas
de sedimentos de tres sitios del CARL. Cinco de estas
cepas fueron capaces de multiplicarse en concentra-
ciones de hasta 500 mg L
–1
de Cr
+6
y sobrevivir a
concentraciones de hasta 1,000 mg L
–1
. Estas cepas
resistentes a Cr
+6
presentaron una concentración mí-
nima inhibitoria mayor que la reportada en trabajos
similares sobre microorganismos heterótrofos.
Se determinó que estas cepas redujeron Cr
+6
a
Cr
+3
utilizando 200 mg L
–1
de Cr
+6
. La capacidad de
reducción de cada cepa en orden descendente fue: ±,
A, B, C, E y D. Se eligió la cepa ± para determinar
la cinética de transformación del Cr
+6
, obteniéndose
una reducción a Cr
+3
del 33.59 % a los 12 días. Es
importante señalar que el medio de cultivo por sí
mismo representó un medio abiótico de reducción
de Cr
+6
a Cr
+3
del 17.21 %.
La utilización del equipo API-20E fue útil en la
determinación de algunas reacciones bioquímicas
de las cepas, pero no resultó concluyente para la
identiFcación rápida de las bacterias encontradas en
el presente estudio. Por ello, se usarán métodos de
análisis molecular para una identiFcación más precisa
de las cepas.
En el sitio identiFcado como Lerma se encontró
la mayor variabilidad de especies resistentes a Cr
+6
.
En Tultepec se obtuvo la mayor cantidad de bacterias
reductoras de Cr
+6
a Cr
+3
. Dichas cepas presentan un
potencial biotecnológico en sistemas de tratamiento
de agua para reducción de Cr
+6
a Cr
+3
y en pruebas
para otros metales pesados.
AGRADECIMIENTOS
Se agradece al Laboratorio de Calidad del Agua
del Centro Interamericano de Recursos del Agua y
al Laboratorio de Biología Molecular del Centro de
Investigación de Estudios de Salud Animal por su
apoyo técnico.
REFERENCIAS
Aguilera S., Aguilar M.E., Chávez M.P., López-Meza J.E.,
Pedraza-Reyes M., Campos-García J. y Cervantes C.
(2004). Essential residues in the chromate transporter
ChrA of
Pseudomonas aeruginosa
. ±EMS Microb.
Let., 232, 107-112.
Anderl J.N., ±ranklin M.J. y Stewart P.S. (2000). Role
of antibiotic penetration limitation in
Klebsiella
pneumoniae
biofilm resistance to ampicillin and
cipro²oxacin. Antimicrob. Agen. Chemother. 44,
pp. 1818-1824.
APHA. American Public Health Association. (1998).
Standard Methods for the Examination of Water and
Wastewater.
20
a
ed. American Public Health Asso-
ciation, American Water Works Association,Water
Environmental ±ederation. Washington, DC., EUA.
1325 pp.
Ávila P. P., Balcázar M., Zarazúa G. O., Barceló I. Q. y
Díaz C. D. (1999). Heavy metal concentrations in water
and bottom sediments of a Mexican reservoir. Sci. Tot.
Env. 234, 185-196.
Bader J. L., Gonzalez G., Goodell P. C., Ali A.S. y Pillai
S. D. (1999). Chromium-resistant bacterial popula-
tions from a site heavily contaminated with hexavalent
chromium. Water Air Soil Pollut. 109, 263-779.
Brenner D. J., Krieg N.R. y Staley J.T. (2008).
Bergey’s
manual of systematic bacteriology.
2
a
ed. Springer.
Michigan, EUA. 1106 pp.
Camargo ±. A. O., Okeke B. C., Bento ±. M. y ±ranken-
berger W. T. (2003). In vitro reduction of hexavalent
chromium by a cell-free extract of
Bacillus sp.
ES 29
stimulated by Cu
2+
. App. Microb. and Biotech. 62,
569-573.
Chaerum S. K., Pangesti P. D., Toyota K. y Whitman W.
(2010). Changes in microbial functional diversity
and activity in paddy soils irrigated with industrial
wastewaters in Bandung, West Java Province, Indo-
nesia. Water Air Soil Pollut. DOI: 10.1007/s 11270-
010-0603-x.
Cheung K. H. y Gu J. D. (2007). Mechanism of hexavalent
chromium detoxiFcation by microorganisms and bio-
remediation application potential: a review. Int. Biod.
and Biod. 59, 8-15.
BACTERIAS REDUCTORAS DE Cr
+6
Y SU POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO
239
Colombo C., Khalil F., Amac M., Horht C. y Catoggio A.
(1990). The casual of the word toxic. Env. Sci. and
Tech. 24, 498-505.
Donmez G. y Kocberber N. (2004). Isolation of hexava-
lent chromium resistant bacteria from industrial saline
ef±uents and their ability of bioacumulation. Enz.
Microb. Tech. 36, 700-705.
Ehrlich H. L. (1986). Interactions of heavy metals and
microorganisms. En:
Mineral Exploration: Biologi-
cal Systems and Organic Matter
(D. Carlisle, Ed.).
Prentice-Hall. Englewood Cliffs. EUA, pp. 221-237.
EPA (2008). Designation of hazardous substances. Envi-
ronmental Protection Agency, U.S. Code of Federal
Regulations. 40 CFR 116.4. URL: http://www.epa.
gov/lawsregs/search/40cfr.html. Consultado en abril
24, 2009.
Fall C., Hinojosa-Peña A., Carreño-de-León M.C. (2007).
Design of a monitoring network and assessment of
the pollution on the Lerma river and its tributaries by
wastewaters disposal. Sci. Tot. Env. 373, 208-219.
FDA (2007). Beverages. Bottled water. Food and Drug
Administration, U.S. Code of Federal Regulations. 21
scripts/cdrh/cfdocs/cfcfr/CFRSearch.cfm. Consultado
en abril 24, 2009.
FDA (2008). EAFUS: A food additive database. Food and
Drug Administration, U.S. URL: http://vm.cfsan.fda.
gov/~dms/eafus.html. Consultado en abril 24, 2009.
Filali B.K., Taou²k J., Zeroual Y., Dzairi F.A.Z., Talbi M.
y Blaghen M. (1999). Waste water bacterial isolates
resistant to heavy metals and antibiotics. Curr. Microb.
41, 51-156.
Guha H., Jayachandran K. y Maurrasse F. (2001). Kinet-
ics of chromium (VI) reduction by a type strain
She-
wanella
alga
under different growth conditions. Env.
Pol., 115, 209-218.
IARC (2008). Agents reviewed by the IARC monographs:
Volumes 1-99.Agency for Research on Cancer. Lyon,
France: International Agency for Research on Cancer.
php. Consultado en abril 24, 2008.
McGrath S. P. y Smith S. (1990). Chromium and nickel.
En:
Heavy Metals in Soils
(B. J. Alloway, Ed.). Wiley.
Nueva York. EUA, pp. 125-147.
McLean J. S., Beveridge T. J. y Phipps D. (2000). Isolation
and characterization of a chromium-reducing bacte-
rium from a chromated copper arsenate-contaminated
site. Env. Microb. 2, 611-619.
Saxena D.K., Murthy R.C., Jain V.K. y Chandra S.V.
(1990). Fetoplacental-maternal uptake of hexavalent
chromium administered orally in rats and mice. Bull.
Environ. Contam. Toxicol. 45, 430-435.
SEMARNAT, INE, CONAGUA, CONAFOR, IMTA y
CONABIO. (2007). Diagnóstico socio-ambiental de
la subcuenca Antonio Alzate. Secretaría de Medio
Ambiente y Recursos Naturales, Instituto Nacional
de Ecología, Comisión Nacional del Agua, Comisión
Nacional Forestal, Instituto Mexicano de Tecnología
del Agua, Comisión Nacional para el Conocimiento y
Uso de la Biodiversidad.
Shakoori A. R., Tahseen S. y Haq R.U. (1999). Chromium-
tolerant bacteria isolated from industrial ef±uents and
their use in detoxi²cation of hexavalent chromium. F.
Microb. 44, 50-54.
Sharma P.K., Balkwill D.L., Frenkel A. y Vairavamurthy
M.A. (2000). A new
Klebsiella planticola
strain (Cd-1)
grows anaerobically at high cadmium concentrations
and precipitates cadmium sul²de. Appl Environ Mi-
crobiol. 66 3083-3087.
Srinath T., Verma T., Ramteke P.W. y Garg S.K. (2002).
Chromium (VI) biosorption and bioaccumulation by
chromate resistant bacteria. Chemosphere 48, 427-435.
Sultana N., Saeed A.M. y Afzal M. (2003). Synthesis and
antibacterial activity of cephradine metal complexes:
complexes with magnesium, calcium, chromium and
manganese. Pak. J. of Pharm. Sci. 16, 59-72.
Tchobanoglous G., Burton F. L. y Stensel H. D. (2003).
Wastewater Engineering Treatment and Reuse.
4a ed.
McGraw-Hill. Illinois, EUA. 1819 pp.
Valls M., Atrian S., Lorenzo V. y Fernández L.A. (2000).
Engineering a mouse metallothionein on the cell sur-
face of
Ralsonia eutropha
CH34 for immobilization
of heavy metals in soil. Nat. Biotech. 28, pp. 661-665.
Vaneechoutte M., Kampfer P., Baere T.D., Falsen E. y
Verschraegen G. (2004).
Wautersia
gen. nov., a novel
genus accommodating the phylogenetic lineage in-
cluding
Ralstonia eutropha
and related species, and
proposal of
Ralsonia
[Pseudomonas]
syzygii
comb.
nov. Int. J. Syst. Evol. Microb. 54, 317-327.
WHO (2000). Air quality guidelines. World Health Orga-
nization, 2a ed. Ginebra, Suiza. URL: http://www.euro.
who.int/document/aiq/6_4chromium.pdf. Consultado
en mayo 14, 2008.
WHO (2004). Guidelines for drinking-water quality. Vol.
1. Recommendations. World Health Organization,
3ra ed. Ginebra, Suiza. URL: http://www.who.int/
water_sanitation_health/dwq/gdwq3/en. Consultado
en marzo 08, 2006.
Zarazúa G.O. (2008). Evaluación de las contribuciones
naturales y antropogénicas de los metales pesados
Cr, Mn, Fe, Cu, Zn y Pb y su distribución en el agua
y sedimento en el curso alto del Río Lerma. Tesis de
Doctorado en Ingeniería. ININ, CIRA-UAEM.
logo_pie_uaemex.mx