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Red de Revistas Científicas de América Latina y el Caribe, España y Portugal
Rev. Int. Contam. Ambie. 28 (1) 7-16, 2012
RESPUESTA DE CRECIMIENTO Y TOLERANCIA A METALES PESADOS DE
Cyperus elegans
Y
Echinochloa polystachya
INOCULADAS CON UNA RIZOBACTERIA AISLADA DE UN SUELO
CONTAMINADO CON HIDROCARBUROS DERIVADOS DEL PETRÓLEO
Daniela LABRA-CARDÓN
1
, Leonor Angélica GUERRERO-ZÚÑIGA
3
,
Aída Verónica RODRÍGUEZ-TOVAR
2
, Silvano MONTES-VILLAFÁN
1
, Sandra PÉREZ-JIMÉNEZ
1
y
Angélica RODRÍGUEZ-DORANTES
1
*
1
Laboratorio Fisiología Vegetal, Departamento de Botánica, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, IPN,
Prol. Carpio y Plan de Ayala s/n. C.P.11340, México, D.F. *Correo electrónico: rodorantes@yahoo.com.mx
2
Laboratorio Micología Médica, Departamento de Microbiología, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas,
I.P.N., Prol. Carpio y Plan de Ayala s/n. C.P.11340, México, D.F.
3
Dirección de Seguridad y Medio Ambiente, Instituto Mexicano del Petróleo, Eje Central Lázaro Cárdenas
152, C.P. 07730, México, D.F.
(Recibido agosto 2010, aceptado septiembre 2011)
Palabras clave:
metales pesados, rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal,
Cyperus, Echinochloa
RESUMEN
Se ha demostrado que las interacciones benéfcas entre cultivos de plantas y bacte-
rias son útiles en la disminución de la toxicidad producida por metales, así como en
el aporte de nutrientes esenciales; por ello, las comunidades microbianas han sido
empleadas para la biorremediación, en particular las rizobacterias promotoras del
crecimiento (PGPR’s por sus siglas en inglés). Este estudio evaluó la respuesta del
crecimiento y la tolerancia a metales pesados de dos especies de plantas de pantano:
Cyperus elegans
y
Echinochloa polystachya
, inoculadas con una rizobacteria solubi-
lizadora de ±os±atos identifcada como
Bacillus
sp. y expuestas a cadmio (Cd) y zinc
(Zn). El crecimiento de ambas especies se ±avoreció en presencia de la rizobacteria;
sin embargo, las plántulas crecidas con los metales e inoculadas con la rizobacteria,
no mostraron di±erencias signifcativas en las variables de crecimiento, lo que sugiere
que su respuesta ante los metales está relacionada tanto con la dosis como con el
tiempo de exposición, así como con la tolerancia intrínseca de estas especies. No
obstante esto, la presencia de la rizobacteria mantuvo el crecimiento de las plántulas
de
C. elegans
ante los metales pesados, lo que podría estar asociado con un e±ecto
protector a las plántulas con la disminución de la toxicidad de ambos metales. Es
importante en±atizar la importancia de la investigación sobre la colonización de las
rizobacterias, no solamente en la espermos±era, sino también en las raíces de las
plántulas inoculadas con el incremento de la superfcie radical para la absorción de
metales, así como con el papel protector de las rizobacterias contra la toxicidad de
metales en el suelo, lo que permitirá establecer un mejor crecimiento y desarrollo de
especies vegetales para la estabilización, la revegetación y la remediación de suelos
contaminados con metales pesados.
Key words: heavy metals, plant growth promoting rhizobacteria,
Cyperus
,
Echinochloa
D. Labra-Cardón
et al.
8
ABSTRACT
The benefc interactions between cultures oF plants and bacteria have been demonstrated to
be useFul For the decrease oF toxicity produced by heavy metals and nutritional defciency.
With this, the microbial communities have been applied as tools For bioremediation,
particularly the plant growth promoting rhizobacteria (PGPR’s). This study evaluated
the growth response and tolerance to heavy metals oF two swamp plant species:
Cyperus
elegans
and
Echinochloa polystachya
, both inoculated with phosphate solubilizing rhi-
zobacteria
Bacillus
sp. exposed to cadmium (Cd) and zinc (Zn). The growth response oF
both species was Favored by the presence oF the rhizobacteria without metals; although,
the grown with both metals and inoculated with the rhizobactera metal tolerant did not
show a signifcant promotion oF their growth; this suggests that their response to the
metals are related with the doses and the exposition time and to the intrinsic tolerance
oF the plant species to these metals. Even these results, the presence oF the rhizobacteria
maintained the growth oF
C. elegans
seedlings exposed to the heavy metals assessment;
this could be associated with a plant protecting eFFect that diminishes the metal toxicity.
It is relevant to emphasize the research importance about the colonization by rhizobac-
teria not only at the spermosphere but also at the roots oF the inoculated seedlings with
the increase oF the radical surFace For the metals absorption and the protecting role oF
the rhizobacteria against the toxicity oF metals, that allows the establishment oF a better
growth and development oF plant species to the stabilization, vegetation recover and the
remediation oF contaminated soils with heavy metals.
INTRODUCCIÓN
El suelo, el agua superfcial y el agua subterránea
pueden ser contaminados con compuestos peligrosos
como consecuencia de actividades naturales (
e.g.
la
erosión y fltraciones salinas) y de actividades huma-
nas (
e.g.
industria, agricultura, tratamiento de aguas
residuales, construcciones y la minería) (Arthur
et
al.
2005). Dentro de los compuestos peligrosos que
son considerados como contaminantes de naturaleza
inorgánica se tiene a los metales pesados, nitratos,
FosFatos y ácidos.
Los metales pesados como plomo (Pb), arsénico
(As), cadmio (Cd), cobre (Cu), zinc (Zn), níquel (Ni)
y mercurio (Hg), se adicionan en Forma continua a los
suelos a través de actividades agrícolas, actividades
industriales, incineración y emisiones de los vehículos
(Khan 2005). Tanto el Cd como el Zn son elementos
que poseen propiedades ambientales y geoquímicas
similares; donde el procesamiento y la liberación sub-
secuente de Zn al ambiente se acompaña normalmente
por Cd (Kabata-Pendias y Pendias 1992). El Cd es
considerado un metal pesado que se libera al ambiente
como resultado de una gran variedad de actividades
antrópicas. No obstante que no es un elemento esencial
para las plantas, este metal se absorbe por las raíces
y se transporta hacia las hojas en muchas especies.
Por lo que altas concentraciones de éste ocasionan
toxicidad en las plantas por su alta movilidad (Arduini
et al.
2006, Singh
et al.
2006, Matusik
et al.
2008, Li
et al.
2009). Generalmente, causa daños en las hojas
produciendo clorosis y enrollamiento de las mismas;
así como también la disminución del crecimiento de
las raíces y el brote (Milone
et al.
2003, Xu
et al.
2008,
Tang
et al.
2009).
El Zn es considerado como un micronutriente
esencial para el crecimiento de las plantas; ya que es
un constituyente vital de varias enzimas metabólicas
(Saravan
et al.
2007), sin embargo también puede
ser muy tóxico cuando éste se presenta a una con-
centración excesiva (Küpper
et al.
2000, Clemens,
2006, Broadley
et al.
2007). El Zn se adiciona a las
plantas a través de Fertilizantes como ZnSO
4
que, en
los suelos, puede transFormarse a Formas insolubles
dependiendo de las condiciones edáfcas de los mis-
mos. Se menciona que la solubilización del Zn por
microorganismos es un proceso de suma importancia
para el aporte a las plantas de este micronutriente (Di
Simine
et al.
1998, ±asim
et al.
2002).
Un método alternativo para la recuperación de
suelos contaminados es la biorremediación que se
defne como la acción de microorganismos o de otros
sistemas biológicos para la degradación de agentes
contaminantes del ambiente, con el uso de métodos
in situ
y
ex situ
para eliminar la contaminación de
suelos (Kuiper
et al.
2004). La rizósFera se considera
como una interFase importante entre el suelo y la
planta, ya que desempeña un papel Fundamental en
el establecimiento de la biorremediación de suelos
contaminados. Entre los microorganismos rizosFéri-
RESPUESTA DE CRECIMIENTO Y TOLERANCIA A METALES PESADOS DE
Cyperus elegans
Y
Echinochloa polystachya
9
cos que están involucrados en las interacciones con
suelos contaminados con metales pesados, las bacte-
rias rizosféricas promotoras del crecimiento vegetal
denominadas PGPR (por sus siglas en inglés, Plant
Growth Promoting Rhizobacteria, término estableci-
do por Kloepper (1989)), tienen una atención especial
(Ma
et al.
2011). Se consideran microorganismos
que migran del suelo a la rizosfera de las plantas
y colonizan sus raíces (Kloepper y Schroth 1978);
actúan como agentes protectores contra diversos
patógenos, son consideradas como fertilizadores del
suelo por su capacidad para movilizar nutrientes,
producen Ftohormonas que modiFcan la Fsiología
de las plantas y también participan en el estableci-
miento de procesos simbióticos que son de extrema
importancia ecológica. Dentro de las PGPR´s exis-
ten bacterias pertenecientes a un gran número de
géneros bacterianos como
Azotobacter, Acetobacter,
Azospirillum, Burkholderia
,
Pseudomonas
y
Bacillus
(Tenuta 2003). El manejo biológico que implica el
uso de plantas y de su microbiota rizosférica aso-
ciada, ha generado mucho interés para remediar y
secuestrar sustancias peligrosas del ambiente (Zaidi
et al.
2006) y se ha utilizado como una herramienta
más para tratar sitios contaminados, en particular, con
metales pesados (Kuiper
et al.
2004, Wu
et al.
2006)
al favorecer el desarrollo de las plantas crecidas en
presencia de metales como Ni, Pb y Zn, al generar
un crecimiento radical mayor durante las primeras
etapas de su crecimiento (Glick
et al.
1998).
La promoción del crecimiento radical es uno de
los marcadores principales para medir los efectos
benéFcos de las PGPR (Glick
et al.
1995); ya que
las Ftohormonas que estimulan el crecimiento de
las plantas y que se producen por estas rizobacterias
dentro de la zona radical, incrementan la densidad y
la longitud de los pelos radicales. El establecimiento
rápido de las raíces, sea por elongación de las raíces
primarias o por la proliferación de raíces laterales y
adventicias, es ventajoso para las plántulas confor-
me incrementan su habilidad de anclaje al suelo, así
como el incremento en la superFcie de absorción de
agua y nutrientes de su ambiente, lo que potencia
su capacidad de sobrevivencia (Volkmar y Bremer
1998, Hariprasad
et al.
2009). Las asociaciones entre
plantas y microorganismos tolerantes a metales pe-
sados merecen una atención particular; ya que éstos
poseen el potencial para bioacumular metales de
ambientes contaminados o favorecen su movilización
e inmovilización, que en consecuencia incrementan
la absorción de éstos y favorecen el crecimiento de
las plantas, lo que ayuda a
la limpieza
de suelos
con metales pesados (Singh
et al.
2007, Glick 2010,
Ma
et al.
2011). Este estudio evaluó la respuesta del
crecimiento y de la tolerancia a metales pesados de
dos especies vegetales de pantano:
Cyperus elegans
L.
y
Echinochloa polystachya
H.B.K. inoculadas con
una rizobacteria solubilizadora de fosfato identiFcada
como
Bacillus
sp., las plántulas estuvieron expuestas
a Cd y Zn en sistemas hidropónicos.
MATERIALES Y MÉTODOS
Manejo e identifcación de la rizobacteria solubi-
lizadora de FosFatos de un suelo contaminado con
hidrocarburos derivados del petróleo
La cepa bacteriana empleada fue aislada de una
zona de un suelo contaminado con hidrocarburos
derivados del petróleo, cuya concentración de hi-
drocarburos de fracción ligera (HC±L) es de 90
ppm, de hidrocarburos de fracción media (HC±M)
de 100
ppm
y de hidrocarburos de fracción pesada
(HC±P) de 450 ppm. La rizobacteria aislada presentó
la propiedad de solubilizar fosfatos
in vitro
(datos
no mostrados) y su identiFcación por morfología
macroscópica de los aislados bacterianos se realizó
considerando aspectos convencionales como: morfo-
logía bacteriana, aFnidad tintorial y arreglo celular,
para lo cual se usó la técnica de tinción de Gram.
Para la identiFcación molecular de la rizobacteria
seleccionada, se llevó a cabo la ampliFcación del
gen completo que codiFca para el fragmento 16S
rDNA, cuya característica principal es el alto nivel
de conservación, por lo que se ha utilizado como un
marcador molecular efectivo para la identiFcación
y clasificación microbiana usando herramientas
moleculares y bioinformáticas. En este caso, se em-
plearon los iniciadores universales fD1 y rD1, que
fueron diseñados por Weisburg
et al
. (1991) para la
ampliFcación completa del gen de aproximadamente
1500 pb. Se obtuvo ADN genómico de cada aislado
bacteriano usando el método descrito por Allers
y Lichten (2000) y la ampliFcación del marcador
molecular 16S rDNA con la siguiente mezcla de
reacción: 50 ng de ADN genómico, 200 mM de
dNTPs, 3 mM de Mg
++
, 50 pmol de cada iniciador
y 2.5 U de la enzima Taq polimerasa (Invitrogene,
CA) en un volumen Fnal de 100 µL. Dicha mezcla
de reacción se sometió a las siguientes condiciones
de ampliFcación: una desnaturalización inicial de 5
minutos a 95 ºC, seguido de 30 ciclos a 95 ºC por 2
minutos, 42 ºC por 40 segundos y 72 ºC por 4 minutos;
Fnalmente, un ciclo de polimerización de 72 ºC por
20 minutos. Los productos de PCR fueron separados
por electroforesis en geles de agarosa al 1 % y teñidos
D. Labra-Cardón
et al.
10
con bromuro de etidio; estos productos se purifcaron y
se obtuvo la secuencia de nucleótidos (FES-Iztacala,
UNAM). Las secuencias resultantes, se compararon
con las secuencias reportadas en el banco de genes
disponible de la NCBI (National Center ±or Biote-
chnology In±ormation), utilizando la herramienta
BLAST con la fnalidad de conocer la similitud con
otras secuencias ya reportadas y tener, entonces, una
identifcación de la cepa bacteriana.
Evaluación de la promoción del crecimiento
vegetal y la determinación de la tolerancia a me-
tales pesados de
Cyperus elegans
y
Echinochloa
polystachya
El material vegetal se obtuvo a partir de la lim-
pieza y selección de semillas de
Cyperus elegans
L. (Cyperaceae) y
Echinochloa polystachya
H.B.K.
(Poaceae), provenientes de una de las zonas conta-
minadas del Pantano Santa Alejandrina situado en
las inmediaciones de la refnería Lázaro Cárdenas
del Río, en Minatitlán, Veracruz, ubicada dentro de
la planicie costera del sureste de México (N 17º 58′
12.7” y W 94º 30′ 52.2”) y colectadas en época de
verano y ambas especies en etapa de ²oración. Para
la evaluación de la promoción del crecimiento ve-
getal de estas especies se establecieron los cultivos
hidropónicos en ±rascos de vidrio con tapas magenta
(Sigma, Aldrich) usando 25 mL de medio mineral que
contenían las siguientes sales: 0.20M NH
4
H
2
PO
4
,
0.50M NH
4
NO
3
, 1.15M Ca(NO
3
)
2
, 0.26M CaCl
2
,
0.20M MgCl
2
·6H
2
O, 0.20M Mg(NO
3
)
2
·6H
2
O, 0.40M
MgSO
4
7H
2
O, 0.20M KH
2
PO
4
, 1.20M KNO
3
, 0.50M
K
2
SO
4
, 0.040M FeCl
3
·6H
2
O, 1.2 x 10
–2
M H
3
BO
3
, 1.2
x 10
–4
M CuCl
2
·H
2
O, 2.3 x 10
–3
M ZnCl
2
, 4.4 x 10
–4
M
MnCl
2
·4H
2
O, 6 x 10
–6
M Na
2
MoO
4
·H
2
O, EDTA y
FeSO
4
·7H
2
O, con un pH= 6, con la adición de agar
bacteriológico al 6 % (medio mineral blando).
Una colonia del aislado bacteriano (rizobacteria
XIII) se resuspendió en 5 mL de agua destilada estéril
para obtener un inóculo de 3.5
x
10
7
UFC/mL, con
esta suspensión se inocularon semillas por separado
de
C. elegans
y de
E. polystachya
, previamente des-
in±ectadas con 10 mL de alcohol al 70 % durante 3
minutos y con 10 mL de hipoclorito de sodio al 10 %
durante 5 minutos, enjuagando cinco veces con agua
destilada estéril. Las semillas de ambas especies se
dejaron embebidas por 30 minutos en la suspensión
bacteriana preparada. También se embebieron semi-
llas de ambas especies (previamente desin±ectadas)
en agua destilada estéril por 30 minutos, antes de co-
locarlas sobre la superfcie del medio mineral blando.
Se evaluó tanto la promoción del crecimiento
vegetal por
Bacillus
sp. en los experimentos como
también el indicio de la tolerancia que confrió este
aislado al incrementar el crecimiento vegetal bajo la
presencia de los metales pesados seleccionados: Cd
(3CdSO4•8H2O: 0.01, 0.05 y 0.1 mM) y Zn (ZnCl2:
3, 4 y 5 mM), con experimentos con y sin la adición
de los contaminantes. La siembra de las semillas en
el medio mineral blando y con los tratamientos, se
realizó bajo condiciones de esterilidad; los cultivos
con el material seminal se mantuvieron en un cuarto
de incubación bajo condiciones controladas de tem-
peratura (+/–36 ºC) y ±otoperíodo (12:12), por 45
días. El número de semillas por experimento ±ue de
60 y los ensayos se realizaron por triplicado.
Una vez concluido el tiempo de incubación de los
cultivos, se extrajeron las plántulas obtenidas de cada
experimento para la medición de la longitud ±oliar y
radical tanto de las plantas inoculadas como las plan-
tas sin inocular y con metales pesados. Los resultados
obtenidos se consideraron para la determinación del
índice de tolerancia (IT) (Wilkins 1978, Burd
et al.
1998), por la expresión: IT = LR
m
/ LR
c
, donde: LR
m
es la longitud radical de las plántulas que crecieron
en presencia del metal específco adicionado y LR
c
es la longitud radical de las plántulas crecidas en
ausencia del metal, lo mismo con la longitud ±oliar.
Se consideraron también los experimentos de ambas
especies con y sin el inóculo bacteriano. Todos los
valores de IT se multiplicaron por 100 para obtener
los porcentajes de crecimiento. A todos los resultados
obtenidos se les aplicó el análisis de varianza (ANO-
VA) y laprueba de Tukey-Kramer de comparación
múltiple, empleando el paquete estadístico GraphPad
InStat, V2.03 (Aceves 1993).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Caracterización e identifcación de la rizobacte-
ria solubilizadora de FosFato aislada de un suelo
contaminado con hidrocarburos derivados del
petróleo
De 23 aislados bacterianos que se obtuvieron del
suelo rizos±érico contaminado con hidrocarburos
derivados del petróleo se seleccionó a la rizobacteria
XIII que es una bacteria solubilizadora de ±os±ato.
La mor±ología microscópica de la rizobacteria ±ue
la de un bacilo corto Gram positivo esporulado. De
los resultados de su análisis molecular, la búsqueda
y alineamiento de las secuencias amplifcadas del
gen 16S rDNA con las secuencias incluidas en el
banco de genes, se obtuvo como resultado un alto
porcentaje de similitud (89 %) con el género
Baci-
llus
sp. Para la asignación taxonómica al nivel de
RESPUESTA DE CRECIMIENTO Y TOLERANCIA A METALES PESADOS DE
Cyperus elegans
Y
Echinochloa polystachya
11
especie, con base en la comparación de secuencias
de este gen, se debe guardar una similitud mayor
al 97.5 %; mientras que para la identifcación a ni-
vel de género se requiere del 85 hasta el 95 % con
la mejor secuencia relacionada (Rossello-Mora y
Amman 2001). En este caso, las características de
la morFología microscópica y el comportamiento
Gram, también lo corroboraron.
Promoción del crecimiento de
Cyperus elegans y
Echinochloa polystachya
con la inoculación de la
rizobacteria
El análisis de las interacciones entre plantas y
microorganismos rizosFéricos benéfcos ha mostrado
que éstos incrementan la producción de biomasa y
la tolerancia de las plantas a metales pesados, dando
lugar a considerarlos como componentes importantes
de las tecnologías de ftorremediación (Wenzel
et al.
1999, Glick 2003). Las rizobacterias promotoras del
crecimiento de vida libre, así como las simbiontes
pueden mejorar la nutrición de las plantas y el cre-
cimiento, la competitividad vegetal y las respuestas
a los Factores de estrés externos (Burd
et al
. 2000,
Egamberdiyeva y Ho±ish 2004, Mantelin y Touraine
2004).
La rizobacteria XIII, identifcada como
Bacillus
sp. que se empleó para la inoculación de semillas
de
C. elegans
y
E. polystachya
promovió el creci-
miento tanto radical como Foliar de las plantas. En
particular, la promoción del crecimiento radical en
C. elegans
(633 % ² 628.8) comparada con la pro-
moción radical de
E. polystachya
(95.4 % ² 89.6) y
la promoción del crecimiento Foliar en las plántulas
de
C. elegans
(166.2 % ² 115.3 ) y de
E. polystachya
(116 % ² 100.4), en ambos casos, comparando con el
crecimiento de las plántulas testigo sin inocular. Esta
respuesta evidenció la relación sinérgica entre esta
bacteria y las especies vegetales consideradas en es-
tos bioensayos. Es importante mencionar que dentro
de los mecanismos involucrados en la interacción de
plantas y microorganismos, la colonización exitosa
de una PGPR como inoculante es un requerimiento
para promover el crecimiento vegetal (Compant
et
al.
2010). Esta colonización puede ocurrir sobre la
superfcie completa de algunas células rizodérmicas y
las bacterias pueden establecerse como microcolonias
o biopelículas (Benizri
et al.
2001). En este caso, la
colonización en la espermosFera de las semillas de
estas dos especies resultó un primer evento importan-
te en la promoción del crecimiento de las plántulas.
Efecto causado por la rizobacteria
Bacillus
sp.
sobre el crecimiento de las plántulas de
Cyperus
elegans
y
Echinochloa polystachya
expuestas a Cd
La respuesta de ambas especies ante la presencia
de Cd, en general mostró que son poco tolerantes a las
concentraciones de Cd empleadas; el eFecto Fue inhi-
bitorio a medida que se incrementó la concentración
del metal con respecto a las plántulas testigo (
Figs.
1a
y
1b
) y, en particular, la respuesta de las plántulas
de
E. polystachya
presentó un eFecto inhibitorio total
en la concentración más alta de Cd por lo que, no se
reporta respuesta en este ensayo. Sin embargo, para las
plántulas de
C. elegans
, la concentración de 0.01 mM
de Cd promovió el crecimiento radical en un 289 %
(² 254) más que las plántulas testigo, lo que sugiere
que este metal pudiera promover el crecimiento de las
plántulas, comportamiento muy similar al obtenido
por Yang
et al.
(2004) con plantas de
Sedum alfredii
Hance (Crassulaceae) y
Arabis paniculata
³ranchet
(Brassicaceae) (Tang
et al.
2009), donde se observó
un eFecto estimulante al incrementar la biomasa de
estas especies expuestas a Cd. Estos hechos sugieren
que ciertos metales sin importar si son benéfcos o
Fig. 1.
EFecto de la
presencia de cadmio (Cd) en la longitud Foliar (cm) y en la longitud radical (cm) de plantas de a)
Cyperus elegans
y
b)
Echinochloa polystachya
, inoculadas con la rizobacteria
Bacillus
sp. XIII (rb) (
* =
p < 0.05, ** = p < 0.01, *** = p < 0.001)
Longitud radical
Longitud foliar
7
6
4
cm
3
2
1
0
Testigo
rb
Cd
0.01mM
rb + Cd
0.01 mM
Experimentos
1a
Cd 0.05M
rb + Cd
0.05 mM
Cd 0.1mM
rb + Cd
0.1 mM
5
20
18
12
cm
10
8
6
4
2
0
Testigo
rb
Cd 0.01 mM
rb + Cd
0.01 mM
Experimentos
1b
rb + Cd
0.05 mM
16
14
Cd 0.05 M
D. Labra-Cardón
et al.
12
tóxicos, pueden en cierta medida ser estimuladores
del crecimiento.
Se han desarrollado algunos estudios que implican
el análisis del efecto de las PGPR tolerantes a me-
tales sobre el crecimiento de plántulas en presencia
de metales pesados; dentro de ellos, la aplicación
del bioensayo de la medición de la promoción de la
elongación radical, conocido como PREP (Plant Root
Elongation Promotion), basado en la evaluación de
la actividad promotora del crecimiento radical de
las plántulas como indicador del efecto de acción
sinérgica entre la rizobacteria y la plántula (Dell’
Amico
et al.
2008).
La actividad PREP de
Bacillus
sp. sobre el
crecimiento de las plántulas de
C. elegans
en pre-
sencia de Cd, mostró que este aislado es tolerante
a las concentraciones de Cd probadas y favoreció
su crecimiento comparado con las plántulas de
E. polystachya
(
Figs. 1a
y
1b
). No se mostró una
diferencia signiFcativa para el crecimiento radical
(ns, p>0.05) pero sí con el crecimiento foliar de las
plantas inoculadas con y sin Cd (*** = p< 0.001, **
= p< 0.01, * = p< 0.05); caso que podría ser compa-
rable con el reportado en la literatura donde algunas
bacterias promueven el crecimiento de
Brassica
juncea
(L.) Coss y
Brassica napus
L. (Brassica-
ceae) ante la presencia de este metal (Belimov
et al.
2005, Sheng y Xia 2006). Una alta concentración
elevada de Cd para las plantas puede producir un
efecto severo sobre el crecimiento radical y como
consecuencia, dar como resultado el daño en la raíz,
la reducción de los pesos fresco y seco de la planta;
así como también la reducción en la absorción de
agua y nutrientes (Singh y Tewari 2003). Para estas
especies, la concentración empleada de Cd resultó
tóxica, no obstante que es tolerable para la rizo-
bacteria empleada (resultados no mostrados aquí).
Efecto causado por la rizobacteria
Bacillus
sp.
sobre el crecimiento de las plántulas de
Cyperus
elegans
y
Echinochloa polystachya
expuestas a Zn
La respuesta general de
C. elegans
y de
E. polys-
tachya
, ante la presencia de Zn, mostró que también
en este caso, al igual que con el Cd, el crecimiento
tanto radical como foliar, en ambas especies, dismi-
nuyó a medida que se incrementó la concentración
de Zn en los bioensayos (
Figs. 2a
y
2b
). Es decir,
estas especies vegetales tampoco toleran estas con-
centraciones de Zn en el medio, lo que evidencia que
un exceso del micronutriente ocasiona daños en el
desarrollo de éstas; como la apariencia de clorosis y
marchitamiento. Aquí, el efecto de la presencia de Zn
en el cultivo hidropónico a la concentración de 3 mM,
potenció ligeramente el desarrollo de las plántulas de
C. elegans
comparadas con las plántulas testigo, al
igual que en el caso del Cd. Esta respuesta, aunque a
la concentración más baja de exposición, resultó muy
similar en su conjunto a la que presentaron plantas de
A. paniculata
±ranchet expuestas a los dos metales
(Tang
et al.
2009). Se menciona que este fenómeno
es similar al proceso denominado hormesis que es
un término comúnmente utilizado en la toxicología
para referirse a los efectos estimulantes a bajos nive-
les de exposición ante agentes tóxicos (±orbs 2000,
Roosens
et al.
2003). Tang
et al.
(2009) sugieren que
la línea de unión y diferencia entre la hormesis y el
efecto estimulador del crecimiento inducido por la
presencia de Cd y Zn en su estudio con
A. paniculata
±ranchet, al igual que la presente investigación, no
está del todo completamente claro, este es el mismo
caso observado de la respuesta positiva de exposición
a estos dos metales en las raíces de
Thlaspi caeru-
lescens
L.
(Brassicaceae) en un suelo heterogéneo
(Schwartz
et al.
1999, Whiting
et al.
2000, Schwartz
et al.
2003), donde la concentración de Cd dio una
Fig. 2.
Efecto de la
presencia de zinc (Zn) en la longitud foliar (cm) y en la longitud (cm) radical de plantas de a)
Cyperus elegans
y
b)
Echinochloa polystachya
, inoculadas con la rizobacteria
Bacillus
sp. XIII (rb) (
* =
p < 0.05, ** = p < 0.01)
Longitud radical
Longitud foliar
7
6
4
cm
3
2
1
0
Testigo
rb
Zn 3 mM
rb + Zn
3 mM
Experimentos
2a
Zn 4mM
rb
Zn
4 mM
Zn 5 mM
rb + Zn
5 mM
5
20
18
12
cm
10
8
6
4
2
0
Testigo
rb
rb + Zn
3 mM
Zn 3 mM
Zn 4 mM
rb + Zn
4 mM
Experimentos
2b
rb + Zn
5 mM
16
14
Zn 5 mM
RESPUESTA DE CRECIMIENTO Y TOLERANCIA A METALES PESADOS DE
Cyperus elegans
Y
Echinochloa polystachya
13
respuesta similar a la exposición con Zn.
La presencia de la rizobacteria
Bacillus
sp. no
causó incremento en el desarrollo particular de las
plántulas de
C. elegans
expuestas a Zn, ya que el cre-
cimiento radical y foliar, en general, no es diferente al
obtenido por las plántulas expuestas a Zn a las con-
centraciones probadas de 3, 4 y 5 mM, concentracio-
nes a las que la rizobacteria es tolerante; sin embargo,
se presentó una diferencia signiFcativa al compararla
con las plántulas inoculadas y los tratamientos con los
metales (* = p< 0.05, ** =p< 0.01). Al igual que con
la presencia de Cd, el Zn mantuvo el crecimiento de
las plántulas de
C. elegans
, atenuando el efecto de las
concentraciones de ambos metales a las cuales fueron
expuestas (
Figs. 2a
y
2b
). Al igual que para las plántu-
las de
E. polystachya
inoculadas con esta rizobacteria,
su efecto de la promoción del crecimiento en estas dos
especies vegetales en las concentraciones más bajas de
los metales pesados probados, pudo estar relacionado
con la síntesis de Ftohormonas y la biodisponibilidad
de minerales en el medio de cultivo en interacción con
las plantas (Jacobson
et al.
1994, Glick
et al
. 1998,
Gupta
et al
. 2002).
Evaluación de la promoción del crecimiento
vegetal y la determinación de la tolerancia a me-
tales pesados de
Cyperus elegans
y
Echinochloa
polystachya
en presencia de la rizobacteria
Baci-
llus
sp. XIII
±inalmente, el efecto medido de la presencia de
ambos metales sobre el crecimiento de estas dos espe-
cies con referencia a las plántulas testigo sin metales
y sin inocular, se evaluó en términos del porcentaje
del crecimiento obtenido, donde un crecimiento
mayor del 100 % hace referencia al incremento de
ellas en más del 100 % del testigo comparado. En
ambas especies, la tolerancia a la presencia de los
metales, también fue determinada en función de su
crecimiento, donde para el caso del Cd, las plántulas
de
C. elegans
presentaron un incremento en el desa-
rrollo radical (con 289 y 175 %, respectivamente) a
las concentraciones de 0.01 y 0.05 mM (
Cuadro I)
.
La inoculación con la rizobacteria promovió el
crecimiento radical de
C. elegans
en 139 % más que
el testigo, con la exposición a la concentración de Cd
de 0.01 mM; disminuyendo éste a las otras dos con-
centraciones del metal. En las plántulas inoculadas
el crecimiento foliar fue menor al testigo, lo mismo
para
E. polystachya
(menor al 60 %).
En la exposición de las plántulas al Zn, también
se obtuvo un porcentaje de desarrollo radical ma-
yor al testigo a la concentración de 3 mM, para
C.
elegans
de 154 % manteniendo su crecimiento a las
concentraciones de 4 y 5 mM en un 23 % en pro-
medio, tanto foliar como radical. Lo que no ocurrió
con
E. polystachya
, que tuvo porcentajes muy bajos
de crecimiento de las plántulas (menores al 17 %)
(
Cuadros I
y
II
).
CUADRO I.
PORCENTAJE DEL CRECIMIENTO DE
PLÁNTULAS DE
Cyperus elegans
EXPUES-
TAS A CADMIO (Cd) Y ZINC (Zn)
Experimentos:
% de crecimiento
radical*
% de crecimiento
foliar*
Plantas expuestas a Cadmio sin inocular
Cd 0.01 mM
389 ² 354
87.6 ² 56
Cd 0.05 mM
275 ² 427
57.3 ² 35
Cd 0.1 mM
23 ² 40
9 ² 15
Plantas expuestas a Cadmio inoculadas con
Bacillus
sp.
rb + Cd 0.01 mM
239 ² 163
81.7 ² 36
rb + Cd 0.05 mM
51 ² 1.7
41.3 ²
8
rb + Cd 0.1 mM
11.6 ² 20
7 ² 12
Plantas expuestas a Zinc sin inocular
Zn 3 mM
254 ² 166
100.6 ² 45
Zn 4 mM
125 ² 136
61.3 ² 35
Zn 5 mM
122 ² 105
42.3 ² 25
Plantas expuestas a Zinc inoculadas con
Bacillus
sp.
rb + Zn 3 mM
149 ² 114
90.3 ² 37
rb + Zn 4 mM
78 ² 69
59 ² 37
rb + Zn 5 mM
93 ² 64
45 ² 24
* no se encontraron diferencias signiFcativas entre los trata-
mientos (p>0.05)
CUADRO II.
PORCENTAJE DEL CRECIMIENTO DE
PLÁNTULAS DE
Echinochloa polystachya
EXPUESTAS A CADMIO (Cd) Y ZINC (Zn)
Experimentos:
% de crecimiento
radical*
% de crecimiento
foliar*
Plantas expuestas a Cadmio sin inocular
Cd 0.01mM
71 + 70
41 + 41
Cd 0.05mM
42 + 37
14 + 13
Plantas expuestas a Cadmio inoculadas con
Bacillus
sp.
rb + Cd 0.01mM
69 + 74
45 + 43
rb + Cd 0.05mM
30 + 52
9 + 16
Plantas expuestas a Zinc sin inocular
Zn 3mM
15 + 20
15 + 13
Zn 4mM
11 + 14
14 + 12
Zn 5mM
9 + 16
8 + 13
Plantas expuestas a Zinc inoculadas con
Bacillus
sp.
rb + Zn 3mM
14 + 17
17 + 20
rb + Zn 4mM
9 + 15
7 + 12
rb + Zn 5mM
9 + 13
6 + 10
* no se encontraron diferencias signiFcativas entre los trata-
mientos (p>0.05)
D. Labra-Cardón
et al.
14
En ambos casos, la inoculación con la rizobacteria
Bacillus
sp. promovió una respuesta del crecimiento
en ambas especies, en particular notable en las plán-
tulas de
C. elegans
sin la adición del metal, con la
misma respuesta de promoción en la concentración
mas baja de Cd y Zn. Así mismo, las plántulas man-
tuvieron su crecimiento en las otras dos concentracio-
nes de ambos metales, con lo que esta especie resultó
más tolerante al efecto tóxico de estos metales que
E. polystachya
con un crecimiento menor.
Dell’ Amico
et al.
(2008) mencionan que entre
más propiedades posee una PGPR (producción de
sideróforos, solubilización de fosfato y producción
de Ftohormonas), éstas la harán un inoculante reco-
mendable; no obstante que no todas sus propiedades
se expresen en un tiempo o etapa determinada del
crecimiento vegetal, lo que varía también depen-
diendo de la cepa bacteriana y del patrón de creci-
miento a evaluar (Belimov
et al.
2001, 2005). En este
estudio, el manejo del bioensayo de la promoción
de la elongación radical (PRP) evidenció que en la
germinación y el establecimiento de las plántulas, la
relación sinérgica entre la rizobacteria y las plántulas
fué exitosa dado su efecto colonizador y promontorio
del crecimiento vegetal.
CONCLUSIONES
Las plantas de
Cyperus elegans
y de
Echinochloa
polystachya
crecidas en presencia de los metales Cd
y Zn e inoculadas con la rizobacteria
Bacillus
sp.
XIII y tolerante a estos metales, no mostraron una
promoción signiFcativa de su crecimiento. Esto su-
giere que la respuesta ante la presencia de los metales
está relacionada estrechamente tanto con la dosis
como con el tiempo de exposición de las plantas a
los contaminantes, no obstante que la presencia de
las rizobacteria mantuvo el crecimiento de las plantas
de
C. elegans
ante los metales pesados probados.
Esto podría estar asociado con un efecto protector
a la planta con la disminución de la toxicidad de
ambos metales. Es importante enfatizar la importan-
cia de la investigación sobre la colonización de las
rizobacterias, no solamente en la espermosfera, sino
también en las raíces de las plantas inoculadas con el
incremento de la superFcie radical para la absorción
de metales, así como en el papel protector de las
rizsobacterias contra la toxicidad de metales, lo que
permite establecer un mejor crecimiento y desarrollo
de especies vegetales para la estabilización, la reve-
getación y la remediación de suelos contaminados
con metales pesados.
AGRADECIMIENTOS
Se agradece a la Secretaría de Investigación y
Posgrado del IPN, el apoyo Fnanciero otorgado al
Proyecto SIP: 20080061, para la realización de este
trabajo.
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