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Red de Revistas Científicas de América Latina y el Caribe, España y Portugal
ESTABLECIMIENTO Y RESPUESTAS FISIOLÓGICAS DE LA SIMBIOSIS
Rhizobium tropici-
Leucaena leucocephala
EN PRESENCIA DE FENANTRENO Y NAFTALENO
Carlos LÓPEZ-ORTIZ
1
, Ronald FERRERA-CERRATO
1
, Alejandro ALARCÓN
1*
, Juan José ALMARAZ
1
,
Esperanza MARTÍNEZ-ROMERO
2
y Ma. Remedios MENDOZA-LÓPEZ
3
1
Área de Microbiología. Postgrado de Edafología. Colegio de Postgraduados. Carretera México-Texcoco km
36.5. Montecillo 56230, Estado de México
2
Centro de Ciencias Genómicas, UNAM. Av. Universidad s/n Col. Chamilpa Cuernavaca 62210, Morelos
3
Unidad de Servicios de Apoyo en Resolución Analítica (SARA). Universidad Veracruzana. Dr. Luis Castelazo
Ayala s/n. Col. Industrial Animas Xalapa 91190, Veracruz
* Autor responsable; aalarconcp@gmail.com
(Recibido mayo 2012, aceptado agosto 2012)
Palabras claves: nodulación, HAP, ftotoxicidad, antioxidantes totales, Fenólicos, clorofla
RESUMEN
Este estudio evaluó el establecimiento de la simbiosis entre
Rhizobium tropici
CIAT899
y
Leucaena leucocephala
(Lam.) en sistemas contaminados con naftaleno (NAF) y
fenantreno (FEN) y la respuesta de la planta con el contenido de compuestos fenólicos
totales (C±T), actividad antioxidante total (AAT) y contenido total de cloroflas (Clo
-
roT) y carotenos (CaT). A los 31 días, el NAF tuvo efectos negativos en la formación
de nódulos, retardando su aparición hasta el día 25 en presencia de 100 mg/L. Ante 20
mg FEN/L, las plantas de
L. leucocephala
no mostraron diFerencias signifcativas en
la formación de nódulos con respecto al testigo, mientras que a 60 y 100 mg FEN/L
la nodulación disminuyó signifcativamente en 52 %. La inoculación con
R. tropici
incrementó el peso seco total (PST) hasta en 150 % comparado con las plantas no ino
-
culadas. El C±T en hoja Fue signifcativamente mayor en los tratamientos no inoculados
en comparación con aquellos inoculados con
R. tropici
y signifcativamente mayor
ante FEN que con NAF. Para ambos contaminantes, la concentración de 100 mg/L
produjo mayor CFT y AAT en comparación con 20 y 60 mg/L. Para el caso de raíz,
los tratamientos sin contaminantes en ausencia de
R. tropici
presentaron mayor CFT y
AAT. Para los nódulos, la AAT incrementó signifcativamente ante NA±, mientras que
ante ±EN disminuyó. El NA± o el ±EN redujeron signifcativamente el contenido de
CloroT, el cual Fue signifcativamente mayor en plantas con
Rhizobium
en comparación
con las plantas no inoculadas. El contenido de CaT en plantas no inoculadas incrementó
en presencia de NAF y FEN.
Key words: nodulation, PAH, phytoxicity, total antioxidants, phenolics, chloroplyll
ABSTRACT
This study evaluated the establishment of the symbiosis between
Rhizobium tropici
CIAT899 and
Leucaena leucocephala
(Lam.) under contaminated systems with naph-
talene (NAF) and phenanthrene (FEN), as well as the physiological plants responses
Rev. Int. Contam. Ambie. 28 (4) 333-342, 2012
C. López-Ortiz
et al.
334
such as total content of phenolic compounds (CFT), total antioxidant activity (AAT) and
the content of chlorophylls (CloroT) and carotenoids (CaT). After 31 days, NAF had
more signifcant negative eFFects on nodulation by delaying the Formation oF nodules
until the day 25 at 100 mg/L. In the presence of 20 mg FEN/L,
L. leucocephala
plants
did not show signifcant diFFerences on the number oF nodules when compared to the
control, while nodulation decreased 52 % at 60 and 100 mg ±EN/L. Inoculation with
R.
tropici
resulted in signifcant increases oF PST (>150 %) in comparison to non-inoculated
plants. The Foliar content oF C±T was signifcantly greater at non-inoculated treatments
in respect to those with
R. tropici
, and signifcantly higher in plants exposed to ±EN than
NAF. For both hydrocarbons, the concentration of 100 mg/L resulted in greater CFT and
AAT when compared to 20 or 60 mg/L. For roots, treatments without contamination and
R. tropici
had more content oF C±T and AAT. The AAT in nodules signifcantly increased
due to NA±, while a signifcant reduction was observed in ±EN treatments. Either
NA± or ±EN did not signifcantly aFFect the content oF CloroT, although this content
was signifcantly greater in plants with
R. tropici
than non-inoculated plants. The CaT
content signifcantly increased at non-inoculated plants exposed to NA± and/or ±EN.
INTRODUCCIÓN
Las leguminosas (familia Fabaceae) son impor-
tantes en los agroecosistemas ya que incrementan la
Fertilidad de los suelos a través de la fjación sim
-
biótica del nitrógeno atmosférico (Almaraz-Suárez
y Ferrera-Cerrato 2007), la cual se lleva a cabo en
estructuras especializadas denominadas nódulos,
que se desarrollan en la raíz de estas plantas (Lloret
y Martínez-Romero 2005). Además, la simbiosis
Rhizobium
-leguminosa favorece la asimilación de
N en estas plantas, por lo que son más competitivas
en suelos con baja fertilidad. Esta característica de
las leguminosas puede ser benéfca en suelos con
-
taminados con hidrocarburos, donde hay limitada
disponibilidad de N para el crecimiento de microor-
ganismos que degradan estos compuestos orgánicos
(Ferrera-Cerrato
et al
. 2007).
Los hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP)
son encontrados en suelos de sitios industriales a muy
altas concentraciones y su acumulación es debida a
su baja solubilidad y sus propiedades recalcitrantes
(Wilson y Jones 1993). El problema que represen-
tan estos compuestos en los sistemas biológicos se
relaciona con su alto grado de toxicidad y por sus
características carcinogénicas y mutagénicas (Ed-
wards 1983).
La efectividad de algunas plantas en la remedia-
ción de suelos contaminados con HAP ha sido descri-
ta (Binet
et al
. 2000, Muratova
et al
. 2003), aunque
el efecto de las leguminosas arbóreas como
Leucaena
leucocephala
y su simbiosis con rizobios ha recibido
poca atención. Por ejemplo, la contaminación del
suelo con fenantreno (1000 mg/kg) incrementa el
número de nódulos activos en
Trifolium pratense
(Chiapusio
et al
. 2007); mientras que en
Phaseolus
vulgaris
, este hidrocarburo reduce signifcativamente
la nodulación (González-Paredes
et al
. 2007). El
estudio de respuestas fsiológicas de leguminosas
arbóreas ante HAP es importante desde el punto
de vista ecológico, pues estas plantas forman islas
de fertilidad, incrementan el contenido de materia
orgánica en el suelo y pueden proveer refugio a la
²ora y a la Fauna (NAS 1997).
En las plantas, el efecto tóxico de los HAP puede
relacionarse con un incremento en la producción de
especies reactivas de oxígeno (ROS, por sus siglas
en inglés), que incluyen el H
2
O
2
, el O
2
2–
y HO
, las
cuales pueden servir como moléculas de señaliza-
ción y como subproductos citotóxicos (Liu
et al
.
2009). Sin embargo, existe poca información sobre
las respuestas fsiológicas de sistemas simbióticos
(planta y microorganismo) en presencia de HAP.
Por lo anterior, este trabajo evaluó el efecto de dos
HAP (naftaleno –NAF– y fenantreno –FEN–) en el
establecimiento de la simbiosis
Rhizobium tropici-
Leucaena leucocephala
y la respuesta de parámetros
fsiológicos en hojas, raíz y nódulos.
MATERIALES Y MÉTODOS
Semillas de
Leucaena leucocephala
(Lam.) fueron
escarifcadas con H
2
SO
4
al 90 % durante 15 minutos y
posteriormente, desinfectadas con NaClO por 10 mi-
nutos y germinadas en agar-agua al 1 %. A los cinco
días después de la germinación, las plántulas fueron
transferidas a una bolsa “Growth Pouch” con 40 mL
de solución nutritiva de Fahraeus (Fahraeus 1957)
contaminada con naftaleno (NAF) o con fenantreno
SIMBIOSIS
Rhizobium tropici-Leucaena leucocephala
EN PRESENCIA DE FENANTRENO Y NAFTALENO
335
(FEN). Cada hidrocarburo fue disuelto en acetona y
aplicado a la solución de Fahraeus en las siguientes
concentraciones: 20, 60 y 100 mg/L. Además se
establecieron plantas en un sistema no contaminado
(0 mg/L) como tratamiento testigo. A los tres días
del transplante, las plántulas fueron inoculadas con
1.0 mL de una suspensión con
Rhizobium tropici
CIAT899 (720 × 10
8
UFC/mL). Además, se consi-
deraron tratamientos sin inoculación de la bacteria.
El experimento se mantuvo durante 31 días en
cámara de ambiente controlado con 12 h de fotope-
riodo; la temperatura máxima/mínima y humedad
relativa máxima/mínima fueron 26.0/24.0 ºC y
70/65 %, respectivamente. Durante este periodo, los
nódulos radicales fueron cuantiFcados cada tercer
día, a partir de su aparición hasta el Fnal del expe
-
rimento. Posteriormente, a los 31 días, las plantas
fueron cosechadas y secadas a 70 ºC durante 72 h
para determinar el peso seco total (PST).
El contenido de compuestos fenólicos totales
(CFT) fue determinado mediante el ensayo con el
reactivo Folin-Ciocalteau, utilizando ácido clorogé-
nico como estándar (Singleton y Rossi 1965, Soong
y Barlow 2004). Muestras de hoja, raíz y nódulos
de las plantas fueron molidas en mortero con 1.5
mL de metanol al 80 %, y centrifugadas durante 15
minutos a 15 000 rpm (~24 000
g
). Los extractos
fueron conservados a –20 ºC hasta su análisis. El
análisis consistió en reaccionar alícuotas de 30 µL
de los extractos con 90 µL de carbonato de sodio
(Na
2
CO
3
) y 150 µL de solución de Folin-Ciocalteau
en microplacas de 96 pozos. Después de 30 minutos
se tomaron lecturas de absorbancia a 725 nm en un
espectrofotómetro (Synergy 2, Biotek® Instruments).
Los resultados fueron expresados como miligramos
equivalentes de ácido clorogénico por masa de tejido
fresco (mg ácido clorogénico/g).
Para evaluar la actividad antioxidante total (AAT)
se utilizó el ensayo de decoloración del radical
1,1-difenil-2-picrildrazil (DPPH) utilizando Trolox
como compuesto antioxidante (Matthäus 2002). A
partir de los extractos obtenidos para CFT, se to-
maron alícuotas de 15 µL que fueron transferidas a
microplacas de 96 pozos y se hicieron reaccionar con
285 µL de solución de DPPH. Se tomaron lecturas de
absorbancia inicial a 515 nm y las placas fueron in-
cubadas a temperatura ambiente durante 15 minutos,
para tomar una lectura de absorbancia Fnal con un
espectrofotómetro (Synergy 2, Biotek® Instruments).
Los resultados fueron expresados como milimoles
de equivalentes de Trolox por masa de tejido fresco
(mM Trolox/g).
Para la cuantiFcación de cloroFla total (CloroT) y
carotenos (CaT) se usó la metodología de Dere
et al
.
(1998). Muestras de hojas de masa conocida fueron
molidas en mortero con 1.5 mL de metanol al 80 % y
los extractos fueron mantenidos en refrigeración hasta
el momento de tomar lecturas de absorbancia (470,
645 y 662 nm) en un espectrofotómetro (Synergy 2,
Biotek® Instruments). Los resultados fueron expresa-
dos en miligramos por masa de tejido fresco (mg/g).
El experimento fue un factorial 2 × 4 × 2 con 16
tratamientos y seis repeticiones, distribuidos en un
diseño experimental completamente al azar. Los fac-
tores fueron tipo de HAP (NAF y FEN) concentración
del HAP (0, 20, 60 y 100 mg/L) y la inoculación de
R. tropici
(con y sin). Los datos obtenidos fueron
analizados mediante un análisis de varianza y prue-
ba de comparación de medias (LSD, α=0.05) con
el programa estadístico SAS (SAS Institute 2002).
RESULTADOS
A los 31 días, el tipo de HAP, la concentración
del contaminante, y la interacción de estos dos
factores tuvieron efectos signiFcativos (
p
0.001)
en la formación de nódulos en las raíces de
L. leu-
cocephala
. En el caso del tipo de HAP, las plantas
de
L. leucocephala
ante FEN presentaron una apa-
rición más temprana de nódulos (a los 5 días), en
comparación con las plantas expuestas a NAF cuya
nodulación apareció a los 12 días (
Fig. 1
). Con res-
pecto al factor concentración del contaminante, los
primeros nódulos aparecieron a los 11 días, ante 20
mg/L. Sin embargo, después de los 14 días se ob-
servó que a mayor concentración del contaminante
menor número de nódulos (
Fig. 1
). Las plantas de
L.
leucocephala
ante 20 mg FEN/L mostraron mayor
número de nódulos (8.2) hasta el día 28, aunque
este valor fue estadísticamente igual al testigo. En
contraste, las concentraciones de 60 y 100 mg FEN/L
disminuyeron signiFcativamente la formación de
nódulos con 6.5 y 4.3, respectivamente (
Fig. 1A
).
Las plantas de
L. leucocephala
expuestas al NAF
retardaron signiFcativamente la aparición de nódulos
al incrementar la concentración, especialmente en
60 y 100 mg NAF/L en comparación con el testigo
(
Fig. 1B
). No se observaron nódulos en las plantas
de
L. leucocephala
sin inoculación con
R. tropici
.
El PST de
L. leucocephala
mostró diferencias
signiFcativas únicamente por el factor inoculación y
en la interacción de la inoculación con el tipo de HAP
(
p
0.001). La inoculación con
R. tropici
produjo
mayor biomasa (>150 %) con respecto a plantas no
inoculadas (
Fig. 2
). Las plantas inoculadas con
R.
C. López-Ortiz
et al.
336
tropici
en presencia de 100 mg FEN/L incrementaron
la producción de biomasa (Fig. 2A); mientras que el
menor PST correspondió a las plantas no inoculadas
ante 60 mg NAF/L (
Fig. 2B
).
El CFT en hoja presentó diferencias signi±cativas
por efecto del tipo de HAP, la inoculación (
p
0.001),
la concentración del HAP (
p
0.01) y la interacción
de los tres factores (
p
0.001). En el caso del tipo de
contaminante, las plantas de
L. leucocephala
ante
FEN presentaron signi±cativamente mayor CFT
(>36 %) que las plantas expuestas a NAF (
Fig. 3A
y
C
). Con respecto al factor inoculación, las plantas
no inoculadas mostraron hasta 167 % más CFT con
respecto a las plantas de
L. leucocephala
inoculadas
con
R. tropici
(
Fig. 3A
y
C
). Con relación al factor
concentración de HAP, las plantas ante 100 y 60 mg/L
manifestaron mayor CFT (17.3 y 15.4 mg/g, respec-
tivamente) en comparación con las plantas testigo sin
contaminante, e incluso que plantas ante 20 mg/L
(
Fig. 3A
y
C
). Las plantas no inoculadas ante 60
mg FEN/L exhibieron mayor CFT, mientras que las
plantas inoculadas en presencia de 20 mg FEN/L
tuvieron el menor CFT (
Fig. 3A
y
C
).
En el caso de raíz, el tipo de contaminante, la ino-
culación, la concentración del HAP y la interacción
de los tres factores presentaron efectos signi±cativos
(
p
0.001) en el CFT. En el caso del tipo de HAP, las
raíces de
L. leucocephala
expuestas a NAF tuvieron
signi±cativamente mayor CFT que aquellas expuestas
a FEN (
Fig. 3B
y
D
). Con respecto a la inoculación,
las plantas inoculadas con
R. tropici
evidenciaron
signi±cativamente mayor CFT en comparación con
las plantas no inoculadas (
Fig. 3B
y
D
). Para el factor
concentración de HAP, las plantas de
L. leucocephala
ante 60 mg de HAP/L presentaron signi±cativamente
mayor CFT (>35 %) con respecto a las otras concentra
-
ciones evaluadas (
Fig. 3B
y
D
). Las plantas inoculadas
ante 100 mg NAF/L presentaron el mayor CFT en raíz,
mientras que el menor CFT se obtuvo en plantas no
inoculadas expuestas a 100 mg FEN/L (
Fig. 3B
y
D
).
0
2
4
6
8
10
12
71
11
41
72
12
42
83
1
Días después de la inoculación
0
2
4
6
8
10
12
71
11
41
72
12
42
83
1
A) Fenantreno
B) Naftaleno
Nódulos (Núm/planta)
20 mg/L
0 mg/L
60 mg/L
100 mg/L
Fig. 1.
Dinámica de aparición de nódulos formados por
Rhizobium
tropici
en raíces de
Leucaena
leucocephala
durante 31 días de establecidas en sistema “growth pouch” en presencia de dos
hidrocarburos aromáticos policíclicos. n=6. Medias²error estándar
0
50
100
150
200
250
300
350
20
06
0
100
0
50
100
150
200
250
300
350
20
06
0
100
No inoculado
Inoculado
A) Fenantreno
B) Naftaleno
Concentración del HAP (mg/L)
Peso seco total (mg/planta)
Fig. 2.
Peso seco total de
Leucaena leucocephala
inoculadas y no inoculadas con
Rhizobium
tropici
CIAT 899
en presencia de dos hidrocarburos aromáticos policíclicos durante 31 días. n=4. Medias²error estándar
SIMBIOSIS
Rhizobium tropici-Leucaena leucocephala
EN PRESENCIA DE FENANTRENO Y NAFTALENO
337
El tipo de HAP (
p
0.001) y la interacción del
tipo de HAP con la concentración del contaminante
(
p
≤ 0.01) presentaron efectos signiFcativos en el
CFT en nódulos. Los nódulos de plantas de
L. leu-
cocephala
expuestos a FEN mostraron mayor CFT
que aquellos expuestos a NAF (
Fig. 4
). En el caso
de la respuesta a la concentración del HAP, aunque
sin notarse diferencias estadísticas, los nódulos ex-
puestos a concentraciones de 60 mg/L tuvieron mayor
CFT, en comparación a los otros tratamientos (
Fig.
4
). El tratamiento con mayor CFT en nódulos fue
el expuesto a 20 mg FEN/L, mientras que el menor
CFT se obtuvo en las plantas ante 20 mg NAF/L y
100 mg FEN/L (
Fig. 4
).
La AAT en hoja reveló diferencias signiFcativas
por efecto de la inoculación, la concentración del
HAP (
P
< 0.001) y la interacción de los tres factores
evaluados (
p
0.001). Las plantas no inoculadas
presentaron hasta 300 % más AAT que las plantas
inoculadas con
R. tropici
(
Fig. 5A
y
C
). Para el caso
de la concentración de HAP, las plantas expuestas a
concentraciones de 100 mg/L exhibieron signiFcativa
-
mente mayor AAT con respecto a las otras concentra-
ciones de HAP evaluadas (
Fig. 5A
y
C
). Las plantas
no inoculadas ante 100 mg FEN/L presentaron mayor
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
0
02
0
Concentración del HAP (mg/L)
Contenido total de compuestos fenólicos
(mg/g)
60
100
02
06
0
100
5
10
15
20
25
30
35
0
5
10
15
20
25
30
35
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
A) Naftaleno
Hojas
No inoculado
Inoculado
Raíz
B) Naftaleno
C) Fenantreno
D) Fenantreno
Fig. 3.
Compuestos fenólicos totales en hojas (A y C) y en raíz (B y D) de
Leucaena leuco-
cephala
en presencia de dos hidrocarburos aromáticos policíclicos, evaluados a los
31 días. n=16. Medias±error estándar
2
0
02
0
Concentración del HAP (mg/L)
60
100
4
6
8
10
Naftaleno
Fenantreno
Contenido total de compuestos fenólicos
(mg/g)
Fig. 4.
Compuestos fenólicos totales en nódulos de
Leucaena
leucocephala
en presencia de contaminación con dos
hidrocarburos aromáticos policíclicos, durante 31 días.
n=16. Medias±error estándar
C. López-Ortiz
et al.
338
AAT, mientras que las plantas inoculadas con
R.
tropici
en presencia de 20 mg FEN/L mostraron la
menor AAT (
Fig. 5A
y
C
).
El tipo y la concentración del HAP, la inoculación
con
R. tropici
y la interacción de los tres factores (
p
≤ 0.001) evidenciaron efectos signiFcativos en la
AAT de la raíz. Las raíces de
L. leucocephala
ante
NA± presentaron signiFcativamente mayor AAT en
comparación con los valores observados ante FEN
(
Fig. 5B
y
D
). Para el factor concentración de HAP,
las raíces ante 20 mg/L presentaron signiFcativamen
-
te mayor AAT en comparación con la concentración
de 100 mg/L (
Fig. 5 B
y
D
). Para el caso del factor
inoculación, las raíces de plantas sin inocular tuvieron
signiFcativamente mayor AAT que los tratamientos
inoculados. Las plantas no inoculadas ante 20 mg
FEN/L exhibieron mayor AAT en la raíz en compa-
ración con las plantas inoculadas en presencia de 20
mg FEN/L (
Fig. 5B
y
D
).
La AAT en nódulos fue afectada signiFcati
-
vamente por el tipo de HAP y por la interacción
del tipo de HAP con la concentración del conta-
minante (
p
0.001). La AAT en los nódulos de
L.
leucocephala
ante NAF fue mayor comparada con
aquellos ante FEN. Para el factor concentración del
HAP, como tendencia, las plantas ante 100 mg/L pre-
sentaron mayor AAT aunque estadísticamente igual
a los otros tratamientos (
Fig. 6
). Los nódulos ante
0
Concentración del HAP (mg/L)
4
8
12
16
20
0
02
06
0
100
02
06
0
100
40
80
120
Actividad antioxidante total (mM/g)
160
200
0
4
8
12
16
20
0
40
80
120
160
200
No inoculado
Hojas
A) Naftaleno
B) Naftaleno
C) Fenantreno
D) Fenantreno
Raíz
Inoculado
Fig. 5.
Actividad antioxidante total en hojas (A y C) y en raíz (B y D) de
Leucaena leuco-
cephala
en presencia de dos hidrocarburos aromáticos policíclicos, a los 31 días. n=16.
Medias²error estándar
0
02
0
Concentración del HAP (mg/L)
60
100
10
20
Actividad antioxidante total
(mM/g)
30
40
50
60
70
Naftaleno
Fenantreno
Fig. 6.
Actividad antioxidante total en nódulos de
Leucaena leu-
cocephala
en presencia de dos hidrocarburos aromáticos
policíclicos, a los 31 días. n=16. Medias²error estándar
SIMBIOSIS
Rhizobium tropici-Leucaena leucocephala
EN PRESENCIA DE FENANTRENO Y NAFTALENO
339
60 mg NAF/L tuvieron mayor AAT, en comparación
con los nódulos expuestos a 60 mg FEN/L (
Fig. 6
).
Los factores inoculación y concentración del
HAP, así como la interacción de los tres factores eva-
luados mostraron efectos signiFcativos (
p
0.001)
en el contenido de CloroT en hoja. Las plantas de
L.
leucocephala
inoculadas con
R. tropici
tuvieron ma-
yor cantidad de CloroT que las plantas no inoculadas
(
Fig. 7A
y
C
). Para el factor concentración del HAP,
las plantas sin contaminante exhibieron signiFcativa
-
mente mayor cantidad de CloroT que aquellas plantas
ante 60 mg/L (
Fig. 7A
y
C
). La cantidad de CloroT
en las plantas inoculadas sin contaminante fue mayor
en comparación con las plantas no inoculadas ante
60 mg FEN/L (
Fig. 7A
y
C
).
El tipo y concentración del HAP, la inoculación, y
la interacción de los tres factores evaluados tuvieron
efectos signiFcativos (
p
0.001) en el contenido de
CaT. Las plantas ante FEN presentaron mayor con-
tenido de CaT con respecto a plantas expuestas al
NAF (
Fig. 7B
y
D
). Para el factor concentración del
contaminante, las plantas ante 100 mg/L mostraron
mayor contenido de CaT que aquellas ante 20 mg/L
(
Fig. 7B
y
D
). Para el factor inoculación, las plantas
no inoculadas tuvieron signiFcativamente (
p
0.01)
mayor cantidad de CaT que las plantas inoculadas
con
R. tropici
(
Fig. 7B
y
D
). Las plantas no inocula-
das ante 60 mg FEN/L
exhibieron mayor contenido
de CaT; mientras que las plantas inoculadas con
R.
tropici
ante 20 mg NAF/L tuvieron el menor de CaT
(
Fig. 7B
y
D
).
DISCUSIÓN
El incremento de las concentraciones de los
HAP redujo signiFcativamente la nodulación en
las raíces de
L. leucocephala
. El NAF tuvo mayor
Fig. 7.
Contenido foliar de cloroFla total (A y C) y carotenos totales (B y D) en
Leucaena leucocephala
en
presencia de dos hidrocarburos aromáticos policíclicos, a los 31 días. n=16. Medias±error estándar
0
02
06
0
100
0
Concentración del HAP (mg/L)
Concentración de pigmentos (mg/g)
20
60
100
50
100
150
200
250
300
350
0
5
10
15
20
25
No inoculado
A) Naftaleno
B) Naftaleno
C) Fenantreno
D) Fenantreno
Clorofilas
Carotenos
Inoculado
0
5
10
15
20
25
0
50
100
150
200
250
300
350
C. López-Ortiz
et al.
340
efecto negativo en la formación de nódulos en la
simbiosis
Rhizobium
-
Leucaena
en comparación con
el FEN. En el caso de FEN, las plantas expuestas a
20 mg/L no mostraron diferencias signiFcativas en
comparación con el testigo. González-Paredes
et
al.
(2007) al evaluar la simbiosis entre
Phaseolus
vulgaris
-
Rhizobium tropici
CIAT899, observaron
la aparición más temprana de nódulos con FEN (20
mg/L) en comparación con la exposición a NAF ó
benzo(a)pireno. Aun cuando no se tienen reportes
que expliquen dicha estimulación de la nodulación
ante bajas concentraciones de FEN, este efecto se
puede atribuir a cambios en los patrones de exudación
de las raíces expuestas a los HAP. Muratova
et al
.
(2009) indicaron que 10 mg FEN/kg estimularon la
producción de carbohidratos en las raíces de
Sorghum
bicolor
. Como parte de los exudados radicales se
encuentran los ±avonoides (Lundegardh y Stenlid
1944, Ponce
et al
. 2004), que tienen una función
importante como señales que favorecen el estable-
cimiento de la simbiosis
Rhizobium
-leguminosa
(Sundaravarathan y Kannaiyan 2002, Dardanelli
et al
. 2008). Los resultados experimentales indican
que el comportamiento químico del HAP inhibe de
manera importante el establecimiento de la simbiosis
Rhizobium tropici-Leucaena
leucocephala
re±ejado
en la capacidad de formación de nódulos. Lo anterior
conFrma el efecto negativo de los hidrocarburos del
petróleo en la nodulación de leguminosas arbóreas,
efecto que puede ser utilizado como indicador de la
toxicidad de estos contaminantes en este sistema sim-
biótico (Rivera-Cruz
et al
. 2005). En contraste a los
resultados del presente trabajo, se ha reportado que
la contaminación con 1000 mg FEN/kg incrementa
el número de nódulos en
Trifolium pratense
(Chia-
pusio
et al
. 2007), mientras que Ahmad
et al
. (1997)
encontraron que las cepas de
R. meliloti
en suelos
contaminados con HAP permanecen únicamente en
presencia de
Medicago sativa
.
El efecto tóxico de los HAP en el crecimiento y
desarrollo de las plantas ha sido reportado (Henner
et al
. 1999, Baek
et al
. 2004, Alkio
et al
. 2005, Song
et al
. 2005, Muratova
et al
. 2009). En el presente
estudio, el PST no fue afectado signiFcativamente
por el tipo o la concentración del HAP. En contraste, la
inoculación de
R. tropici
estimuló signiFcativamente el
crecimiento de las plantas (>150 %). La nula toxicidad
de los HAP observada en el crecimiento de
L. leuco-
cephala
, también ha sido reportada para las especies
Phaseolus nipponensis, Zea mays, Sorgum bicolor
y
Festuca arundinacea
expuestas a diferentes con-
centraciones de NAF o de FEN (Baek
et al
. 2004,
Cheema
et al
. 2009, Muratova
et al
. 2009). Los
efectos tóxicos de los HAP en la planta dependen
de factores ambientales, así como de la estructura
química, la concentración y el tiempo de exposición
al contaminante (Henner
et al
. 1999, Baek
et al
.
2004, Song
et al
. 2005). De manera importante, el
presente estudio demuestra la capacidad de
L. leu-
cocephala
para tolerar concentraciones de NAF y
FEN de hasta 100 mg/L, sin afectar su producción
de biomasa seca.
El CFT y la AAT fueron significativamente
mayores en las plantas sin inocular, lo que sugiere
que
Rhizobium
aminora la toxicidad de los HAP. El
efecto Ftotóxico de los HAP puede relacionarse con
la producción de ROS que incluyen el H
2
O
2
, el O
2
2–
y
radicales HO
, las cuales actúan como moléculas de
señalización y como subproductos citotóxicos. Bajo
condiciones fotosintéticas y respiratorias normales,
estos compuestos se producen en la cadena del trans-
porte de electrones en cloroplastos y mitocondrias y
son subproductos de rutas metabólicas en el peroxi-
soma (Vranova
et al
. 2002, Liu
et al
. 2009). Debido
a que las ROS atacan químicamente nucleótidos,
proteínas, carbohidratos y ácidos grasos, las plantas
tienen mecanismos bioquímicos para neutralizarlas
(Moller
et al
. 2007). Por el contrario, las plantas
utilizan niveles bajos de ROS ante condiciones de
estrés, como señalización para respuestas comple-
jas para la defensa contra patógenos o bien en la
desintoxicación de contaminantes (Liu
et al
. 2009).
El estrés inducido por el tipo y la concentración de
HAP puede estar contribuyendo al incremento en la
producción de ROS que causan efectos negativos en
la célula vegetal (Mittler 2002). Ante tal estrés, las
plantas activan respuestas metabólicas especíFcas
como son la síntesis y la actividad de compuestos
enzimáticos o no enzimáticos con poder antioxidante
(Mittler 2002, Lee
et al
. 2007), así como compues-
tos fenólicos que participan en la erradicación de
ROS (Treutter 2005). En este trabajo, las plantas
no inoculadas tuvieron mayor contenido de CFT y
AAT, mismos que podrían estar relacionados con la
eliminación de ROS inducidas por el estrés causado
por NAF o FEN, en donde la presencia de
R. tropici
puede tener un papel relevante en la tolerancia de
L.
leucocephala
ante ambos HAP. Las respuestas Fsio
-
lógicas como el CFT, la AAT, la CloroT y los CaT
han sido poco descritas para leguminosas arbóreas
ante HAP. Liu
et al
. (2009) encontraron reducción
en los niveles de cloroFla
a
,
b
y total en
Arabidopsis
thaliana
ante diferentes concentraciones de FEN.
Lo anterior conFrma el efecto del aumento de la
concentración del contaminante sobre la reducción
del contenido de CloroT en plantas expuestas a FEN
SIMBIOSIS
Rhizobium tropici-Leucaena leucocephala
EN PRESENCIA DE FENANTRENO Y NAFTALENO
341
en comparación con el testigo no contaminado. Por
el contrario, el contenido de CaT incrementó confor-
me aumentó la concentración de ambos HAP. Aun
cuando no se tienen comparaciones del efecto de los
HAP en el contenido de CaT, se ha demostrado que el
mayor cantidad de estos pigmentos incrementa sig-
nifcativamente al presentarse defciencias de nitró
-
geno, lo cual es una respuesta a un daño oxidante en
microalgas (Salguero
et al
. 2003). Lo anterior puede
relacionarse con el efecto negativo de los HAP en el
contenido de CloroT observado en las plantas de
L.
leucocephala
, mientras que el de CaT fue mayor en
presencia de los HAP. En contraste, el contenido de
CaT en plantas inoculadas con
R. tropici
fue menor,
mientras que el contenido de CloroT fue mayor con
respecto a plantas no inoculadas.
Los resultados indican que
L. leucocephala
pre-
senta un estrés oxidante ante los HAP evaluados,
el cual es atenuado por
R. tropici
. Debido a que no
existen estudios para establecer comparaciones en
la simbiosis
Rhizobium
-leguminosa; análogamente,
la simbiosis micorrízica atenúa este tipo de estrés
abiótico en sus hospedantes. Por ejemplo,
Glomus
intraradices
reduce notablemente el daño oxidante en
Chichorium intybus
causado por antraceno y benzo(a)
pireno; sin embargo, la presencia de los HAP reduce
la densidad de hifas, la intensidad de esporulación
del hongo y el tamaño de las raíces de
C. intybus
(Debiane
et al
. 2008, 2009).
CONCLUSIONES
La contaminación con NAF y FEN tuvo efectos
tóxicos para la formación de nódulos en
Leucaena
leucocephala
, en la que el NAF produjo mayor
reducción de la nodulación. La simbiosis entre
R.
tropici
y
L. leucocephala
incrementó el PST hasta
en 150 % comparado con las plantas no inoculadas,
demostrándose el eFecto benéfco de la simbiosis
aún ante los HAP. El CFT y la AAT en las hojas
Fue signifcativamente mayores en los tratamientos
no inoculados en comparación con los tratamientos
con
R. tropici
, y signifcativamente más elevados
en las plantas ante FEN comparadas con aquellas
ante NAF. El tipo de contaminante no tuvo efectos
signifcativos en el contenido de CloroT y CaT;
sin embargo, las plantas con
R. tropici
presentaron
mayor contenido de CloroT en comparación con las
plantas no inoculadas. Los resultados indican que
L. leucocephala
experimenta un estrés oxidante
inducido por los HAP, y que
R. tropici
atenúa sus
efectos tóxicos en las plantas.
AGRADECIMIENTOS
Trabajo que forma parte del proyecto SEP-
CONACyT 79456; CLO, agradece el apoyo del
CONACyT durante sus estudios de posgrado.
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