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Red de Revistas Científicas de América Latina y el Caribe, España y Portugal
PARTICIPACIÓN DE DIFERENTES GENES EN LA REPARACIÓN DE RUPTURAS DE DOBLE
CADENA EN CEPAS DE
Escherichia coli
EXPUESTAS A RADIACIÓN GAMMA
Jorge Humberto SERMENT GUERRERO*, Estefany MARTÍNEZ MARTÍNEZ y
David ALCÁNTARA DÍAZ
Departamento de Biología, Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares, México
*Autor responsable: jorge.serment@inin.gob.mx
(Recibido mayo 2012, aceptado octubre 2012)
Palabras clave: reparación de rupturas dobles, recombinación, radiación gamma
RESUMEN
Todos los seres vivos están expuestos a la radiación proveniente de diversas fuentes.
La radiación ionizante puede dañar al material genético causando rupturas en una o
en ambas cadenas, o bien lesiones diversas en las bases. Las rupturas de doble banda
(RDB) tienen gran importancia biológica ya que de no eliminarse producen la muerte
celular. En
Escherichia coli
este tipo de lesiones se reparan en su mayoría por re-
combinación homóloga. En el presente trabajo se evalúa la participación de algunos
genes de recombinación en la reparación de RDB causadas por radiación gamma. Se
expusieron mutantes de
E. coli
defectuosos en genes de recombinación a diversas dosis
de radiación gamma y se incubaron por diferentes periodos en condiciones ideales.
Para evaluar las RDB se utilizaron tanto la técnica de microelectroforesis como la de
electroforesis de campos pulsados. En ambos casos los resultados muestran la cinética
de recuperación para cada cepa, lo que refeja la importancia de cada gen en el proceso
de reparación de RDB.
Key words: DSB repair, recombination, gamma radiation
ABSTRACT
All living organisms are naturally exposed to radiation from different sources. Ionizing
radiation produces a plethora of lesions upon ADN that can be categorized as single
and double strand breaks and base damage. Among them, unrepaired double strand
breaks (DSB) have the greatest biological signiFcance, since they are responsible o±
cell death. In
Escherichia
coli this kind of lesions are repaired mostly by homologous
recombination. In this work the participation of some recombination genes in the repair
of DSB is evaluated.
E. coli
defective strains were exposed to gamma radiation and
incubated for different periods in ideal conditions. Both microelectrophoresis and pulse
Feld gel electrophoresis techniques were used to evaluate the kinetics o± repair o± such
lesions, refecting the importance o± each de±ective gene in the process.
Rev. Int. Contam. Ambie. 29 (1) 47-57, 2013
J.H. Serment Guerrero
et al.
48
INTRODUCCIÓN
Todos los seres vivos están expuestos a la radia-
ción proveniente ya sea de fuentes naturales (como
son los rayos cósmicos o sustancias radioactivas
existentes en la tierra, tales como el gas radón), o
bien como resultado de diversas actividades humanas
que se agregan a la exposición natural (explosiones
nucleares, aplicaciones médicas, investigación, etc.).
Casi desde el descubrimiento de la radiación se
observaron los efectos que ésta tenía sobre los seres
vivos; sin embargo, fue a partir de las explosiones de
las bombas de Hiroshima y Nagasaki que se despertó
una gran inquietud por los daños producidos por este
agente. La radiación consiste de partículas subatómi-
cas u ondas electromagnéticas energéticas que viajan
a través de un medio o espacio y que cuando chocan
con las moléculas de otro material les transferen
su energía. Al hacerlo, dependiendo de la energía
que posea o que deposite, puede provocar que los
electrones orbitales vibren, que se exciten al pasar a
niveles de energía superiores o bien que salgan de su
órbita dando lugar a iones. A la radiación que tiene
la capacidad de transFerir la energía sufciente para
que ocurra esto último se le conoce como radiación
ionizante. Al incidir sobre las células la radiación
ionizante afecta tanto a los componentes estructura-
les como al material genético, pero mientras que el
daño en los primeros es momentáneo (ya que existe
la posibilidad de sintetizar nuevas moléculas para
reemplazarlas), en el material genético los efectos
pueden ser permanentes y traer graves consecuencias
a nivel celular, tisular, en los organismos o incluso en
la población, por lo que en general cuando se refere
a los efectos de la radiación se considera al ADN
como la molécula blanco (Teoulé 1987, Averbeck
et al.
2006).
La radiación afecta al material genético de manera
totalmente aleatoria en función de dos alternativas co-
nocidas como efectos directo e indirecto. El primero
se refere a la interacción de los Fotones y partículas
ionizantes con el ADN, mientras que el segundo se
debe a reacciones con los productos de la radiólisis
del agua en donde ocurre la mayoría de las ioniza-
ciones, ya que es el componente más abundante de
la materia viva
La radiación ionizante puede dañar al material
genético causando diversas lesiones en las bases y
rupturas en una o en ambas cadenas. Las rupturas
de doble banda (RDB) representan uno de los daños
más perjudiciales al ADN ya que de no eliminarse
producen la muerte celular (Sargentini y Smith 1986).
Para reparar estas lesiones la única posibilidad en la
bacteria
Escherichia coli
es la recombinación. En
esencia el proceso se refere al paso de Fragmentos
de una molécula de ADN a otra diferente, ya sea en
forma recíproca, es decir que haya intercambio entre
ambas, o no recíproca, en donde solamente una de
ellas recibe material nuevo. Esta transferencia puede
llevarse a cabo en regiones con secuencias similares
(recombinación homóloga) o bien por la unión de
extremos de ADN (recombinación no homóloga),
evento que se da principalmente en eucariontes y de
manera muy reducida en la mayoría de las bacterias,
aunque en algunas como
Deinococcus radiodurans
o
Bacillus subtilis
parece ser un mecanismo primordial
(Kuzminov 1999). La recombinación es muy impor-
tante ya que es la única posibilidad de componer el
daño en el caso de rupturas de doble banda (RDB),
puesto que al perderse la continuidad de la hebra de
ADN no hay un molde a partir del cual resintetizarla,
con la consecuente muerte de la célula. Asimismo,
puede también intervenir para tolerar lesiones du-
rante el proceso de duplicación del ADN: cuando la
polimerasa que cataliza la síntesis del ADN nuevo
encuentra una lesión ilegible (dímero, aducto, etc.),
interrumpe el proceso y prosigue varios nucleótidos
más adelante, dejando un hueco enfrente del sitio
donde se halla el daño. Para resolver este problema
la célula lleva a cabo un evento de recombinación
no recíproca, en el que una molécula homóloga de
ADN cede el fragmento homólogo para así rellenar
el hueco que quedó en el ADN recién sintetizado
(Kuzminov 1999).
En
Escherichia coli
existen dos vías principales
de recombinación homóloga, la vía RecBCD y la vía
RecFOR, aunque en algunas bacterias existe también
la vía RecE que depende de la presencia del profago
rac
(Kuzminov 1999). La más importante es la que
lleva a cabo la enzima RecBCD, ya que es la principal
responsable de la reparación de rupturas de doble
cadena. Esta enzima reconoce los extremos libres
parejos o casi parejos de ADN duplex y degrada el
extremo 3’ hasta encontrar una secuencia específca
denominada sitio
chi
(llamado así por sus siglas en
inglés
crossover hotspot instigator
, comúnmente
representado con la letra griega
χ
), en donde el
complejo RecBCD se detiene, cambia de polaridad
y degrada preferentemente el extremo 5’, de modo
que se genera una cadena libre terminada en 3’. Al
mismo tiempo la enzima promueve la polimerización
de RecA sobre esta cadena, iniciando el apareamiento
con una secuencia homóloga y el intercambio de
bandas de ADN. Posteriormente la polimerasa I del
ADN sintetiza la parte faltante (Dillingham y Kowal-
czykowski 2008).
REPARACIÓN DE RDB EN CEPAS DE
E. coli
DEFECTUOSAS EN GENES DE RECOMBINACIÓN
49
La vía RecFOR por su parte se encarga de la re-
combinación en tramos de ADN de cadena sencilla
(huecos). Cabe mencionar que estos huecos pueden
formarse por la actividad de nucleasas como RecJ o
Exo I a partir de cortes de cadena sencilla o bien por la
interrupción de la síntesis de ADN. Al formarse este
tipo de estructuras la enzima SSB (por sus siglas en
inglés
single-strand binding protein
) se pega a ellas
para protegerlas y darles estabilidad; sin embargo,
esta actividad interfere con la Formación del flamen
-
to de RecA sobre el ADN. Posteriormente el complejo
FOR (formado por las subunidades RecF, RecO y
RecR) estimula precisamente el desalojamiento de
SSB del ADN y promueve la entrada de RecA, que
realiza el intercambio con la secuencia homóloga de
otra molécula de ADN (Umezu y Kolodner 1993,
Umezu y Kolodner 1994).
Como ya se mencionó, las rupturas de doble
banda tienen gran relevancia biológica ya que de no
repararse son responsables de la muerte celular y por
ello es importante contar con técnicas para evaluarlas.
En el presente trabajo se estudió la importancia de
diferentes genes de recombinación (
recB
,
xonA
,
recJ
y
recO
) en la reparación de rupturas dobles, en cepas
de
E. coli
defectuosas en dichos genes, mediante las
técnicas de microelectroforesis unicelular (ensayo
cometa) y electroforesis en campos pulsados.
METODOLOGÍA
Las cepas utilizadas en el presente trabajo forman
parte de la colección del laboratorio de Genética
Microbiana del Instituto Nacional de Investigaciones
Nucleares y se enlistan en el
cuadro I
. Se utilizaron
cepas con defectos en uno o dos
de los genes de
recombinación arriba mencionados.
Cultivo e irradiación de las bacterias
Se tomó una alícuota de un cultivo en fase esta-
cionaria, se diluyó 50 veces en caldo de Luria-Bertani
(LB) y se incubó hasta alcanzar la fase logarítmica
media de crecimiento, que corresponde a una con-
centración de aproximadamente 2×10
8
células/mL
(Abs
600
=
:
0.5). Se centrifugó a 10 000 rpm por 10
minutos, se resuspendió el botón en amortiguador de
fosfatos 0.2 M pH 7, se tomaron alícuotas de 1 mL y
se expusieron a diferentes dosis de radiación gamma
en un irradiador Gammacell
60
Co. Posteriormente, las
suspensiones bacterianas se centrifugaron, se resus-
pendieron los botones en LB y se incubaron a 37 ºC.
Se tomaron muestras de cada tratamiento a diferentes
intervalos de tiempo (de 5 a 80 minutos) y se ana-
lizó la fragmentación del ADN mediante la técnica
de microelecroforesis unicelular y electroforesis de
campos pulsados (
Pulse-Field Gel Electrophoresis
).
Microelectroforesis unicelular
Las bacterias se mezclaron con un volumen igual
de una solución de agarosa 1 % y de esta mezcla se
formó una capa de agarosa sobre portaobjetos prepa-
rados previamente con una capa de agarosa al 0.5 %
que se dejó secar toda la noche. Se agregaron 80 µL
de la primera solución de lisis (0.25 % SDS, lisozima
0.5 mg/mL, ribonucleasa 5 mg/mL) y se incubaron en
una cámara húmeda durante 30 minutos a 37 ºC. Se
agregó el mismo volumen de una segunda solución
de lisis (2.5 M NaCI, 100 mM EDTA, 10 mM tris
pH10, 1 % de TritonX-100) y se incubaron por 10
minutos a temperatura ambiente. Se sumergieron los
portaobjetos en un amortiguador de digestión (2.5
M NaCI, 10 mM EDTA, 10 mM Tris pH 7.4) con
proteinasa K (1 mg/mL) durante 30 minutos a 37 ºC
y posteriormente en amortiguador de corrimiento
(500 mM de acetato de sodio y 100 mM de Tris, pH
9) dentro de una cámara de electroforesis. Se ajustó
el volumen para dar una corriente de l00 mA durante
60 minutos a 4 ºC. Se retiraron los portaobjetos, se
sumergieron en una solución 1M de acetato de so-
dio/etanol (5 mL de acetato de sodio 5M en 45 mL
de etanol absoluto) durante 30 minutos y se transf
-
rieron a etanol al 70 %, durante 15 minutos. A cada
preparación se le agregaron 50 µL de una solución
1 mM. de YOYO-1 (benzoxazolium-4-quinolinum
CUADRO I.
CEPAS DE
Escherichia coli
UTILIZADAS EN ESTE TRABAJO
Cepa
Genotipo
Origen
PQ30
F
,
thr, leu, his, pyrD, thi, trp
::MuC
+
,
srl
::Tn10,
rpoB, sfA
::MuD(Ap
lacZ
),
cts,
lac
ΔU169,
galE, galY, phoC
.
Quillardet y Hofnung 1985
IN602
Igual a PQ30 pero
zga
::Tn10,
recB
Breña y Serment 1998
IN237
Igual a PQ30 pero
recO
::Tn5
Breña y Serment 1998
IN400
Igual a PQ30 pero
recJ
::Tn10
Breña y Serment 1998
IN900
Igual a PQ30 pero
DxonA
::cam
Serment
et al.
2008
IN901
Igual a PQ30 pero
DxonA
::cam,
recJ
::Tn10
Serment
et al
. 2008
J.H. Serment Guerrero
et al.
50
oxazole yellow homodimer) o bromuro de etidio
(20 µg/mL) durante 3 minutos, se enjuagaron con
PBS y se observaron al microscopio. Se contaron 250
células por preparación (Singh
et al.
1999).
Electroforesis de campos pulsados
A partir de una colonia bacteriana se hizo un
cultivo de 16-20 horas en caldo LB y de este cultivo
se tomaron alícuotas de 1 mL; cada una se centrifu-
gó a 10 000 rpm durante 10 minutos, se decantó el
sobrenadante y el botón se resuspendió en 1 mL de
amortiguador
d
e fosfatos 20 mM. Se conservaron
los tubos en hielo y se expusieron a diferentes dosis
de radiación gamma. Posteriormente una fracción
se centrifugó a 12 000 rpm durante 30 segundos, se
eliminó el sobrenadante y se resuspendió en 200 µL
de agarosa de bajo punto de fusión (ABPF) al 1 % a
37 ºC. Los botones se repartieron en los moldes para
formar pequeños bloques de agarosa usados con el
equipo de electroforesis por pulsos (PFGE) y el resto
del cultivo se resuspendió en 1 mL de LB y se incubó
a 37 ºC durante diferentes periodos. Posteriormente
se centrifugó nuevamente, se resuspendieron las
bacterias en ABPF y se formaron los bloques como
se indicó anteriormente.
Lisis celular
Este procedimiento fue adaptado a partir del trabajo
de diversos autores (Chang y Taylor 1990, Barrett
et
al
. 1994, Johnson
et al.
1995, Matushek
et al.
1996,
Sheneman y Katz 2003). Los bloques de agarosa se
colocaron dentro de microtubos con 1 mL de solución
de lisis (100mM Tris HCl, 100mM EDTA, 20 mM
NaCl, 1 % SDS, pH≈10.0) adicionados con lisozima
(200 µg/mL) y se incubaron durante 1 hora a 50 ºC;
pasada la hora, se retiró la solución de lisis y se lavaron
los bloques dos veces con Tris-EDTA (TE) (20 mM Tris
HCl, 50 mM EDTA, pH≈8.0), por 10 minutos para cada
lavado. Después se agregó 1 mL de solución de lisis
(pH≈7.5) adicionada con proteinasa K (0.05 µg/mL)
y se incubó durante 1 hora a 50 ºC, para nuevamente
realizar los dos lavados bajo las mismas condiciones.
Las muestras se conservaron en TE a 4 ºC.
Determinación de rupturas de doble banda
(RDB) por electroforesis de campos pulsados
(PFGE)
En un gel de agarosa al 1 %, se introdujeron las
muestras (bloques) en los pozos y se selló cada uno
de ellos con agarosa de bajo punto de fusión al 1 %.
Como testigo se añadió un marcador de peso mole-
cular de ADN (Pulse Marker 0.1-200kb-Sigma-). Se
colocó el gel en el equipo Chef- Dr® III (Bio-Rad),
se agregó el amortiguador (TBE 0.5x) y se corrió por
18 horas a 6V con periodos de cambio de 40 segundos
y ángulo de 120º. Posteriormente se tiñó el gel con
bromuro de etidio (0.5 µg/mL) durante 30 minutos,
se colocó en un transiluminador de UV, se documentó
y se analizó mediante el software Quantity One® de
Bio-Rad, que permite medir la intensidad luminosa
de cada carril respecto a una distancia relativa.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Microelectroforesis
La técnica original de microelectroforesis uni-
celular neutra en bacterias propone el uso del colo-
rante fuorescente YOYO para teñir el ADN en las
preparaciones; sin embargo, en nuestras condiciones
experimentales y con las dosis utilizadas, las imá-
genes que se obtenían eran muy confusas; por ello
se probó en su lugar el bromuro de etidio. Bajo el
microscopio se identiFcaron tres distintas mor±o
-
logías (
Fig. 1
), cuyo porcentaje variaba en función
de la dosis, que se utilizaron como parámetros
para evaluar el grado de fragmentación (rupturas
dobles), así como la reparación de los daños. Para
veriFcar que estas mor±ologías estaban asociadas
a RDB se hicieron experimentos con la enzima
de restricción
XbaI
, utilizando una concentración
relativamente baja (0.01 unidades por laminilla)
y diferentes tiempos de incubación (5, 10, 20 y 40
minutos). Se observaron las mismas morfologías
que con la radiación y que variaba la proporción de
éstas conforme transcurría el tiempo de incubación,
lo que nos conFrmó que dichas mor±ologías estaban
asociadas a RDB.
En los diagramas de barras (
Fig. 2
) se presentan
los niveles de fragmentación de ADN en función de
la dosis y el tiempo de incubación postirradiación. Al
extremo izquierdo se aprecian dichos niveles de frag-
mentación al tiempo 0 y se puede notar que en todas
las cepas aumenta con la dosis. Cabe hacer notar que
en los testigos sin irradiar hay ADN fragmentado lo
que posiblemente se deba a que los cultivos están en
fase de crecimiento logarítmico y este daño aparente
es refejo de las rupturas que se producen durante la
replicación normal del ADN. A medida que pasa el
tiempo y que hay oportunidad de eliminar el daño, se
observa que en la cepa de referencia PQ30, las ruptu-
ras producidas por la radiación gamma desaparecen
gradualmente conforme aumenta el periodo de incu-
bación y a los 80 minutos incluso a la dosis más alta
(100 Gy), prácticamente desaparecen. En cambio en
todas las demás, especialmente en el mutante doble
REPARACIÓN DE RDB EN CEPAS DE
E. coli
DEFECTUOSAS EN GENES DE RECOMBINACIÓN
51
recJ,xonA
y en la cepa defciente en
recB
se observan
en abundancia las morfologías lV y V que persisten
al transcurrir el tiempo, lo que pone de manifesto
la importancia de todos estos genes en la reparación
de RDB. Como era de esperarse, en la cepa
recB
no
hay una reparación importante ni siquiera al tiempo
de incubación mayor, ya que el producto de este gen
es el encargado del inicio del proceso de recombi-
nación. A la dosis más alta, el porcentaje de células
que han reparado el daño coincide con los datos de
letalidad ya existentes en el laboratorio (
Fig. 3
), lo
que apoya la idea de que los cometas efectivamente
reFejan RDB y que son estas lesiones no reparadas
las responsables de la muerte celular.
En la cepa defectuosa en
recO
se observa que a
los 80 minutos de incubación hay una disminución
importante en la frecuencia de las morfologías asocia-
das a fragmentación, si bien no es tan marcada como
en la cepa silvestre. El producto de
recO
forma parte
del complejo enzimático RecFOR, que desplaza a la
enzima SSB cuando se une a ADN de una hebra y
promueve la entrada de RecA para que pueda llevarse
a cabo la recombinación. Esto sugiere que, si bien sí
tiene una participación en la eliminación de RDB,
la vía RecF no es la principal opción para reparar
RDB. En las cepas
recJ
o
xonA
también se observa
reparación, sin embargo esto ocurre más lentamente
que en PQ30 (
wt
) o IN237 (
recO
). Ambos genes co-
difcan para exonucleasas que están involucradas en
diversos procesos de reparación, como la reparación
por escisión de bases o en eventos de recombinación.
Se ha propuesto que el producto de estos genes “rasu-
ra” RDB con extremos disparejos para que las pueda
reconocer RecBCD. El que no actúen estas enzimas
retrasa considerablemente el proceso de reparación,
sin embargo la célula es capaz de sobreponerse. El do-
ble mutante
recJ
,
xonA
(IN901) confrma lo anterior,
ya que se observa un comportamiento similar al de
la cepa
recB
, lo que apoya la idea de la participación
de estas exonucleasas en la preparación del sustrato
para RecBCD.
Electroforesis de campos pulsados
Para evaluar estos experimentos se tomó la in-
tensidad de Fuorescencia por carril y se calculó la
distribución del porcentaje en tres diferentes regiones
conforme a lo reportado por Handa y Kobayashi
(2001) y que corresponde a tres tipos de conforma-
ción de ADN de acuerdo con la región del gel en la
que se encuentre: Circular, ADN lineal de alto peso
molecular y fragmentos de ADN (
Fig. 4
). El ADN
circular se queda atrapado en las ramifcaciones de
la agarosa en el momento de formarse los bloques
(Beverly 1988, Birren y Lai 1993); el ADN lineal de
alto peso molecular (DLAPM) como consecuencia
de una ruptura doble sale de los pozos y forma una
banda muy ancha e intensa un poco más adelante,
mientras que los fragmentos más pequeños migran
más allá a lo largo del carril (Kusano
et al.
1995,
Naito
et al
. 1995).
En los experimentos sin incubación podemos
observar que el grado de fragmentación aumenta
conforme aumenta la dosis de exposición para todas
las cepas; sin embargo, se observa una diferencia
entre las cepas de acuerdo con el gen de reparación
defectuoso. Así, la cepa con menor fragmentación
fue la silvestre, mientras que la que presenta mayor
grado de fragmentación fue IN602, defectuosa en
II
I
III
Fig. 1.
Diferentes morfologías observadas bajo el microscopio, obtenidas mediante la técnica de microelectroforesis. Se asoció cada
una de estas morfologías con diferentes niveles de daño. I) Bacteria sin daño; II) fragmentación (cometa real); III) fragmentación
severa. Se observaron estas mismas morfologías al tratar al ADN con la enzima de restricción Xba1 y su frecuencia variaba en
relación con la concentración y el tiempo de incubación utilizados
J.H. Serment Guerrero
et al.
52
recB
, lo que sugiere que ya desde el principio ha
ocurrido cierto grado de reparación (
Fig. 5
). Esto
concuerda con reportes anteriores que indican que
estos mecanismos de recombinación se encuentran
presentes dentro de la bacteria como genes “de man-
tenimiento” (
housekeeping
) y empiezan a funcionar
en el momento mismo en que ocurre una lesión
(Kuzminov 1999, Cox
et al
. 2000).
En cuanto a los experimentos de cinética de repa-
ración, los resultados de las electroforesis en campos
pulsados nos muestran un comportamiento muy
similar a lo observado en la microelectroforesis. En
la
fgura 6
se observa que al aumentar el tiempo de
incubación postirradiación, la intensidad a lo largo
del carril disminuye y se concentra en ciertas zonas
(bandas), lo que indica la reparación de las RDB.
En la cepa silvestre (PQ30) la intensidad es menor
con respecto a las demás, pues al poseer todos sus
mecanismos de recombinación intactos, es capaz de
reparar efcientemente las lesiones y eliminar casi
por completo las rupturas.
Para la cepa IN237
recO
puede verse que para
las dosis más altas (100 y 150Gy) y al tiempo de
incubación más corto, la intensidad es alta y al au-
mentar el tiempo, su intensidad disminuye drástica-
mente. Esto confrma lo reportado recientemente por
Handa y colaboradores (2009), en donde a partir de
extractos de las diferentes proteínas pertenecientes
100%
PQ30 (
wt
)
IN602 (
recB
)
IN237 (
recO
)
50%
0%
0246 810
100%
50%
0%
0246 8102550100
100%
50%
0%
0246 8102550100
100%
50%
0%
0246 8102550100
100%
50%
III
II
I
0%
02468
10 25 50 100
100%
50%
0%
02468
10 25 50 100
100%
50%
0%
0246 8102550100
100%
50%
0%
02468
10 25 50 100
100%
50%
0%
02468
10 25 50 100
100%
50%
0%
0246 8102550100
100%
50%
0%
02468
10 25 50 100
100%
50%
0%
02468
10 25 50 100
100%
50%
0%
0246 8102550100
100%
50%
0%
02468
10 25 50 100
100%
50%
0%
02468
10 25 50 100
100%
50%
0%
02468
10 25 50 100
100%
50%
0%
0246 810
100%
50%
0%
0246 810
IN400 (
recJ
)
100%
50%
0%
0246 810
IN900 (
xonA
)
100%
50%
0%
0246 810
IN901 (recJ,
xonA
)
100%
50%
0%
0 2468
10
Fig. 2.
Frecuencia de morfologías de acuerdo a la dosis y tiempo de incubación. En el eje de las abscisas se representan las diferentes
dosis en Gy utilizadas
REPARACIÓN DE RDB EN CEPAS DE
E. coli
DEFECTUOSAS EN GENES DE RECOMBINACIÓN
53
a la vía RecF sugieren que RecO junto con RecR,
RecF y RecJ pueden participar en la reparación de
rupturas dobles de un modo similar al que realiza
el grupo epistático Rad52 en levaduras y otros
eucariontes. Los autores proponen que Rad52 y
RecO son homólogos funcionales ya que facilitan el
reconocimiento y unión de RecA o de su homólogo
Rad51 sobre ADN de cadena sencilla sustituyendo
a SSB (o RPA) con lo que se genera un flamento
nucleoprotéico que permite la recombinación ho-
móloga y por ende la reparación de rupturas dobles.
Del mismo modo parece haber una similitud entre
las funciones de RecF y RecR y las de Rad55/57,
así como de RecJ y ExoI.
En las cepas con defectos en las exonucleasas
de cadena sencilla RecJ (IN400) y ExoI (IN900),
se observa un efecto muy similar entre sí. A los 20
minutos de incubación aún permanece una buena
parte de las rupturas, pues la fragmentación de ADN
es muy notoria (intensidad); sin embargo, a pesar de
que la reparación es más lenta se puede apreciar que
en el periodo de incubación más largo las bacterias
logran eliminar la mayor parte de las rupturas. En
el mutante doble
recJ, xonA
(IN901) se observa
100
10
1
01
00
200
Dosis (Gy)
% Supervivencia
300
400
0.1
PQ30 (wt)
IN400 (recJ)
IN901 (recJ, xonA)
IN602 (recB)
IN237 (recO)
IN900 (xonA)
0.01
0.001
0.0001
0.00001
Fig. 3.
Porcentaje de supervivencia de las cepas utilizadas al
exponerse a diferentes dosis de radiación gamma
ADN fragmentado
ADN lineal de alto
peso molecular
(DLAPM)
Zona de pozos
150Gy
IN400
150Gy
IN602
100Gy
IN400
100Gy
IN602
50Gy
IN400
T
IN400
50Gy
IN602
T
IN602
150Gy
PQ30
100Gy
PQ30
50Gy
PQ30
T
PQ30
PQ30 (wt)
0 Gy
PQ30 (wt)
50 Gy
PQ30 (wt)
100 Gy
PQ30 (wt)
150 Gy
IN602 (recB)
0 Gy
IN602 (recB)
50 Gy
IN602 (recB)
100 Gy
IN602 (recB)
150 Gy
IN400 (recJ)
0 Gy
IN400 (recJ)
50 Gy
IN400 (recJ)
100 Gy
IN400 (recJ)
150 Gy
Fig. 4.
Corrimiento de muestras de bacterias expuestas a diferentes dosis de radiación gamma en un
gel de agarosa. Se muestran las distintas zonas consideradas para el análisis de las muestras:
Zona de pozos, ADN Lineal de Alto Peso Molecular (DLAPM) y ADN fragmentado
J.H. Serment Guerrero
et al.
54
un sinergismo dado por ambos defectos, de manera
que ni aún en el tiempo de incubación más largo se
eliminan las rupturas. Una limitante para el complejo
enzimático RecBCD es que sólo reconoce rupturas
dobles parejas, así que para poder reparar las que no
tienen este tipo de estructura, es necesario que tales
extremos colgantes se emparejen y tal es la activi-
dad que al parecer llevan a cabo exonucleasas como
ExoI (
xonA
) y RecJ (
recJ
) (Thoms y Wackernagel,
1998). Los resultados con el mutante doble
recJ,
xonA
IN901 apoyan lo anterior pues se observa
que la intensidad de los carriles correspondientes a
las dosis de 100 y 150 Gy son muy altas (similares
a las observadas en IN602
recB
) y no disminuye
con el tiempo de incubación, lo que indica que el
daño no se elimina. Esto concuerda con los datos de
supervivencia en los que se puede ver que al faltar
ambas enzimas aumenta notablemente la letalidad
con respecto a la cepa silvestre.
En la cepa IN602 se observa que la reparación
del daño es muy defciente incluso a los tiempos
de incubación más prolongados (60 minutos), lo
que pone de manifesto la importancia que tiene
recB
en la reparación de este tipo de lesiones. En
Escherichia coli
la reparación de rupturas dobles se
lleva a cabo principalmente por el mecanismo de
recombinación homóloga, de tal modo que el ADN
se restaura en la forma correcta y no se generan
translocaciones en las que también se logra restaurar
la continuidad de la molécula pero de una manera
incorrecta. Los extremos de ADN en las rupturas
dobles se unen en la forma correcta a través de la
participación de regiones de ADN homólogas no
dañadas. En términos generales el proceso ocurre
así: RecBCD se une a uno de los extremos de la
ruptura doble y comienza a degradar la cadena de
ADN (liberando nucleótidos si es en el extremo 3’
ó bien oligonucleótidos si es en el 5’) hasta encon-
trar una secuencia específca conocida como sitio
χ
. A partir de aquí se inactiva RecD y RecBC sigue
funcionando como helicasa que en el extremo 3’
promueve la entrada de RecA Formando un flamen
-
to nucleoprotéico que se puede intercambiar con
la secuencia homóloga de otra molécula de ADN
de cadena doble (Anderson y Kowalczykowski
1997, Dillingham y Kowalczykowski 2008). Así,
la cepa
recB
IN602 tiene sensibilidad muy alta a
la radiación gamma, debido a que es incapaz de
iniciar este proceso de recombinación homóloga,
lo que coincide con reportes previos (Sargentini y
Smith 1986, Brčić-Kostić
et al.
1991)
Dentro de la bacteria con frecuencia se producen
rupturas de doble banda durante la replicación del
ADN y para que se reinicie este preceso es necesaria
la participación de los diferentes sistemas de recom-
binación, por lo que, como se había mencionado
antes, se considera a éstos como de mantenimiento.
Las defciencias en estos sistemas hacen que la re
-
activación de las horquillas de replicación, y por lo
tanto el crecimiento de los cultivos, sea más lenta
en relación con una cepa silvestre. En la
fgura 7
se
muestra la cinética de crecimiento de cultivos sin
irradiar de las diferentes cepas utilizadas. Durante
su progresión las horquillas de duplicación frecuen-
temente encuentran lesiones que las inactivan; éstas
aparecen ya sea durante condiciones normales de cre-
cimiento aerobio o bien por la exposición a agentes
que dañan al ADN. Cuando son cortes en la cadena
se convierten en rupturas dobles que son reparadas
principalmente por la vía RecBCD, mientras que si
encuentran otro tipo de lesiones, estas podrían dete-
ner la actividad de la polimerasa III de modo que se
formaría un hueco que sería reparado principalmente
por la vía RecFOR. En ambos casos intervendrían
mecanismos de recombinación ya sea para reparar
la ruptura doble o bien para reactivar las horquillas
y reiniciar la síntesis de ADN. Los defectos en genes
de las distintas vías de recombinación suponen un
retardo en la reactivación de las horquillas (o incluso
la muerte de las células) lo que llevaría un retardo en
el crecimiento de los cultivos. La ausencia de RecO
hace que los huecos (gaps) permanezcan por más
tiempo y que eventualmente se conviertan en RDB
que fnalmente podrían repararse por la vía RecBCD.
2000000
1800000
1600000
1400000
1200000
1000000
800000
Intensidad
600000
400000
200000
0
0
PQ30 (WT)
IN900 (xonA)
IN602 (recB)
IN901 (xonA/recJ)
IN400 (recJ)
IN237 (recO)
20
40
60
80
10
01
20
14
0160
Dosis (Gy)
Fig. 5.
Fragmentación de ADN para cada cepa a las diferentes
dosis de radiación. Los datos representan la sumatoria
de la intensidad de ±uorescencia presente en la zona de
ADN fragmentado
REPARACIÓN DE RDB EN CEPAS DE
E. coli
DEFECTUOSAS EN GENES DE RECOMBINACIÓN
55
100%
80%
60%
40%
20%
0%
50 Gy
20 minutos
PQ30 (wt)
IN602 (recB)
IN237 (recO)
IN400 (recJ)
IN900 (xonA)
IN901 (recJ, xonA)
Fragmentos
DLAP
MC
ircular
40 minutos
60 minutos
100 Gy 150 Gy
100%
80%
60%
40%
20%
0%
50 Gy
100 Gy 150 Gy
100%
80%
60%
40%
20%
0%
50 Gy
100 Gy 150 Gy
100%
80%
60%
40%
20%
0%
50 Gy
100 Gy 150 Gy
100%
80%
60%
40%
20%
0%
50 Gy
100 Gy 150 Gy
100%
80%
60%
40%
20%
0%
50 Gy
100 Gy 150 Gy
100%
80%
60%
40%
20%
0%
50 Gy
100 Gy 150 Gy
100%
80%
60%
40%
20%
0%
50 Gy
100 Gy 150 Gy
100%
80%
60%
40%
20%
0%
50 Gy
100 Gy 150 Gy
100%
80%
60%
40%
20%
0%
50 Gy
100 Gy 150 Gy
100%
80%
60%
40%
20%
0%
50 Gy
100 Gy 150 Gy
100%
80%
60%
40%
20%
0%
50 Gy
100 Gy 150 Gy
100%
80%
60%
40%
20%
0%
50 Gy
100 Gy 150 Gy
100%
80%
60%
40%
20%
0%
50 Gy
100 Gy 150 Gy
100%
80%
60%
40%
20%
0%
50 Gy
100 Gy 150 Gy
100%
80%
60%
40%
20%
0%
50 Gy
100 Gy 150 Gy
100%
80%
60%
40%
20%
0%
50 Gy
100 Gy 150 Gy
100%
80%
60%
40%
20%
0%
50 Gy
100 Gy 150 Gy
Fig. 6.
Cinética de reparación de las diferentes cepas estudiadas. Se presenta el porcentaje de Fuorescen
-
cia por zona en cada carril por dosis y tiempo de incubación para cada cepa. En el eje de las X se
representan las diferentes dosis utilizadas
J.H. Serment Guerrero
et al.
56
En el caso de las exonucleasas (RecJ y ExoI), estas
pueden intervenir tanto en el caso de rupturas dobles,
procesando extremos disparejos que no pudiera
reconocer la enzima RecBCD, como en el caso de la
aparición de cortes o huecos, extendiendo las regiones
de ADN de banda sencilla para que se puedan reparar
y reactivar. Se ha propuesto también que intervienen
en la reactivación por regresión de la horquilla, de
modo que las defciencias en estos genes retardan el
crecimiento de los cultivos (Cox 2001). La importancia
de cada uno de los defectos propuesta en el presente
trabajo coincide con el retardo en la cinética de cre-
cimiento, así como con los datos de supervivencia, lo
que reFeja la importancia de los genes de±ectuosos en
la reparación de rupturas dobles.
CONCLUSIONES
El empleo de la técnica de electroforesis por
pulsos es un método adecuado para demostrar la
formación de rupturas de doble banda en el ADN,
inducidas por la radiación gamma, pues los resulta-
dos encontrados concuerdan perfectamente con los
resultados reportados en el experimento realizado
empleando la técnica de microelectroforesis neutra
(ensayo cometa). La electroforesis por campos pul-
sados tiene la ventaja de ser un método relativamente
más sencillo ya que es más fácil la manipulación de
las muestras y en consecuencia el tiempo empleado
en su ejecución es considerablemente menor.
La respuesta celular al daño depende de la dosis
empleada, el estado de la célula y los mecanismos de
los que se valga para resarcir el daño; así por ejem-
plo, a una dosis mayor de radiación y con una pobre
recombinación, la célula tiene menos posibilidades
de tolerar el daño, pues se genera una mayor cantidad
de RDB que no pueden ser reparadas debido a la
defciencia en sus mecanismos de reparación, dando
por resultado una mayor letalidad.
Finalmente puede decirse que la importancia de
los genes implicados en la reparación de rupturas
dobles tiene el siguiente orden, de mayor a menor:
recB
>
xonA/recJ
>
xonA
>
recJ
>
recO
. De ello se
puede concluir que, si bien, las diversas vías de re-
combinación actúan preferentemente sobre un tipo
específco de estructuras en el ADN, en la realidad
esas vías son capaces de interactuar unas con otras
para lograr la supervivencia de la célula.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen a la C. Alicia Hernán-
dez Arenas por la valiosa ayuda técnica durante
el desarrollo de esta investigación. Este trabajo
está dedicado a la memoria de la M. en C. Matilde
Breña Valle, quien fuera Jefe del Departamento de
Biología del Instituto Nacional de Investigaciones
Nucleares.
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Fig. 7.
Cinética de crecimiento de cultivos bacterianos de las
diferentes cepas utilizadas
2.5
1.5
0.5
0
05
01
00
15
02
00
Tiempo (minutos)
PQ30 wt
IN400 recJ
IN900 xonA
IN602 recB
IN237 recO
IN901 recJ, xonA
300
400
250
350
2
1
Absorbencia 600 nm
REPARACIÓN DE RDB EN CEPAS DE
E. coli
DEFECTUOSAS EN GENES DE RECOMBINACIÓN
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