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SÍNTESIS Y BIODEGRADACIÓN DE POLIHIDROXIALCANOATOS:
PLÁSTICOS DE ORIGEN MICROBIANO
Yolanda GONZÁLEZ GARCÍA, Juan Carlos MEZA CONTRERAS
, Orfl
GONZÁLEZ REYNOSO
y Jesús Antonio CÓRDOVA LÓPEZ
Departamento de Madera, Celulosa y Papel, Universidad de Guadalajara
(Recibido diciembre 2011, aceptado noviembre 2012)
Palabras clave: polihidroxialcanoatos, polihidroxibutirato, despolimerasas, biopoliésteres
RESUMEN
Los polihidroxialcanoatos (PHA) son biopoliésteres sintetizados intracelularmente
por algunos microorganismos como reserva de carbono y energía que, una vez ex-
traídos de la célula, presentan propiedades físicas similares a plásticos derivados
del petróleo. A partir de la década de 1980 han sido estudiados intensivamente y
actualmente siguen siendo un tema de investigación importante, sobre todo como
sustitutos de los plásticos de origen petroquímico, ya que los PHA son comple-
tamente biodegradables y se producen a partir de fuentes de carbono renovables.
También tienen una aplicación importante como materiales biocompatibles en el
área biomédica y Farmacéutica. En este trabajo se presenta una revisión bibliográfca
extensa sobre las investigaciones realizadas respecto a la biosíntesis y la biodegra-
dación de los PHA, así como el estado actual de su producción y comercialización
a gran escala, y las perspectivas futuras en relación al estudio y aplicación de estos
bioplásticos.
Key words: polyhydroxyalkanoates, polyhydroxybutyrate, depolymerase, biopolyesters
ABSTRACT
Polyhydroxyalkanoates (PHA) are biopolyesters synthesized by numerous micro-
organisms as an intracellular carbon and energy storage compound, and they have
physical and chemical properties similar to those of petroleum-based plastics. They
have been extensively studied since 1980,
nowadays they are still an important
research topic as substitutes of conventional plastics since PHA are biodegradable
and synthesized from renewable resources. They also have an important applica-
tion as biocompatible materials in the biomedical and pharmaceutical feld. In this
work is presented an extensive bibliographic review about scientifc research on the
biosynthesis and biodegradation of
PHA, the status of its industrial production and
commercialization, and the future perspectives regarding the study and application
of these bioplastics.
REVISIÓN
Rev. Int. Contam. Ambie. 29 (1) 77-115, 2013
Y. González García
et al.
78
INTRODUCCIÓN
Los productos plásticos tienen cualidades muy
versátiles entre las que destacan su durabilidad y
resistencia a la degradación, por lo que tienen un uso
extendendido en la manufactura de una amplia varie-
dad de productos, los cuales resultan imprescindibles
para el estilo de vida actual (Khanna y Srivastava
2005). Estos productos son también parte esencial
de todas las industrias y en muchos casos han reem-
plazado el uso de vidrio y papel como materiales de
empaque. Su consumo anual se ha incrementado de
5 millones de toneladas, en 1950, a cerca de 200 mi
-
llones de toneladas al año actualmente. Sin embargo,
al ser resistentes a la degradación, su uso extensivo
genera desechos que se acumulan en el ambiente a
una tasa de 25 millones de toneladas al año, 40 %
de las cuales son dispuestas en rellenos sanitarios,
mientras que cientos de miles de toneladas son
arrojadas a ambientes marinos. Este hecho ocasiona
graves problemas, entre los que destacan el reque-
rimiento de grandes espacios para su disposición,
contaminación visual y muerte de animales que los
ingieren accidentalmente, entre otros (Reddy
et al.
2003, Salehizadeh y Van Loosdrecht 2004).
Se ha intentado atacar la problemática de la
acumulación de plásticos en el ambiente a través
de procesos de incineración, reciclaje, fotodegra-
dación o reuso. Sin embargo estas medidas presen-
tan desventajas por lo que no se consideran como
soluciones 100% efectivas. Por ejemplo, durante el
proceso de incineración se puede desprender ácido
cianhídrico y ácido clorhídrico con potenciales da-
ños para la salud. En el caso del reciclaje, este es
complicado y consume mucho tiempo, además de
que la presencia de muchos aditivos en los plásti-
cos, como pigmentos y cubiertas, limita el proceso
(Khanna y Srivastava 2005).
En vista de esta situación, la síntesis y uso de
plásticos biodegradables en lugar de los derivados
del petróleo se presenta como una solución efecti-
va. Actualmente ya existe la opción de utilizar un
tipo de bioplásticos producidos por fermentación,
llamados de manera genérica polihidroxialcanoatos
(PHA), y particularmente el polihidroxibutirato
(P3HB) y el polihidroxibutirato-co-hidroxivalerato
P(3HBco3HV), que se producen a escala comercial.
Sin embargo el precio de los PHA (2 a 5 euros/
kg) es todavía alto en comparación con el de los
plásticos derivados del petróleo, por lo que se están
tomando medidas para hacerlos más accesibles a
la población, entre las cuales Fguran mejoras en el
proceso de fermentación y extracción, así como aislar
y desarrollar cepas microbianas más productivas y
que puedan utilizar sustratos de bajo costo (Khanna
y Srivastava 2005).
La investigación sobre la producción de PHA ha
dado lugar a la obtención de cultivos con una con-
centración de polímero de más de 80 g/L y con una
productividad de más de 2 g/L/h, usando sistemas
por lote alimentado o continuo que potencialmente
podrían producir 50 000 toneladas por año (Salehi
-
zadeh y Van Loosdrecht 2004).
Además de los problemas por disponibilidad de
espacio y contaminación asociada a la producción
y desecho de plásticos sintetizados químicamente,
otra cuestión importante es la disponibilidad y el
precio del petróleo, que es la materia prima para la
producción de plásticos convencionales. Actualmente
se utiliza un 5 % del petróleo disponible mundial
-
mente para fabricar 200 millones de toneladas de
plásticos por año. Sin embargo para el año 2100 se
estima que la demanda de productos plásticos será
de 2000 millones toneladas anuales, para lo cual
será requerido usar el 50 % del petróleo disponible
en ese momento. Tal situación tendrá un impacto
en el precio de los plásticos, que se pronostica se
incrementará drásticamente.
Considerando la problemática planteada ante-
riormente, la síntesis y uso de plásticos de origen
microbiano podría ser una alternativa sustentable,
ya que se producen a partir de fuentes de carbono
renovables y tienen la ventaja de ser completamente
biodegradables, es decir, mineralizados por la ac-
ción de microorganismos. Aunado a este beneFcio
ambiental, actualmente el uso de bioplásticos como
materiales en el área médica y farmacéutica es de gran
interés, por lo que se está trabajando intensamente en
investigaciones cientíFcas y tecnológicas para estas
aplicaciones.
En esta investigación se presenta una revisión de
los principales estudios que se han hecho alrededor
del mundo, en relación con la biosíntesis y degra-
dación de polihidroxialcanoatos, que son plásticos
biodegradables de origen microbiano, similares a
los derivados del petróleo pero producidos a partir
de fuentes de carbono renovables, y que tienen
un gran potencial de uso en aplicaciones que van
desde la manufactura de productos desechables de
uso común, hasta la de productos biomédicos y
farmacéuticos de alto valor agregado. Se concluye
con un análisis sobre el futuro de las investigaciones
sobre este tema así como las aportaciones cientíF
-
cas hechas por investigadores latinoamericanos y
las áreas de oportunidad para el estudio de estos
biopoliésteres en México.
SÍNTESIS Y BIODEGRADACIÓN DE PHA
79
Defnición, estructura y propiedades de los poli
-
hidroxialcanoatos
Los PHA son polímeros de ácidos hidroxialcanoi-
cos que algunas bacterias, arqueas y microalgas acu-
mulan intracelularmente como material de reserva,
para usarlo posteriormente como fuente de carbono
y energía. La estructura general y nomenclatura de
estos compuestos se muestra en la
fgura 1
. La poli-
merización de los ácidos hidroxialcanoicos, por ac-
ción de enzimas intracelulares, tiene lugar mediante
condensación del grupo carboxilo de un monómero
(ácido hidroxialcanoico), con el grupo hidroxilo del
siguiente, formándose un enlace éster de allí que
también se les conozca como biopoliésteres (Khanna
y Srivastava 2005). Se acumulan como polímeros
líquidos, móviles y amorfos en forma de gránulos
que se alojan en el citoplasma microbiano rodeados
de una monocapa de fosfolípidos que contiene en-
zimas polimerasas y despolimerasas (
Fig. 2
). Las
investigaciones sobre el proceso de acumulación de
PHA indican que el número de gránulos por célula se
defne en las primeras etapas de acumulación y que
la producción del polímero cesa cuando su contenido
alcanza cerca del 80 % del peso celular en base seca.
Este fenómeno ha llevado a la conclusión de que
existen restricciones físicas que impiden a la célula
acumular más polímero, a pesar de la disponibilidad
de sustrato y actividad de la enzima PHA polimerasa
(Wang y Lee 1997). Estas inclusiones se observan
bajo el microscopio como gránulos esféricos de di-
Ferentes tamaños (Braunegg
et al.
1998) tal como se
muestra en la
fgura 3
.
Como se mencionó anteriormente, los PHA tienen
características físicas similares a las de los plásticos
derivados del petróleo, como el polipropileno y
polietileno, pero tienen la ventaja de que pueden ser
sintetizados a partir de fuentes de carbono renovables,
son biodegradables (pueden ser asimilados por mu-
chos microorganismos ya sea de suelos, mares, lagos
o aguas residuales) y son biocompatibles (no causan
eFectos tóxicos). Estas propiedades les conferen una
gran importancia como substitutos de los plásticos
convencionales (Anderson y Dawes 1990).
En relación con las condiciones bajo las cuales
ocurre la síntesis de los PHA, en la mayoría de los
O
O
H
CC
R
n
1
Hidrógeno
Poli (3-hidroxipropionato)
PHP
P3HB
P4HB
P5HV
Poli (3-hidroxibutirato)
Poli (4-hidroxibutirato)
Poli (5-hidroxivalerato)
Hidrógeno
Hidrógeno
Metil
2
3
R
Nombre del polímero
Símbolo
(CH
2
)
n
Fig. 1.
Estructura general de los PHA, y ejemplos de su no-
menclatura y símbolo según la longitud y posición de la
cadena lateral (R) (Lee 1995).
Membrana
Enzimas
polimerasas y
despolimerasas
PHA
Fig. 2.
Esquema del gránulo de PHA acumulado intracelular-
mente. Se aprecia la membrana que lo rodea en la que
se encuentran enzimas polimerasas y despolimerasas
(Sudesh
et al.
2000)
Gránulos de PHA
Fig. 3.
Células bacterianas con gránulos de PHA de diferente
tamaño y cantidad, observadas con microscopio óptico
(100x)
Y. González García
et al.
80
casos tiene lugar en respuesta a una limitación de
N, P, S, Mg u oxígeno (Reddy
et al
. 2003), aunado
a la presencia de un exceso de fuente de carbono en
el medio de cultivo. Sin embargo, también existen
bacterias que presentan una producción del polímero
asociada al crecimiento, aunque este caso es menos
frecuente. En el
cuadro I
se muestran los principales
nutrientes cuya limitación da lugar a la síntesis de
PHA en diferentes bacterias.
Respecto a su estructura monomérica, los PHA se
pueden clasifcar en varios tipos según la longitud de
la cadena de los ácidos hidroxialcanoicos de los que
están constituidos (
Fig. 4
). De esta manera, se defnen
como PHA de cadena corta (PHA-scl) aquellos polí-
meros compuestos por unidades monoméricas de 3 a
5 átomos de carbono, y como PHA de cadena media
(PHA-mcl) a los que se componen por monómeros
de 6 a 14 átomos de carbono. Sin embargo, también
existen PHA mixtos, es decir que se componen de
monómeros tanto de cadena corta como de cadena
media. El tipo de PHA sintetizado depende del mi-
croorganismo en cuestión, por lo que la mayoría sólo
produce PHA de cadena corta ó PHA de cadena media,
y sólo una pequeña parte de ellos es capaz de producir
PHA mixtos. Asimismo, los PHA se pueden presentar
como homopolímeros o copolímeros, dependiendo
también del tipo de microorganismo que se trate y las
fuentes de carbono usados (Anderson y Dawes 1990).
Hasta el momento se han descubierto más de 100 di-
ferentes unidades monoméricas como constituyentes
de los PHA (Lee 1996). En el
cuadro II
se muestra un
ejemplo de la variedad de monómeros que se pueden
presentar en un PHA. Es importante mencionar que
dependiendo de su composición monomérica, el bio-
poliéster presentará diferentes propiedades físicas, las
que se mencionarán posteriormente en este documento
(Babel y Steinbüchel 2001).
Respecto a la diversidad de microorganismos
productores de PHA, fuentes de carbono empleadas
y porcentajes de acumulación, se han reportado más
de 300 especies, principalmente bacterias, que uti
-
lizan sustratos que van desde carbohidratos, lípidos
y proteínas, hasta compuesto aromáticos, residuos
agroindustriales y gases, acumulando desde 1 hasta
80 % de polímero en relación al peso de su biomasa
en base seca.
Desde que los PHA se descubrieron por primera
vez , los investigadores de este tema se han referido
a ellos como compuestos de naturaleza lipídica, y
han dejado en claro que estos materiales son poliés-
teres insolubles en agua. La mayoría de los PHA son
polímeros parcialmente cristalinos y por lo tanto
sus propiedades térmicas y mecánicas usualmente
se representan en términos de la temperatura de
transición (T
g
) o de la temperatura de fusión (T
m
)
(Anderson y Dawes 1990). Estos valores se presen-
tan en el
cuadro III
para diferentes tipos de PHA.
El P3HB es una hélice levógira compacta que es
ópticamente activa con el centro quiral de la unidad
monomérica en la confguración R, esta estructura
es muy similar al polipropileno. Las propiedades
mecánicas como módulo de Young y la fuerza tensil
de estos biopolímeros también están cercanas a las
del polipropileno (Anderson y Dawes 1990).
CUADRO I.
PRINCIPALES NUTRIENTES CUYA LIMI
-
TACIÓN DA LUGAR A LA PRODUCCIÓN
DE PHA EN DIFERENTES MICROORGA
-
NISMOS (Babel y Steinbüchel 2001)
Microorganismo
Nutriente limitante
Alcaligenes latus
Pseudomonas oleovorans
Pseudomonas cepacia
Ralstonia eutropha
Rhodobacter sphaeroides
Nitrógeno
Pseudomonas
sp.
K.
Magnesio
Azotobacter vinelandii
Azotobacter beijerinckii
Rhizobium
ORS571
Oxígeno
Rhodospirillum rubrum
Rhodobacter sphaeroides
Caulobacter crescentus
Pseudomonas oleovorans
Fós±oro
Fig. 4.
Clasifcación de los PHA según su composición monomérica
Polihidroxialcanoatos (PHA)
PHA-scl
Monómeros de 3 a 5
Carbonos
PHA-mcl
Monómeros de 6 a 12
Carbonos
Monómeros de cadena
corta y media
Cadena Corta
Cadena Media
Híbridos
SÍNTESIS Y BIODEGRADACIÓN DE PHA
81
Los PHA de cadena corta son típicamente polí-
meros termoplásticos, que pueden ser moldeables
arriba de sus puntos de fusión. La temperatura de
fusión es relativamente alta (180 ºC) y su tempera-
tura de transición está entre –5 y 20 ºC. Este tipo de
PHA comúnmente exhibe un grado de cristalinidad
de 60 a 80 % el cual disminuye a 30 y 40 % a medida
que el contenido de 3HV incrementa a 30 mol %.
La incorporación de 3HV en el polímero también
provoca que tanto la T
m
como la T
g
disminuyan
CUADRO II.
PRINCIPALES MONÓMEROS QUE CONFORMAN LOS PHA PRO
-
DUCIDOS POR MICROORGANISMOS (Steinbüchel y Valentin 1995)
Símbolo
Nombre del monómero
Tamaño de la cadena
(# de carbonos)
Posición del
grupo hidroxilo
3HP
Ácido 3-hidroxi-propiónico
3
3
3HB
Ácido 3-hidroxi-butírico
4
3
3HV
Ácido 3-hidroxi-valérico
5
3
3HHx
Ácido 3-hidroxi-hexanoico
6
3
3HHp
Ácido 3-hidroxi-heptanoico
7
3
3HO
Ácido 3-hidroxi-octanoico
8
3
3HN
Ácido 3-hidroxi-nonanoico
9
3
3HD
Ácido 3-hidroxi-decanoico
10
3
3HUD
Ácido 3-hidroxi-undecanoico
11
3
3HDD
Ácido 3-hidroxi-dodecanoico
12
3
3HTD
Ácido 3-hidroxi-tetradecanoico
14
3
3HHxD
Ácido 3-hidroxi-hexadecanoico
16
3
4HB
Ácido 4-hidroxi-butírico
4
4
4HV
Ácido 4-hidroxi-valérico
5
4
4HHx
Ácido 4-hidroxi-hexanoico
6
4
4HHp
Ácido 4-hidroxi-heptanoico
7
4
4HO
Ácido 4-hidroxi-octanoico
8
4
4HD
Ácido 4-hidroxi-decanoico
10
4
5HV
Ácido 5-hidroxi-valérico
5
5
5HHx
Ácido 5-hidroxi-hexanoico
6
5
6HDD
Ácido 6-hidroxi-dodecanoico
12
6
CUADRO III.
PROPIEDADES FÍSICAS DE DIFERENTES TIPOS DE PHA Y SU COMPARACIÓN CON LAS
OBSERVADAS PARA PLÁSTICOS DERIVADOS DEL PETRÓLEO (Babel y Steinbüchel 2001)
Polímero
Temperatura de
fusión (ºC)
Módulo de
Young (GPa)
Fuerza tensil
(MPa)
Elongación
(%)
Temperatura de
transición (ºC)
P(3HB)
179
3.5
40
5
4
P(3HB-co-3HV)
3 mol % 3HV
170
2.9
38
*
*
14 mol % 3HV
150
1.5
35
*
*
25 mol % 3HV
137
0.7
30
*
*
P(3HB-co-4HV)
3 mol % 4HV
166
*
28
45
*
10 mol % 4HV
159
*
24
242
*
64 mol % 4HV
50
30
17
591
*
P(4HB)
53
149
104
1000
*
P(3HHx-co-3HO)
61
*
10
300
*
P(3HB-co-3HHx)
52
*
20
850
–4
Polipropileno
170
1.7
34.5
400
45
Polietileno-teraftalato
262
2.2
56
7300
3400
Poliestireno
110
3.1
50
*
21
Nylon- 6,6
265
2.8
83
60
*
* Información no disponible
Y. González García
et al.
82
signifcativamente, por lo que los copolímeros de
cadena corta son materiales más versátiles que el
homopolímero (Anderson y Dawes 1990).
En cuanto a los PHA de cadena media, estos son
altamente amorfos con una T
g
de entre –62 y –26 ºC
y T
m
de 42 a 58 ºC, por lo cual se clasifcan como
elastómeros.
Con respecto al peso molecular de los PHA, éste
depende de las condiciones de producción y recu-
peración de estos compuestos. Los mecanismos que
afectan y determinan el peso molecular de los PHA
en las células bacterianas aún no son completamente
entendidos, pero generalmente se atribuyen princi-
palmente al tipo de microorganismo y la fuente de
carbono usada (Anderson y Dawes 1990).
Por su parte, el método de recuperación del polí-
mero puede inFuenciar el peso molecular signifcativa
-
mente. La extracción con solventes orgánicos da lugar
a polímeros con peso molecular más alto, comparado
con la extracción a base de hipoclorito de sodio u otros
químicos. Debido a esto, existen PHA con una gran
variedad de pesos moleculares, tal como se observa en
el
cuadro IV
(Babel y Steinbüchel 2001). En general
el peso molecular promedio de P3HB producido por
bacterias silvestres está en el rango de 1 × 10
4
a 3 ×
10
6
con una polidispersidad en el rango de 1.8 a 2.7.
Historia sobre la investigación de los PHA
La observación al microscopio de gránulos re-
fráctiles en células bacterianas se remonta al año
1888. Sin embargo, la determinación de la composi-
ción de estos gránulos tuvo que esperar hasta 1925,
como resultado de los estudios de Lemoigne en la
bacteria
Bacillus megaterium
. En su investigación
observó que al degradarse, este material desconocido
liberaba ácido 3-hidroxibutírico y posteriormente
describió dicho material como un homopoliéster de
3-hidroxibutirato, o poli-3-hidroxibutirato (P3HB),
catalogándolo como un material de reserva (Brau
-
negg
et al
. 1998).
Durante las siguientes tres décadas, el interés
en el P3HB ±ue escaso y casi sólo se hicieron in
-
vestigaciones con bacterias del género
Bacillus
. La
propuesta de que el P3HB tenía un papel ±uncional
se hizo en el año de 1958 por Macrae y Wilkinson.
Estos científcos observaron que
B. megaterium
acu-
mulaba el homopolímero cuando la relación carbono
nitrógeno del medio era alta, y que la degradación
del mismo ocurría rápidamente en la ausencia de una
fuente de carbono y energía exógena. Concluyeron
que el P3HB era un material de reserva de carbono
y energía que retardaba la autolisis y muerte de las
células (Braunegg
et al
. 1998).
En los siguientes quince años tuvo lugar un pro-
ceso de investigación extensa sobre la producción de
este biopolímero en microorganismos fuera del géne-
ro
Bacillus
incluyendo a
Pseudomonas
,
Azotobacter
,
Hydrogenomonas, Chromatium, Cyanobacterium
y
muchas otras. También se iniciaron estudios sobre
las propiedades químicas y ±ísicas del P3HB, como
peso molecular, temperatura de fusión, cristalinidad,
morfología del gránulo, así como métodos de ex-
tracción, métodos de identifcación y cuantifcación,
metabolismo, enzimología, degradación y función
fsiológica (Babel y Steinbüchel 2001). En esta etapa
fue de particular interés encontrar la relación entre la
biosíntesis de P3HB y el ambiente extracelular. Las
condiciones que ±avorecen la síntesis de P3HB ±ueron
identifcadas como aquellas que daban lugar a altas
concentraciones de NAD(P)H y acetil-CoA, y baja
concentración de coenzima-A libre. Se observó que
estas condiciones variaban según el microorganismo,
pero la biosíntesis del polímero siempre involucraba
un factor de limitación de crecimiento como nitróge-
no, fósforo, azufre, oxígeno o magnesio (Anderson
y Dawes 1990).
El potencial del P3HB para ser usado en aplicacio
-
nes industriales fue reconocido por primera vez en la
primera mitad de la década de 1960, cuando surgieron
las primeras patentes relacionadas con su producción
a través de procesos de fermentación, extracción,
plastifcación y mezclado con otros materiales. Sin
embargo los plásticos derivados del petróleo eran
mucho más baratos en ese momento y no había razón
para pensar que los combustibles fósiles no fueran a
permanecer a bajo precio, además de que las políti-
cas de protección ambiental no estaban fuertemente
establecidas en esa época (Braunegg
et al
. 1998).
La trigésima quinta conferencia de la organización
de países exportadores de petróleo (OPEC) en Vie-
na en septiembre de 1973, comenzó una cadena de
eventos que cambiarían la situación con respecto a la
investigación sobre producción de plásticos alternos.
Los miembros de la OPEC decidieron incrementar los
precios del petróleo en un 70 %. Este incremento ±ue
CUADRO IV.
PESO MOLECULAR REPORTADO PARA
PHA PRODUCIDO POR DI²ERENTES BAC
-
TERIAS (Babel y Steinbüchel 2001)
Polímero
Peso molecular
Polidispersidad
(g/mol)
P3HB de
R. eutropha
939 000 – 1400 000
1.9 – 2.25
PHA de
P. oleovorans
178 000 – 330 000
1.8 – 2.4
PHA para
P. putida
56 000 – 112 000
1.6 – 2.3
SÍNTESIS Y BIODEGRADACIÓN DE PHA
83
seguido por otro más, anunciado en la conferencia de
Teherán en diciembre del mismo año, en esa ocasión
en un 130 %. En los años subsiguientes se dieron
nuevos incrementos lo cual dio lugar a la conclusión
de que las industrias de polímeros basados en petró-
leo no podrían sostenerse en un futuro, por lo que
comenzó una intensa investigación para encontrar
materiales plásticos alternos (Braunegg
et al
. 1998).
En 1976 la empresa Imperial Chemical Industries
(ICI) de Inglaterra comenzó a investigar si el P3HB
podría ser producido de manera económica por
fermentación bacteriana a partir de carbohidratos
procedentes de la agricultura. Como resultado de
estos estudios, las propiedades de biodegradabilidad
y biocompatibilidad de este biopolímero, así como
la posibilidad de usarlo como fuente de moléculas
ópticamente activas, fueron reconocidas como carac-
terísticas de valor agregado. Estos resultados hicieron
que ICI mantuviera el interés en la producción de
P3HB aún después de terminada la crisis petrolera
(Babel y Steinbüchel 2001).
En la década de 1980, Wallen y Davis reportaron
por primera vez el aislamiento de un biopoliéster con
propiedades físicas y químicas similares al P3HB
pero con una composición diferente. Más tarde los
análisis revelaron la presencia de 3-hidroxivalera
-
to (3HV), 3-hidroxibutirato, 3-hidroxihexanoato
(3HHx) y 3-hidroxiheptanoato (3HHp). Este fue
el primer reporte de un heteropolímero, y debido
a la diversidad de ácidos hidroxialcanoicos consti-
tuyentes estos biopolímeros (incluyendo el P3HB)
comenzaron a llamarse de manera general polihidro-
xialcanoatos (PHA). Muchos otros descubrimientos
se hicieron en la década de 1980 en relación con la
diversidad de monómeros constituyentes de los PHA,
e ICI registró varias patentes para la producción, ex
-
tracción y procesado de estos nuevos heteropolímeros
(Braunegg
et al
. 1998).
Actualmente los PHA ya se producen comercial-
mente. Entre los más importantes está un copolímero
de 3HB y 3HV, que tiene un porcentaje de 1 a 24 mol
% de 3HV. Éste se produce con la bacteria
Ralstonia
eutropha
y se comercializa con la marca Biopol ma
-
nufacturado inicialmente por la empresa ICI (Zeneca),
posteriormente vendida a Monsanto (1996) y Fnal
-
mente obtenida por Metabolix (2001). La producción
para el año 1988 fue del orden de las 800 toneladas.
Biopol también se ha producido y vendido en EUA
bajo el nombre de P3HBV y se ha vendido también en
Japón. Otra empresa productora de estos polímeros es
la austriaca Chemie Linz, la cual produjo comercial-
mente P3HB durante la década de 1980 y principio de
la de 1990, usando la bacteria
Alcaligenes latus
, que
es una cepa de rápido crecimiento que puede sintetizar
P3HB durante crecimiento sin limitación de nutrientes
(Braunegg
et al
. 1998). En Brasil existe otra empresa
productora de P3HB llamada Biocycle. En esta indus
-
tria se integra la producción de P3HB a la producción
de etanol a partir de azúcar de caña. Muchas otras
compañías lo han producido o producen actualmente
y en el
cuadro V
se muestran las más importantes.
Aplicaciones de los PHA
Los PHA exhiben pesos moleculares relativamen-
te altos, características termoplásticas o elastoméricas
y otras propiedades físicas y mecánicas que los hacen
candidatos para varias aplicaciones en la industria
de empaques, medicina, farmacia, agricultura y
alimentos, o como materias primas para la síntesis
de químicos enantioméricamente puros y para la
producción de pinturas (Babel y Steinbüchel 2001).
En el caso del P3HB, que es un termoplástico
con propiedades similares al polipropileno, se usa
principalmente para técnicas de moldeado. En
cambio los copolímeros de P(3HBco3HV), tienen
aplicaciones como material de empaque, productos
higiénicos, agrícolas y biomédicos. La aplicación
más conocida de estos biopolímeros de cadena corta
es para la fabricación de botellas desechables para
champú, contenedores para productos alimenticios,
bolsas y otros productos desechables como pañales,
servilletas, rastrillos, vasos y cubiertos (Anderson y
Dawes 1990).
También es posible usarlos en la forma de látex
acuoso para cubierta de materiales Fbrosos como
papel o cartón. Debido a su resistencia al agua, esta
cubierta protege al papel o cartón contra el deterioro
causado por la humedad. Otra aplicación de interés
es su uso como material de empaque dado que estos
PHA presentan una baja difusividad de oxígeno
(Babel y Steinbüchel 2001).
En cuanto a las aplicaciones de los PHA de cadena
corta en la agricultura, éstas consisten en macetas
biodegradables, tubos de irrigación y matrices para
la liberación controlada de factores de crecimiento,
pesticidas y herbicidas. Una ventaja en este campo
de aplicación es que no se requiere un grado de puri-
Fcación muy alto del polímero, lo cual puede facilitar
el proceso de extracción y hacerlo más económico
(Babel y Steinbüchel 2001).
Con respecto a las aplicaciones biomédicas, éstas
se basan en la propiedad de los PHA de ser biocom-
patibles con el tejido humano y reabsorbidos a una
baja velocidad. Cuando este material se implanta en el
cuerpo se hidroliza en metabolitos biocompatibles, por
lo que se ha usado como hilo para sutura, sustitutos pe-
Y. González García
et al.
84
ricárdicos y sistemas de liberación de medicamentos.
También se ha propuesto usarlos para fabricar jeringas
desechables y lubricantes para guantes de cirugía.
Dentro de las aplicaciones biomédicas, también está
su uso como material osteosintético o de fjación para
estimular la formación de hueso, así como el uso de
sus productos de hidrólisis como materia prima para la
industria farmacéutica en la que se requieren moléculas
estero específcas (Babel y Steinbüchel 2001).
Dado que el P3HB y el P(3HBco3HV) han es
-
tado disponibles por varios años, el desarrollo de
productos a partir de estos polímeros ha avanzado
más que en el caso de los PHA de cadena media.
Las investigaciones sobre estos últimos indican que
podrían usarse para la fabricación de adhesivos, los
cuales actualmente no son biodegradables y se hacen
con base en polímeros sintéticos como, estireno y
acetato de etilenvinil.
Otra aplicación de estos PHA se encuentra en el
área de alimentos, específcamente como cubierta
para quesos, que comúnmente son materiales no bio-
degradables con base en acetato de polivinilo, látex
y ácido dibutil maleico (Babel y Steinbüchel 2001).
Los PHA de cadena media también se usan en
la fabricación de hule biodegradable. Actualmente,
los hules naturales y sintéticos como el de isopre-
no, estireno-butadieno, cloropreno y poliuretanos,
se usan en aplicaciones como pañales, guantes,
bandejas quirúrgicas, moldes y otros productos que
son difíciles de reciclar o reusar. En investigaciones
recientes se ha logrado fabricar hule biodegradable
a partir de PHA de cadena media insaturados, por
medio de enlaces entre los mismos. Esto se ha logra-
do por medio de reacciones químicas con sulfuros
o peróxidos, o utilizando radiación UV. En general
los PHA pueden ser manufacturados en diferentes
materiales y formas, procesándolos con equipos
convencionales para poliolefnas u otros plásticos,
por ejemplo los de moldeado y extrusión. También
pueden ser procesados en látex o en solución con
diferentes solventes. Hasta el momento las aplica-
ciones comerciales han sido desarrolladas solamente
para el producto Biopol. Este material ha sido
procesado en botellas biodegradables para champú
y para aceite para motor. Además, varios contene-
dores, rastrillos y bandejas para pescado y carne
en la sección de refrigeradores en supermercados
han sido manuFacturados con Biopol y vendidos en
Japón. En estos casos, este producto es usado por su
imagen ambientalmente amigable para incrementar
CUADRO V.
PRINCIPALES COMPAÑÍAS PRODUCTORAS DE PHA A GRAN ESCALA (Chen 2010)
Compañía
País
Tipo de PHA
Producción (Ton/año)
Aplicación
ICI
Inglaterra
P3HBV
300
Material de empaque
Chemical Linz
Austria
P3HB
20-100
Material de empaque, liberación de fármacos
BT±
Austria
P3HB
20-100
Material de empaque, liberación de fármacos
Biomers
Alemania
P3HB
*
Material de empaque, liberación de fármacos
BAS±
Alemania
P3HB, P3HBV
Piloto
Mezcla con ECO±LEX
Metabolix
EUA
Varios
*
Material de empaque
Tepha
EUA
Varios
*
Implantes biomédicos
ADM
EUA
Varios
50 000
Materia prima
P&G
EUA
Varios
Variable
Material de empaque
Monsanto
EUA
P3HB, P3HBV
*
Materia prima
Meredian
EUA
Varios
10 000
Materia prima
Kaneka
Japón
Varios
*
Material de empaque
Mitsubishi
Japón
P3HB
10
Material de empaque
Biocycle
Brasil
PHA
100
Materia prima
Bio on
Italia
Varios
10 000
Materia prima
Zhejian Tian An
China
P3HBV
2 000
Materia prima
Jiangmen Biotech
China
P3HBcoH3Hx
*
Materia prima
Yikeman
China
PHA
3 000
Materia prima
Tianjin Northern
China
P3HB
Piloto
Materia prima
Shantou Lianyi Biotech
China
Varios
Piloto
Materia prima, uso biomédico
Jiangsu Nan
China
P3HB
Piloto
Materia prima
Shenzeng O’Biomer
China
Varios
*
*
Tianjing Green Bioscience
China
P3HBco4HB
10 000
Materia prima, material de empaque
Shangdong Lukang
China
Varios
Piloto
Materia prima, uso biomédico
*InFormación no disponible
P3HBV = Copolímero de 3-hidroxibutirato y 3-hidroxivalerato; P3HBcoH3Hx = Copolímero de 3-hidroxibutirato y 3-hidroxihexa
-
noato; P3HBco4HB = Copolímero de 3-hidroxibutirato y 4-hidroxibutirato
SÍNTESIS Y BIODEGRADACIÓN DE PHA
85
su venta y para otras aplicaciones que requieren
biodegradabilidad por razones funcionales (Babel
y Steinbüchel 2001).
En general, debido a su biodegradabilidad, resis-
tencia al agua e impermeabilidad al oxígeno, los PHA
pueden ser usados para todo tipo de material biode-
gradable. También se estima que su uso en artículos
sanitarios desechables es económicamente factible.
Otros mercados que se observan como prometedores,
son de los de materiales de pesca, construcción e
industria agrícola (Babel y Steinbüchel 2001).
En cuanto al potencial para aplicaciones biomé-
dicas, éste es alentador, dado que el valor agregado
de estos productos especiales es muy alto y técnica
y económicamente parecen ser muy factibles.
Recientemente el desarrollo de pinturas y recubri-
mientos ambientalmente amigables basadas en PHA
de cadena media, indica que tienen un potencial en
países en donde las pinturas con base en solventes
orgánicos han empezado a ser restringidas por sus
gobiernos (Babel y Steinbüchel 2001).
Técnicamente, las perspectivas de los PHA son
muy prometedoras, si el precio de estos materiales
pudiera ser reducido, su aplicación sería muy atracti-
va. En este momento existe un esfuerzo mundial para
producir PHA a partir de plantas como maíz y papa;
así como la búsqueda de tecnologías baratas para su
producción y uso en la manufactura de productos
de uso diario. En este contexto, se está recurriendo
a la búsqueda de cepas microbianas que por un lado
sean capaces de producir PHA, y por otro, puedan
emplear como sustratos residuos de las industrias
agrícolas y pecuarias.
Rutas de biosíntesis de PHA en microorganismos
Como se ha mencionado previamente, el PHA
más estudiado es el P3HB producido por la bacteria
Ralstonia eutropha
por lo que la ruta de biosíntesis en
este microorganismo a partir de carbohidratos ha sido
descrita a detalle. En general el proceso metabólico
para la producción de PHA de cadena corta comien-
za a partir de acetil-CoA, en una secuencia de tres
reacciones catalizadas por las enzimas 3-cetotiolasa
(acetil-CoA acetiltransferasa, EC 2.3.1.9), acetoacetil-
CoA reductasa (hidroxibutiril-CoA deshidroge-
nasa, EC 1.1.1.36) y la poli(3-hidroxibutirato)
sintetasa (
Fig. 5
) (Anderson y Dawes 1990). Las
rutas metabólicas para la biosíntesis de P3HB
también han sido estudiadas en otras bacterias y las
enzimas involucradas en el proceso también han sido
caracterizadas. La enzima 3-cetotiolasa de bacterias
como
Azotobacter beijerinckii
,
Ralstonia eutropha,
Zooglea ramigera
y
Rhizobium japonicum
ha sido
puriFcada y estudiada. Esta enzima ha mostrado ser
la que controla la biosíntesis de P3HB en
R. eutropha
,
con la CoA como el metabolito clave. Por su parte la
enzima acetoacetil-CoA reductasa ha sido investigada
en las bacterias
Azotobacter beijerinckii, Rhodopseu-
domonas spheroides, Rhodomicrobium vannielii
y
Streptomyces coelicolor
.
Con respecto a la P3HB sintetasa, se ha descu
-
bierto que en la mayoría de los casos está asociada
con los gránulos de P3HB (
Fig. 2
), como en el caso
de
R. eutropha
,
R. rubrum, B. megaterium, A. bei-
jerinckii
y
Z. ramigera.
(Anderson y Dawes 1990).
También se ha encontrado que existen cuatro clases
principales de PHA sintetasas. Las clases I y II son
Carbohidratos
NAD(P)H
NADH
NAD(P)
+
NAD+
Acetil-CoA
Acetoacetil-CoA
ß
-cetotiolasa
Acetoacetil-CoA sintetasa
Acetoacetil-CoA
reductasa
PHB sintetasa
PHB despolimerasa
3-hidroxibutirato
deshidrogenasa
3-hidroxibutiril-CoA
Poli (3-hidroxibutirato)
3-hidroxibutirato
Acetoacetato
Fig. 5.
Ruta metabólica para la síntesis y degradación intracelular de P3HB a
partir de carbohidratos. Se indican las principales enzimas implicadas
en el proceso (Babel y Steinbüchel 2001).
Y. González García
et al.
86
enzimas que consisten en un solo tipo de subunidad
(PhaC). Según su especifcidad de sustrato, tanto
in
vivo
como
in vitro
, la clase I utiliza preFerentemente
tioésteres-CoA de (R)-3-hidroxiácidos grasos de 3
a 5 átomos de carbono; mientras que las sintetasas
clase II usan tioésteres-CoA de (R)-3-hidroxiácidos
grasos de entre 6 y 14 átomos de carbono. La clase III
de PHA sintetasas son enzimas que tienen dos tipos
diferentes de subunidades, la PhaC y la PhaE. Las
PHA sintetasas de la clase IV se parecen a las de la
clase III pero en lugar de la subunidad PhaE tienen
una subunidad PhaR. La polimerasa tipo III existe en
Chromatium vinosum, Thiocystis violacea, Thiocapsa
pfennigii
y
Synechocystis
sp. PCC 6803. Este tipo de
enzima polimeriza principalmente hidroxiácidos de
cadena corta, pero también puede polimerizar a los
de cadena media (Rehm 2003).
Uno de los estudios más detallados sobre la regula-
ción de la síntesis de P3HB es el realizado en
A. beije-
rinckii
. Esta bacteria acumula P3HB bajo condiciones
de limitación por oxígeno a partir de glucosa. La clave
del control de la síntesis en este microorganismo es el
destino de la acetil-CoA, la cual puede ser oxidada vía
el ciclo de los ácidos tricarboxílicos (CAT) o puede
servir como sustrato para la síntesis de P3HB. La ruta
que tome la acetil-CoA depende de las condiciones
ambientales, especialmente limitación por oxígeno
cuando la relación NADH/NAD aumenta. La citrato
sintetasa y la isocitrato deshidrogenasa se inhiben por
el NADH y en consecuencia la acetil-CoA no entra al
CAT en la misma cantidad, por lo que es convertida a
acetoacetil-CoA por la 3-cetotiolasa la que a su vez es
inhibida por CoA. Cuando la cantidad de oxígeno es
adecuada, la concentración de CoA es alta y la acetil-
CoA entra al ciclo CAT mientras que la 3-cetotiolasa
es inhibida y consecuentemente la síntesis de P3HB
cesa (Babel y Steinbüchel 2001).
Senior y Dawes (1971) propusieron que el P3HB
servía no solamente como reserva de carbono y ener-
gía, sino que es un resumidero de poder reductor, con-
siderado como un regulador redox dentro de la célula.
Bajo condiciones de crecimiento limitadas por otros
nutrientes se deja de sintetizar proteína y un proceso
endergónico acoplado a la generación de ATP, vía
la cadena de transferencia de electrones, podría dar
lugar al incremento de la concentración intracelular
de NAD(P)H propiciando un proceso similar al ya
comentado anteriormente para
A. beijerincki
En cuanto a la degradación interna del gránulo
de P3HB, es también es un mecanismo complejo
que requiere de la acción de varias despolimerasas
(Luengo
et al
. 2003) el cual se describirá más ade
-
lante en este documento.
Generalmente las bacterias que sintetizan P3HB
no producen PHA de cadena media, sin embargo con
microorganismos recombinantes se pueden lograr
mezclar las rutas metabólicas y producir polímeros o
copolímeros con monómeros de cadena corta, media
o ambas (Babel y Steinbüchel 2001).
Con respecto a la ruta metabólica para la biosín-
tesis de PHA de cadena media, la más estudiada es
la que presentan las bacterias del género
Pseudomo-
nas
. Por ejemplo, en
Pseudomonas oleovorans
los
genes para la biosíntesis de PHA están presentes en
el operón phaC1zC2D que codifca para dos poli
-
merasas, PhaC1 y PhaC2, una despolimerasa (Paz)
y la proteína PhaD. Las dos polimerasas catalizan la
condensación en PHA de varios derivados de 3-hi
-
droxiacil-CoA con cadenas de entre 6 y 14 carbonos.
La mayoría de los intermediarios para la síntesis de
PHA de cadena media se obtienen a partir de la
b
-
oxidación (
Fig. 6
), aunque algunos otros monómeros
pueden obtenerse de otras rutas (Luengo
et al
. 2003).
En el proceso de producción de PHA la provisión
de 3-hidroxiacil-CoA tioésteres a la ruta metabólica,
es decir la concentración de sustrato para la PHA
sintetasa, es uno de los principales factores que
determinan la masa molecular y la composición del
biopoliéster, aunque también in±uye la existencia de
despolimerasas, esterasas o lipasas inespecífcas que
hidrolicen el polímero ya acumulado. Otro factor es
el nivel de expresión de la proteína de PHA sintetasa
activa (Rehm 2003). Por su parte la composición
del PHA depende estrictamente de la especifcidad
de sustrato de la PHA sintetasa y del potencial
metabólico del microorganismo para proveer (R)-
3-hidroxiacil-CoA tioésteres a partir de la Fuente de
carbono empleada (Rehm 2003).
Técnicas analíticas para la detección, cuantif
-
cación y caracterización de PHA
Detección
Tradicionalmente la detección de gránulos de
PHA en células microbianas se ha llevado a cabo por
medio de la tinción con el colorante lipofílico negro
Sudán B, debido a la naturaleza lipídica de los PHA.
Sin embargo actualmente existen otros colorantes
que tienen mayor afnidad y especifcidad por com
-
puestos de naturaleza lipídica entre los que destaca
el azul Nilo A (cloruro de 5-amino-9-dietilamino-
benzo [alfa] fe nazonio), que pertenece a la familia
de las oxazinas y que presenta una ±orescencia
naranja a una longitud de onda de 460 nm (Ostle
y Holt 1992). El rojo Nilo (7-diethilamino-3,4-
benzoFenoxazina-2-ona) es también un colorante
excelente para la detección de inclusiones intrace-
SÍNTESIS Y BIODEGRADACIÓN DE PHA
87
lulares de este tipo (
Fig. 7
). Los gránulos de PHA
una vez teñidos presentan una fuorescencia que va
del amarillo-dorado (excitación de 450-500 nm) al
rosa-rojo (excitación de 515-560 nm) (Greenspan
y Fowler 1985).
Por otro lado, la detección de PHA intracelular
también puede llevarse a cabo mediante espectrosco-
pia de in±rarrojo (FT-IR). Los espectros de PHA con
esta técnica exhiben un pico alrededor de los 1730
nanómetros correspondiente al enlace éster carbonilo
característico de los PHA (
Fig. 8
) (Hong
et al
. 1999).
Extracción
La metodología reportada más frecuentemente
para la extracción de PHA de la biomasa microbiana
ha sido el uso de hidrocarburos clorados, especial-
mente la técnica utilizando refujo con cloro±ormo
(Fuchtenbusch
et al
. 1996). La solución de PHA
resultante se ²ltra para remover restos de células,
luego se concentra y el PHA se precipita en meta-
nol o etanol (
Fig. 9
). Con esta técnica los lípidos
de bajo peso molecular se queden en solución y no
inter²eren con la determinación. El uso de solventes
clorados es más utilizado para la extracción de PHA
de cadena corta como el P3HB, sin embargo los
PHA se cadena media son solubles en un rango de
solventes más amplio. Debido a que el uso a gran
escala de los solventes mencionados anteriormen-
te puede ser costoso, también se han desarrollado
otros procesos de extracción con base en el uso de
etilen y propilen carbonato (Fiorese
et al.
2009), así
como metodologías que se basan en la liberación del
polímero de las células mediante la ruptura de las
mismas usando soluciones de hipoclorito de sodio,
ácidos o bases.
Fuente de carbono (ácido graso)
Fuente de carbono (Carbohidrato)
Acil-CoA
Acil-ACP
Enoil-ACP
Acetil-CoA
Malonil-CoA
Malonil-ACP
3-Cetoacil-ACP
3-Cetoacil-CoA
Enoil-CoA
(s)-3-Hidroxiacil-CoA
I. Vía ß-oxidación
II. Vía Síntesis de ácidos grasos
(R)-3-Hidroxiacil-CoA
(R)-3-Hidroxiacil-ACP
PHA
Fig. 6.
Ruta para la síntesis de PHA de cadena media en Pseudomonados. Se
presenta la vía a partir de ácidos grasos y a partir de carbohidratos (Babel
y Steinbüchel 2001).
Fig. 7.
Células bacterianas en etapa de acumulación de PHA,
teñidas con rojo Nilo y observadas bajo microscopio de
fuorescencia (100x). Se aprecia claramente la emisión
de fuorescencia que indica la presencia de PHA.
Y. González García
et al.
88
Cuantifcación y análisis fsicoquímico
Con respecto a la cuantifcación de PHA uno de
los métodos que se utilizaron inicialmente fue el
gravimétrico, que consiste en usar cloroformo como
solvente para extraer el polímero de la biomasa lio-
flizada, posteriormente precipitarlo con dietil éter
o acetona, y fnalmente secarlo y pesarlo (Grothe
et
al.
1999). Otra metodología para hacer la cuantif
-
cación gravimétrica se basa en el hecho de que, bajo
condiciones controladas de tiempo y temperatura,
el material celular (excepto los gránulos de P3HB)
se disuelve en una solución alcalina de hipoclorito
de sodio de manera que el bioplástico se libera y
es recuperado por centrifugación y posteriormente
secado y pesado (Hahn
et al.
1994).
Por su parte, la técnica espectrofotométrica para
la cuantifcación de P3HB se basa en la conversión
del polímero a ácido crotónico mediante el uso de
ácido sulfúrico concentrado y la aplicación de calor.
El ácido crotónico producido se cuantifca por espec
-
troFotometría UV leyendo absorbancia a 230 nm y
correlacionando los valores con una curva estándar
del ácido (Law y Sleepecky 1961).
Respecto a la técnica cromatografía de gases
(CG), la más utilizada se fundamenta en la metodo-
logía desarrollada por Braunegg
et al.
(1978) que
consiste en someter a las células lioflizadas a una
metanólisis ácida o alcalina. Con este proceso se
generan metal ésteres de los monómeros que com-
ponen el PHA y posteriormente se analizan por CG
con detector de ionización de ±ama. Mediante el
uso de un CG acoplado a un detector de masas, esta
técnica no sólo Funciona para cuantifcar PHA sino
también para determinar su composición monomérica
(Mittendorf
et al.
1998).
La determinación de PHA en células intactas utili-
zando espectroscopia de ±uorescencia bidimensional
y citometría de ±ujo, también ha sido propuesta. En
este procedimiento las células teñidas con azul Nilo
Transmitancia (%)
100
80
60
40
20
0
4000
3000
2000
1721.0000
1000
Número de onda (cm
–1
)
Fig. 8.
Espectro ²T-IR de un estándar de P3HB (²luka). Se aprecia claramente el pico a 1721
cm
–1
correspondiente al enlace éster carbonilo característico de los PHA.
FERMENTACIÓN
RECUPERACIÓN
PROCESAMIENTO
Extracción de PHA
Material especial
Material de uso común
ETAPA 1
Producción de biomasa
Cosecha
de
células
Solventes
orgánicos/
Precipitación
Requiere purificación
previa: Aplicación
biomédica, farmacéutica,
síntesis orgánica
Procesamiento directo:
Empaques, productos
desechables,
recubrimientos
Solubilización de
biomasa/Filtración/
Centrifugación
Acumulación de PHA
ETAPA 2
Fig. 9.
Esquema general de producción de PHA, en el que se
indican las características de los procesos de fermenta-
ción, recuperación y procesamiento del polímero según
su uso fnal (Babel y Steinbüchel 2001).
SÍNTESIS Y BIODEGRADACIÓN DE PHA
89
muestran un máximo de fuorescencia entre 570 y
605 nm cuando son excitadas entre 540 y 560 nm,
y se ha encontrado una buena correlación entre la
intensidad de fuorescencia y la concentración de
PHA (Vidal-Mas 2001).
Otro método de cuantiFcación es la cromatogra±ía
iónica que se basa en la conversión de los monómeros
de PHA a ácidos alcanoicos mediante propanólis áci-
da seguida de una hidrólisis alcalina con Ca(OH)
2,
o
ácida con H
2
SO
4
concentrado. La muestra se inyecta
en una columna aniónica con detector de conducti-
vidad (Hesselmann
et al.
1999).
También se ha establecido un método de cuanti-
Fcación enzimática de PHA a partir del equipo desa
-
rrollado por Roche Molecular Biochemicals, de los
EUA (No. 127833). La técnica implica la oxidación
de 3HB y la reoxidación del NADH producido a partir
de NAD dando lugar a la producción de formazan,
que se lee espectro±otométricamente a 492 nm.
En cuanto a las técnicas para determinar la com-
posición monomérica, peso molecular y propiedades
térmicas de los PHA destacan: la cromatografía de
gases acoplada a masas y la resonancia magnética
nuclear (RMN); la cromatogra±ía de Fltración en
gel; y la calorimetría di±erencial de barrido, respec
-
tivamente. En el caso de las técnicas por NMR éstas
se han aplicado exitosamente en el estudio de la es-
tructura de los PHA. El análisis del espectro H RMN
permite determinar la composición del polímero y
la distribución de las unidades monoméricas puede
deducirse de las secuencias de diadas y triadas por
análisis espectral de
13
C RMN. Jacob
et al.
(1986)
demostraron que era posible también utilizar espectro
13
C RMN de polarización cruzada de células lioF
-
lizadas para monitorear directamente, y de manera
no destructiva, PHA acumulado intracelularmente.
En relación con la metodología utilizada para la de-
terminación de peso molecular, la cromatografía de
exclusión molecular o cromatogra±ía de Fltración en
gel utilizando como solvente cloro±ormo a 30 ºC, un
conjunto de columnas de exclusión molecular y es-
tándares de poliestireno de baja polidispersidad (Lee
et al.
1995) es la que se aplica con mayor ±recuencia.
Para la determinación de las propiedades térmicas se
utiliza la calorimetría diferencial de barrido debido a
que los PHA son polímeros parcialmente cristalinos,
y la deFnición de sus propiedades térmicas y mecá
-
nicas se expresa en términos de las temperaturas de
transición de la fase amorfa y de la temperatura de
±usión de la ±ase cristalina (Zagar y Krzan 2004).
Procesos de fermentación para producir PHA
Muchas bacterias se han investigado para la pro-
ducción de PHA, principalmente de cadena corta.
Con base en esto se han desarrollado procesos y
sistemas de cultivo muy variados, y se ha estudiado
la infuencia de di±erentes parámetros sobre la síntesis
de estos biopoliésteres a partir de una gran diversidad
de sustratos simples y complejos. En la
Fgura 9
se
presenta un esquema general de producción de estos
biopolímeros. Los rendimientos y productividades
alcanzadas por varios microorganismos cultivados
en diferentes sistemas de cultivo, a partir de diversos
sustratos, se pueden apreciar en el
cuadro VI
.
De manera general las bacterias usadas para la
producción de PHA pueden ser divididas en dos gru-
pos, según las condiciones de cultivo que requieren
para la síntesis del polímero. El primer grupo de
bacterias requiere de la limitación de un nutriente
esencial (nitrógeno, fósforo, azufre, magnesio, oxí-
geno), para sintetizar PHA a partir de un exceso de
fuente de carbono. Este grupo incluye a
Ralstonia
eutropha
,
Pseudomonas extorquens
y
Pseudomonas
oleovorans,
entre otras (Khanna y Srivastava 2005).
El segundo grupo de bacterias no requiere de la
limitación de nutrientes para la síntesis de PHA y pue-
den acumular polímero en grandes cantidades durante
la fase de crecimiento. Este grupo incluye a
Alcalige-
nes latus,
Azotobacter vinelandii
recombinante y
E.
coli
recombinante, entre otras, que acumulan grandes
cantidades de polímero durante la fase de crecimiento
exponencial (> 50 %), a di±erencia del otro grupo de
bacterias que durante esta fase acumulan muy bajas
cantidades de polímero (Braunegg
et al
. 1998).
Con respecto a las estrategias de cultivo para la
producción de PHA, se ha visto que se puede alcan-
zar una productividad alta mediante cultivo por lote
alimentado o cultivo continuo. Para cultivo por lote
alimentado de bacterias que requieren de la limitación
por algún nutriente para sintetizar PHA, se utiliza un
sistema en dos etapas. En la primera se obtiene una
concentración de biomasa deseada sin limitación
de nutrientes. En la segunda etapa se promueve la
síntesis de PHA manteniendo en concentraciones
limitantes uno de los nutrientes esenciales. En esta
segunda etapa la concentración biomasa sin-PHA
permanece casi constante y el incremento en biomasa
se debe a la acumulación intracelular del polímero.
R.
eutropha
acumula una gran cantidad de PHA (hasta
80 % de su peso en base seca) cuando la ±uente de
nitrógeno o fósforo es totalmente consumida y aún
hay glucosa disponible en el medio. Por otro lado,
otras bacterias de este mismo tipo producen PHA
más eFcientemente cuando uno de los nutrientes está
limitado, pero no totalmente consumido (Khanna y
Srivastava 2005).
Y. González García
et al.
90
CUADRO VI.
PRODUCCIÓN DE PHA A PARTIR DE DIVERSOS SUBSTRATOS Y CEPAS MICROBIANAS
Microorganismo
Sustrato
Tiempo
(h)
Biomasa
(g/L)
PHA
Referencia
(g/L)
(% )
Bacterias
Aeromonas hydrophyla
4Ak4
Ácido láurico, 1,4 butanediol
72
3.3
23.6
Xie y Chen (2007)
Aeromonas hydrophyla
4AK4
Dodecanoato, propionato
60
2.7
37.2
Zhao
et al.
(2007)
Aeromonas hydrophyla
CQ4
Dodecanoato, gluconato
48
4.5
44.7
Qin
et al.
(2007)
Alcaligenes latus
Residuos de malta
69
70.1
Cai
et al.
(2008)
Alcaligenes latus
Jugo de maple
77
Yezza
et al.
(2007)
Alcaligenes latus
Sacarosa + propiónico
4.7
1.9
43
Ramsay
et al.
(1990)
Alcaligenes latus
Sacarosa
112
98.5
88
Wang y Lee (1997a)
Alcaligenes latus
Sacarosa
18
143
71.5
50
Yamane
et al.
(1996)
Azotobacter beijerinckii
9067
Glucosa
70.4
Stockdale
et al.
(1968)
Azotobacter chroococcum
Almidón
70
54
24.8
46
Kim y Chang (1998)
Azotobacter chroococcum
H23
Alpechín
5.7
50.6
González López (1996)
Azotobacter vinelandii
Glucosa + peptona pescado
30
25.5
85
Page
et al
. (1997)
Azotobacter vinelandii
Sacarosa
47
40
31.9
79.8
Page y Comish (1993)
Azotobacter vinelandii
Melazas
36
66
Page (1992)
Bacillus cereus
EGU3
Glucosa
20
0.8
0.5
66.6
Porwal
et al.
(2008)
Bacillus megaterium
SRKP-3
.
Residuos lácteos
36
11.3
Pandian
et al.
(2010)
Bacillus mycoides
RLJ B-017
Sacarosa
69
Borah
et al.
(2002)
Bacillus sphaericus
NCIM 5149
Hidrolizado de semillas
4.5
2.2
Ramadas
et al.
(2009)
Bacillus spp.
Decanoato
24
0.4
80
Valappil
et al.
(2007)
Burkhholderia cepacia
Hidrolizado hemicelulosas
2
40
Keenan
et al.
(2006)
Burkholderia sacchari
Sacarosa
150
42
da Cruz Pradella
et al.
(2010)
Caulobacter crescentus
Glucosa
18
Qingsheng y Bernd (2001)
Chromobacterium violaceum
Ácido valérico
41
26.6
65
Steinbüchel
et al
. (1993)
Comamonas
sp. EB172
Efuente aceite de palma
44
Zakaria
et al.
(2008)
Cupriavidus necator
Glucosa
77
Atlic
et al.
(2011)
Cupriavidus necator
Residuos líquidos de alimentos
87
Hafuka
et al.
(2011)
Cupriavidus necator
Aceite vegetal y propanol
138
105
Obruca
et al.
(2010)
Cupriavidus necator
Ácidos grasos volátiles
Wang
et al.
(2010)
Cupriavidus necator
h16
Aceite de plantas
4.4
6.8
80
Ng
et al.
(2010)
Cupriavidus nécator
jmp 134
Glicerol crudo
50
48
Mothes
et al.
(2007)
Cupriavidus
sp. USMAA 1020
Gama butirolactona
48
4
52.4
Amirul
et al.
(2008)
Enterobacter cloacae
SU-1
Lactosa
94
Samrot
et al
. (2011)
Methylobacterium organophihum
Metanol
70
250
130
52
Kim
et al.
(1996)
Methylobacterium rhodesianum
Glicerol
45
50
Bormann
et al.
(1999)
Pseudomonas aeruginosa.
Agua residual de
Cassava
39
Costa
et al.
(2009)
Pseudomonas guezennei
Aceite de copra
36
63
Simon-Colin
et al.
(2008)
Pseudomonas hydrogenovora
Suero de leche
12
Koller
et al.
(2008)
Pseudomonas oleovorans
Octano
37.2
Brandl
et al.
1988
Pseudomonas olevorans
M26
Glucosa
46
3.27
31.4
Huang D.H
et al.
(2006)
Continúa
SÍNTESIS Y BIODEGRADACIÓN DE PHA
91
Para el cultivo de bacterias con producción de PHA
asociada al crecimiento, se pueden alcanzar produc-
tividades altas en un sistema de lote alimentado en
una sola etapa. La estrategia de alimentación es muy
importante para obtener una densidad celular alta y no
tiene que ver con la limitación de nutrientes, por lo que
se pueden usar fuentes de nitrógeno complejas para
mejorar el crecimiento (Khanna y Srivastava 2005).
En cuanto al desarrollo de estrategias para la
producción de PHA, existe una mayor cantidad de
estudios sobre el proceso utilizando microorganismos
que polimerizan monómeros de cadena corta (scl-
PHA). Se ha llegado a la conclusión de que algunos
metilotrofos y metanotrofos son interesantes para
la producción de P3HB. El metanol es un sustrato
barato y existe mucha información sobre el cultivo
de estas bacterias ya que muchas han sido considera-
das para la producción industrial de proteína celular
a gran escala. Dentro de este grupo se incluyen a
Protomonas extorquens
,
Paracoccus denitrifcans
y
CUADRO VI.
CONTINUACIÓN
Microorganismo
Sustrato
Tiempo
(h)
Biomasa
(g/L)
PHA
Referencia
(g/L)
(% )
Pseudomonas pseudoFava
Pentosas
17
Bertrand
et al.
(1990)
Pseudomonas putida
Aceite de maíz
103
28
27.2
Shang
et al
. (2008)
Pseudomonas putida
KTOY06
Dodecanoato, gluconato
48
5.3
84.3
Ouyang
et al.
(2007)
Pseudomonas
SK
Metanol
233
149.1
64
Suzuki
et al.
(1986)
Ralstonia eutrhopha
Aceite de soya
32
86
Park y Kim (2011)
Ralstonia eutropha
Glucosa
50
164
124.6
76
Kim
et al.
(1994a)
Ralstonia eutropha
Glucosa/propiónico
46
158
116.9
74
Kim
et al.
(1994b)
Ralstonia eutropha
Tapioca hidrolizada
59
106
61.4
58
Kim y Chang (1995)
Ralstonia eutropha
Glucosa
74
281
230.4
82
Ryu
et al.
(1997)
Ralstonia eutropha
Bagazo caña hidrolizado
11
56.5
Yu
et al.
(2008)
Ralstonia eutropha
Gluconato, octanoato
48
5.1
40.9
Chen
et al.
(2007)
Ralstonia eutropha
Fructosa
72
3.7
68.4
Zheng
et al.
(2006)
Rhodobacter sphaeroides
Acético
95
Sangkharak
et al.
(2007)
Serratia
sp
.
Citrato y glicerol
55
Lugg
et al.
(2008)
Wautersia eutropha
Gluconato de sodio
Isemori
et al.
(2006)
Wautersia eutropha
Aceite de canola
18.2
90
López-Cuéllar
et al.
(2011)
Wautersia eutropha
Fructosa
60
14
6
Patwardhan y Srivastava
(2008)
Zobellella denitrifcans
MW1
Glicerol
70
Ibrahim y Steinbüchel (2009)
Zooglea
sp.1 GY3
Sacarosa
32
9.4
Yang y Huang (2006)
Bacterias halóflas
Halomonas boliviensis
Almidón hidrolizado
50
Quillaguaman
et al.
(2005)
Halomonas boliviensis
LC1
Sacarosa
19
14
54
Quillaguaman
et al
. (2007)
Halomonas campisalis
B-1027
Maltosa
30
45
Kulkarni
et al.
(2010)
Halomonas
TD01
Glucosa
56
80
80
Tan
et al.
(2011)
Saccharophagus degradans
Almidón
48
25
González-García
et al.
(2010)
Cultivos mixtos
Lodos activados aerobios
Aguas residuales
48.2
Bengtsson y Werker (2008)
Lodos anaerobios
Efuentes industriales
96
58
Khardenavis
et al
. (2009)
Arqueas
Haloferax mediterranei
Glucosa
3
31
García Lillo
et al.
(1990)
Haloferax mediterranei
Almidón hidrolizado
140
77.8
56
Huang
et al.
(2006)
Y. González García
et al.
92
Methylobacterium extorquens
(Suzuki
et al.
1986)
.
Esta última sintetiza un copoliéster de P(3HBco3HV)
cuando se proporciona simultáneamente alcohol
amílico y metanol en un medio limitado por fuente
de nitrógeno (Ueda
et al.
1992, Yamane
et al.
1996).
Paracoccus sp
.12-A es también capaz de acumu
-
lar P(3HBco3HV) cuando crece a partir de ácido
fórmico (Mineki et al. 1997) y
Methylobacterium
organophilum
usando metanol como sustrato (Kim
et al.
1996). De forma interesante la capacidad de los
metanotrofos de crecer a partir de hidrocarburos clo-
rados puede ser también explotada para la producción
de P3HB. Por ejemplo
Methylosinus trichosporium
OB3b es capaz de degradar tricloroetileno que es un
contaminante común del agua subterránea para pro-
ducir P3HB (Shah
et al.
1996).
Azotobacter vinelandii
UWD es otra cepa que vale la pena mencionar (Page y
Knosp. 1989)siendo capaz de producir P3HB a partir
de fuentes de carbono baratas. Sintetiza P3HB durante
el crecimiento exponencial usando jarabe de maíz,
melazas de caña, melaza de remolacha y extracto de
malta con rendimientos altos (Page 1989). Incluso,
se pueden obtener polímeros con pesos moleculares
extraordinariamente altos (por arriba de 4 millones de
Daltones), cuando esta cepa crece en un medio de me-
lazas. De forma notable, la adición de valerato como
cosustrato permite la producción de un copolímero
(Page
et al.
1992).
La producción de P3HB también es una ca
-
racterística común entre las bacterias fototrópicas
anoxigénicas. Algunas de las bacterias de este
grupo que han sido estudiadas para la producción
de P3HB son de los géneros
Chromatium, Thio-
cystis, Thiocapsa, Rhodococcus, Rhodobacter
y
Rhodospirillum,
que pertenecen a las bacterias
púrpura (las tres primeras) y no púrpuras (las tres
últimas). Creciendo sobre acetato, la mayoría de
estas bacterias produce solamente un homopolí-
mero de P3HB.
Chromobacterium violaceum
es
una bacteria heterótrofa que es capaz de producir
homopoliésteres de hidroxivalerato, cuando se
cultiva en ácido valérico como fuente de carbono
(Steinbüchel
et al.
1993).
R. eutropha
es de hecho una bacteria autótrofa
oxidadora de hidrógeno que puede producir P3HB a
partir de CO
2
y H
2
. El factor crítico en este proceso
autótrofo es evitar posibles explosiones de gas. Por
lo tanto ha sido desarrollado un circuito cerrado para
reciclar gas dentro de los márgenes de seguridad
(Tanaka
et al.
1995). Por otro lado, las cianobacterias
como
Synechococcus sp.
MA19 también son capa-
ces de producir P3HB usando CO
2
como fuente de
carbono (Miyake
et al.
1996).
También se ha descrito un nuevo proceso para
lo foto conversión de desperdicios orgánicos en
biopoliésteres. En este proceso la biomasa seca se
gasiFca térmicamente y resulta una mezcla de gases
compuesta de CO
2
y H
2
. Las bacterias fotosintéticas
asimilan los componentes del gas en nueva masa
celular (Maness y Weaver 1994).
Con el objeto de producir P3HB a partir de sustra
-
tos baratos, también han sido estudiados métodos de
cultivo por lote alimentado en dos etapas, usando dos
diferentes microorganismos, el primero transforma la
fuente de cultivo barata en sustratos asimilables para
que el segundo microorganismo los use para producir
PHA (Tanaka
et al.
1993).
Por otro lado, como se mencionó anteriormente,
los PHA son casi siempre 3-hidroxi ésteres; sin
embargo, también hay ciertas variaciones. La más
común es la ocurrencia de 4-hidroxi ésteres. Entre
muchas diferentes cepas,
R. eutropha
,
A. latus
y
C.
acidovorans
son capaces de sintetizar copolímeros de
3-hidroxibutirato y 4-hidroxibutirato cuando crecen
en medios con ácido 4-hidroxibutírico, 1,4-butano
-
diol, butirolactona o ácido 4-clorobutírico (Renner
et
al.
1996). También
R. eutropha
produce un copolí-
mero de 3HB y 4HB a partir de mezclas de fructosa
y butirolactona (Doi
et al.
1990). Se pueden producir
homopolímeros de 4HB si se usa 1,4 butanodiol o
ácido 4-butírico como única fuente de carbono (Saito
y Doi 1994).
Más aún, las condiciones de cultivo también
pueden in±uenciar la composición del polímero.
Se ha demostrado que la adición de 2 % de polieti
-
lenglicol da como resultado una mayor incorpora-
ción de 4-hidroxibutirato (Shi
et al.
1996). Se han
encontrado polímeros que contienen monómeros de
4-hidroxivalerato en bacterias del género
Ralstonia
y de la cepa de
Pseudomonas oxalaticus
(Valentin
et al.
1992). También han sido descritos poliésteres
conteniendo 2-hidroxi, 5-hidroxi, o 6-hidroxi monó
-
meros (Williams 1999).
R. eutropha
produce un terpolímero de 3-hidro
-
xibutirato, 3- hidroxivalerato y 5-hidroxivalerato al
alimentarla con 5-clorovalerato o 5-hidroxivalerato
y ácido valérico (Doi
et al.
1987).
Análisis con RMN de PHA aislados de
Pseu-
domonas aeruginosa
44T1 cultivadas en aceite de
euforbia y castor, sugieren la presencia de 3,6-di
-
hidroxidodecanoato, 6-hidroxi-3-dodecenoato y
4-hidroxidecanoato (Eggink
et al.
1995). Mediante el
uso de bacterias recombinantes también se han pro-
ducido PHA con monómeros de 5-hidroxihexanoato,
4-hidroxiheptanoato y 4-hidroxioctanoato (Valentin
et al.
1996).
SÍNTESIS Y BIODEGRADACIÓN DE PHA
93
Otra variante de la estructura de los PHA es
la presencia de grupos metilo en el carbono 2.
R.
eutropha
y
Burkholderia cepacia
, por ejemplo,
acumulan un terpoliéster de 3-hidroxibutirato,
3-hidroxivalerato y 2-metil-3-hidroxibutirato (Fü
-
chtenbusch
et al.
1996). Al crecer en medio mineral
con glucosa y 3-hidroxipivalato se produce un ácido
alcanoico con dos grupos metilos sustituyentes en
el átomo de carbono alfa por
Rhodococcus ruber
y
bacterias relacionadas.
Por otro lado, en lodos anaerobios es común
encontrar PHA conteniendo monómeros de 2-metil-
3-hidroxivalerato. El proceso de usar aguas residuales
(cultivos mixtos) para la producción de PHA, también
ha sido investigado profundamente ya que el uso de
sustratos de bajo costo es parte esencial de la inves-
tigación sobre la producción de PHA.
En términos generales, la rentabilidad de una bac-
teria para producir PHA a escala industrial depende de
varios factores como son: la estabilidad e inocuidad del
organismo, la velocidad de acumulación del polímero,
la velocidad de crecimiento, la densidad celular que se
puede alcanzar, el contenido de polímero, la facilidad
de extracción, el peso molecular del PHA, el rango de
fuentes de carbono utilizables, el costo del medio de
cultivo y la generación de subproductos.
La empresa ICI (Inglaterra) fue la primera en inte
-
resarse por la producción a gran escala de P3HB, para
lo cual evaluó a tres microorganismos:
Azotobacter
sp.
, Methylobacterium
sp
.
y
Ralstonia eutropha.
El
microorganismo que decidieron usar para el proceso
a nivel industrial fue una cepa de
R. eutropha
con la
cual han producido P3HB y un copoliéster de 3HB y
3HV (Byrom 1993). El equipo que esta empresa ha
usado para la producción de estos biopolímeros es un
fermentador
air-lift
de 35 000 litros y varios tanques
de agitación de 200 000 L (Schlegel y Gottschalk
1965). La fermentación se lleva a cabo en un sistema
por lote alimentado en dos etapas, en el que se utiliza
la limitación por fosfato como factor para estimular la
síntesis de P3HB. Durante la primera etapa las células
crecen en un medio mineral con glucosa como fuente
de carbono y energía y con la cantidad de fosfato
necesaria para producir cierta cantidad de biomasa.
A medida que crece la bacteria, el fosfato se consu-
me del medio y durante la segunda etapa, cuando el
fosfato está en concentraciones limitantes, las células
comienzan a acumular el polímero. Se proporciona
glucosa al cultivo y la fermentación continua hasta
que el contenido de polímero deseado se alcanza.
Cada fase dura aproximadamente 48 h y se alcanza
una concentración de biomasa en base seca de 100 g/L
(Byrom 1992).
Se ha observado que durante las primeras 60 h,
la acumulación de P3HB es poca, pero después de
que inicia la alimentación con glucosa se logra que
el polímero se acumule hasta en un 75 % del peso de
la biomasa en base seca.
El copolímero de 3HB y 3HV se produce agre
-
gando una mezcla de glucosa y ácido propiónico en
la fase de acumulación. El contenido de hidroxivale-
rato en el copolímero se regula ajustando la relación
de los dos sustratos, cuidando que el propionato se
mantenga en una concentración menor a 1 g/L para
evitar efectos tóxicos (Byrom 1992).
La recuperación del polímero se hace mediante
un proceso de re±ujo con metanol caliente para re
-
mover lípidos y fosfolípidos de las células, seguido
de extracción del P3HB con cloroformo o cloruro
de metileno. La solución se ²ltra para remover res
-
tos celulares, se enfría y se precipita para luego ser
secada a vacío.
Para reducir costos, ICI también ha usado una
estrategia en la que las células se desintegran por
shock térmico, luego son tratadas con detergentes y
enzimas para disolver los componentes celulares que
no sean P3HB, posteriormente el polímero se lava
y ±ocula y ²nalmente se recupera como un polvo
blanco del cual se hacen hojuelas.
Generalmente se requiere alrededor de 2.1 g de
glucosa para producir 1 g de P3HB, pero como tam
-
bién se se necesita de una fuente de carbono y energía
para el crecimiento, en la práctica se ha observado
que se precisan 3 g de glucosa para producir 1g de
P3HB
.
En 1996, este proceso de producción de biopo-
límeros fue adquirido por Monsanto, quienes detu-
vieron la producción de P3HB y P(3HBco3HV) a
²nales de 1998.
Un proceso industrial diferente se desarrolló en la
empresa Biotechnologische Forschungsgesellschaft
en Linz (Austria) para la producción de P3HB (Hän
-
ggi 1990, Hrabak 1992). Este proceso se basó en el
uso de
Alcaligenes latus
DSM1124, el cual puede
acumular P3HB hasta en un 80 % de su peso en base
seca durante crecimiento balanceado. Gracias a esto, la
fermentación se da en un solo paso usando un cultivo
por lote alimentado en un medio de sales minerales con
sacarosa como fuente de carbono. Aunque se alcanzó
una biomasa celular de 60g/L, la compañía detuvo la
producción en 1993 (Hrabak 1992).
En el caso de la empresa brasileña Biocycle, den
-
tro de la planta productora de azúcar y etanol, está
instalada una planta productora de P3HB a partir de
los residuos de la extracción del azúcar de caña. Esto
permite tener un ciclo cerrado en el que los desper-
Y. González García
et al.
94
dicios de un proceso se utilizan como insumos para
el otro, como el caso del agua residual de la fermen-
tación para producir P3HB que se utiliza para regar
los sembradíos de caña, y el uso del bagazo de caña
residual para generar energía para el funcionamiento
del complejo de producción (Nonato
et al
. 2001).
En general, el acoplar el proceso de producción de
P3HB en una fábrica de azúcar y etanol, hace posible
que se reduzca el precio por kilogramo de P3HB de
4 a 5 veces en comparación con otros procesos para
producir el mismo polímero (Nonato
et al.
2001).
Por su parte los PHA de cadena media no han sido
producidos en escala comercial. Consecuentemente,
los procesos para producción y recuperación de PHA
de cadena corta han recibido mucha más atención
(Wang y Lee 1997). Cuando se comparan cultivos
por lote alimentado, la única diferencia entre PHA
de cadena corta y PHA de cadena media, es el bajo
contenido celular de polímero que se encuentra en
estos últimos, lo cual afecta el proceso y lo hace
menos rentable en comparación al P3HB, ya que el
costo de recuperación de los de cadena media es más
elevado (Choi y Lee 1999).
Biodegradación de PHA
La composición monomérica de los PHA como
ya fue mencionado es altamente variable, lo que
determina las características físicas y químicas de
los mismos y por consecuencia su susceptibilidad a
ser biodegradados. El gran tamaño de los polímeros
individuales les impide ser transportados a través
de la membrana celular, por lo tanto el microorga-
nismo debe de tener la capacidad de hidrolizarlos
en sus correspondientes monómeros (hidroxiácidos)
(Williams y Peoples 1996). Los PHA pueden ser
biodegradados por una amplia variedad de microor-
ganismos ubicuos en muchos ecosistemas hasta
dióxido de carbono o metano, tanto en condiciones
aerobias como anaerobias, sin la formación de
productos tóxicos.
Chowdhury reportó por primera vez la degrada-
ción de P3HB por microorganismos de los géneros de
Bacillus, Pseudomona
s y
Streptomyces
(Chowdhury
1963). Estos microorganismos han sido aislados del
suelo (
Pseudomonas lemoigne
,
Comamonas
sp
.
,
Aci-
dovorax faecalis
,
Aspergillus fumigatus
y
Variovorax
paradoxus
), lodos activados y anaerobios (
Alcalige-
nes faecalis, Pseudomonas
sp.
, Illyobacter delafel
-
di
), agua dulce (lagos) y salada (mar) (
Comamonas
testosterone, Pseudomonas stutzeri
) (Lee 1996). El
porcentaje de microorganismos degradadores de
P3HB en el ambiente fue estimada entre 0.5-9.6 %
del total de colonias (Suyama
et al
. 1998).
Se han realizado estudios ecológicos y taxonó-
micos sobre la abundancia y diversidad de microor-
ganismos degradadores de P3HB y P(3HBco3HV)
en suelo, agua y compostas, tanto
in situ
como bajo
condiciones de laboratorio. Las principales variables
consideradas fueron el tiempo, el tipo de ambiente,
la temperatura de incubación y el % de hidroxivale
-
rato (3HV) (Mergaert
et al.
1992). Un total de 330
microorganismos degradadores fueron aislados e
identiFcados: 154 bacterias, 77 estreptomicetos y
99 hongos. Las bacterias degradadoras de PHA están
divididas en once grupos con base en la especiFcidad
de las despolimerasas por su sustrato (Jendrossek
et al.
1996) y los hongos en al menos 95 géneros
conocidos como degradadores de PHA. La mayoría
de las bacterias caracterizadas presentan una espe-
ciFcidad dependiente de la longitud de la cadena del
polímero (corta o media), aunque algunas maniFestan
la capacidad de utilizar una variedad importante de
polímeros (Jendrossek
et al
. 1996) (
Cuadro VII
).
Se han identiFcado muchos hongos degradadores
de P3HB (
Penicillium, Aspergillus
y
Paecilomyces
)
(Mergaert
et al.
1993, Oda
et al.
1997, Han
et al.
1998, Gonda
et al.
2000, Miyazaki
et al.
2000). La
capacidad de los hongos para degradar P3HB ha
sido evaluada en función de su aFliación sistemá
-
tica, encontrando que miembros de basidiomicetos,
deuteriomicetos, ascomicetos, zigomicetos, chitri-
diomicetos y mixomicetos son capaces de degradar
P3HB (Matavulj y Molitoris 1992). Sin embargo, no
se conoce cuál de los dos grupos de microorganismos
contribuye más en la degradación de P3HB en el
ambiente. El aislamiento de estos microorganismos
ha permitido realizar estudios de biodegradación
in
vitro
de diferentes tipos de PHA (
Cuadro VII
). La
degradación de P3HB ha sido reportada principal
-
mente a temperaturas mesofílicas, aunque Tokiwa
et al.
enfatizan que el compostaje a altas tempera-
turas es una de las tecnologías más prometedoras
para el reciclado de plásticos biodegradables (Abe
y Doi 1999). La velocidad de degradación de PHA,
aún bajo condiciones ambientales controladas es
difícil de predecir. Normalmente altas temperaturas
permiten una mejor degradación, probablemente
debido al incremento en la actividad microbiana.
Es importante notar que a temperaturas elevadas se
mejora de manera importante la biodisponibilidad
y solubilidad de compuestos poliméricos orgánicos
y de contaminantes ambientales biodegradables,
permitiendo su eFciente biorremediación (Müller
et
al.
1998). A altas temperaturas, el P3HB es amorfo
y más sensible al ataque enzimático permitiendo su
rápida degradación (Takeda
et al.
1998). Mientras
SÍNTESIS Y BIODEGRADACIÓN DE PHA
95
CUADRO VII.
BIODEGRADACIÓN DE PHA POR DIFERENTES TIPOS DE MICROORGANISMOS
Microorganismo
PHA hidrolizado
Referencia
P3HB P(3HB -co- 3HV)P(3HB -co- 4HV) P(3HP) P(3HB -co- 3HP) P(3HRx)
Bacterias
A. beijerinckii
X
Reddy
et al.
(2003)
Acidovorax
sp
.
TP4
X
Cao
et al.
(1999)
Agrobacterium
sp
.
X
Nojima
et al.
(1996)
Alcaligenes faecalis
X
X
Kita
et al.
(1997)
Arthrobacter
sp
X
Asano y Watanabe (2001)
Bacillus
sp
.
X
X
Volova
et al.
(2010)
Bacillus megaterium
N-18-25-9
X
Takaku
et al.
(2006)
Comamonas acidovorans
X
Kasuya
et al.
(1999)
Comamonas
sp
.
X
Jendrossek
et al.
(1993)
Comamomas testosteroni
X
Kasuya
et al.
(1999)
Enterobacter
sp
.
X
X
Volova
et al.
(2010)
Gracilibacillus
sp
.
X
X
Volova
et al.
(2010)
Ilyobacter delafeldii
Jansen y Harfoot (1990)
Pseudomonas alcaligenes
LB 19
X
X
Kim
et al.
(2002)
Pseudomonas stutzeri
X
X
Uefuji
et al.
(1997),
Kasuya
et al.
(1999)
Pseudomonas Fuorescens
GK13
X
Schirmer
et al.
(1993)
Pseudomonas
sp
.
RY-1
X
Kim
et al.
(2000a,b)
Pseudomonas indica
K2
X
Elbanna
et al.
(2004)
Pseudomonas luteola
M13-4
X
Rhee
et al.
(2006)
Ralstonia pickettii
X
Kasuya
et al.
(1999)
Rhodospirillum rubrum
X
Reddy
et al.
(2003)
Rhizobium
(Sinorhizobium) meliloti
Aneja y Charles, (1999)
Streptomyces exfoliates
K10
X
Klingbeil
et al.
(1996)
Streptomyces
sp
.
KJ-72
X
Kim
et al.
(2003)
Schlegellella
sp
.
KB1a
X
Romen
et al.
(2004)
Variovorax paradoxus
X
X
Mergaert
et al.
(1993)
Xanthomonas
sp.
JS02
X
Kim
et al.
(2000a, b)
Z. ramigera
I-16-M
X
Saito
et al.
(1992)
Hongos
Acremonium
sp.
X
X
Mergaert
et al.
(1993)
A. fumigatus
X
X
Mergaert
et al.
(1993, 1994)
A. fumigatus
M2A
X
X
X
Scherer
et al.
(1999)
A. penicilloides
X
Mergaert
et al.
(1992)
A. ustus
T-221; M-224
X
Gonda
et al.
(2000)
Cephalosporium
sp
.
X
Matavulj y Molitoris (1992)
Cladosporium
sp.
X
Matavulj y Molitoris (1992)
Emericellopsis minima
W2
X
X
Kim
et al.
(2002b)
Continúa
Y. González García
et al.
96
CUADRO VII.
CONTINUACIÓN
Microorganismo
PHA hidrolizado
Referencia
P3HB P(3HB -co- 3HV)P(3HB -co- 4HV) P(3HP) P(3HB -co- 3HP) P(3HRx)
Eupenicillium
sp
.
IMI 300465
X
McLellan y Halling (1988)
F. oxysporium
F1-3
X
Sang
et al.
(2002)
F. solani
LAR 11
X
Kim
et al.
(2000c)
Mucor
sp.
X
Matavulj y Molitoris (1992)
Paecilomyces farinosus
F4-7
X
Sang
et al.
(2002)
P. farinosus
LAR 10
X
Kim
et al.
(2000c)
P. lilacinus
D218
X
Oda
et al.
(1995)
P. lilacinus
F4-5
X
Sang
et al.
(2002)
P. marquandii
X
Mergaert
et al.
(1992)
Penicillium adametzii
X
Mergaert
et al.
(1992)
P. chermisinum
X
Mergaert
et al.
(1995)
P. crysosporium
X
X
Renstad
et al.
(1999)
P. funiculosum
IFO 6345
X
X
X
Miyazaki
et al.
(2000)
P. simplicissimum
X
X
Mergaert
et al.
(1995);
Renstad
et al.
(1999)
Penicillium
sp
.
cepa
26-1
X
Tokiwa
et al.
(1976)
Polyporus circinatus
X
Matavulj y Molitoris (1992)
Rhodosporidium sphaerocarpum
X
Gonda
et al.
(2000)
Thermoascus aurantiacus
IFO 31910
X
Sanchez
et al.
(2000)
Verticillium leptobactrum
X
Mergaert
et al.
(1994)
Levaduras
Candida
guilliermondii
X
Gonda
et al.
(2000)
Debaryomyces hansenii
X
Gonda
et al.
(2000)
Microorganismos termóflos
(50 ºC)
Anoxybacillus gonensis
G2
X
Çolak
et al.
(2005)
Bacillus
TT96
X
Tansengco y Tokiwa
(1998b)
Caldimonas manganoxidans
X
Takeda
et al.
(2002)
Comamonas testosteroni
ATSU
X
Kasuya
et al.
(1994)
Leptothrix
sp
.
X
Takeda
et al.
(1998)
Streptomyces
cepa
MG
X
Calabia y Tokiwa (2004)
S. thermovulgaris
(4338)
; S.
thermoolivaceous
(4921)
;
S.
thermohygroscopicus
(4917
); S.
thermocarboxydovorans
(10367)
X
Buenaventurada y
Tokiwa (2004)
Aspergillus
sp
.
ST-01
X
Sanchez
et al.
(2000)
Thermoascus
aurantiacus
X
Sanchez
et al.
(2000)
Thermus thermophilus
HB8
X
Papaneophytou
et al.
(2009)
P3HB: P(3HB): Poli(3-hidroxibutirato); P(3HB-co-3HV): Poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato); P(3HB-co-4HV): Poli(3-hidro
-
xibutirato-co-4-hidroxivalerato); P(3HP): Poli(3-hidroxipropionato); P(3HB-co-3HP): Poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxipropionato);
P(3HRx): poli(3-hidroxi: heptanoato, octanoato, nonanoato, decanoato ó de Cadena media C6-C11: heptanoato, octanoato, nonanoato,
decanoato, undecanoato)
SÍNTESIS Y BIODEGRADACIÓN DE PHA
97
existen numerosos reportes sobre bacterias degrada-
doras de polímeros en condiciones mesofílicas, sólo
recientemente se han publicado trabajos de bacterias
termofílicas y de enzimas termoestables para dicho
propósito (Elbanna
et al.
2004). Los microorganis
-
mos termofílicos capaces de degradar varias clases
de poliésteres a altas temperaturas son de interés y
entre éstos los actinomicetos han demostrado ser
los más importantes. Estos han sido aislados de di-
ferentes ecosistemas, encontrando que de 341 cepas,
31 aisladas fueron capaces de degradar P3HB, PCL
(policaprolactona) y polietilen succinato (PES). Estas
fueron identiFcadas como miembros de los géneros:
Actinomadura, Microbispora, Streptomyces, Ther-
moactinomyces
y
Saccharomonospora
(Yamashita
et al
. 2001). Una cepa termofílica de
Streptomyces
sp
.
aislada de suelo ha sido capaz de degradar
P3HB y también polietilen succinato (PES), poli
-
butilen succinato (PBS) y poli (oligo(tetrametilen
succinato)-co-tetrametilen carbonato)) (PBS/C).
Este actinomiceto ha presentado una actividad
degradadora de P3HB superior a la de cepas termo
-
tolerantes y termofílicas procedentes de colecciones
de cultivo (Kasuya
et al
. 1999). Recientemente, en
las bacterias termóFlas
Anoxybacillus gonensis
G2
(Çolak
et al.
2005) y
Thermus thermophilus
HB8
(Papaneophytou
et al.
2009) se ha reportado una
despolimerasa extracelular degradadora de P3HB.
La degradación de P3HB ha sido también reporta
-
da en una cepa termotolerante de
Aspergillus
sp.
alcanzándose una degradación del 90 % de una
película de P3HB después de 5 días de cultivo a 50
ºC (Handrick
et al.
2001). El aislamiento de estos
microorganismos ha permitido realizar estudios de
biodegradación
in vitro
de diferentes tipos de PHA.
En contraste, comparativamente han sido aislados
pocos microorganismos degradadores de PHA de
cadena media (mcl-PHA). Alrededor de 26 mi
-
croorganismos degradadores de mcl-PHA han sido
aislados de suelo incluyendo numerosos del género
Pseudomonas
, una cepa de
Comamonas
y de
Alca-
ligenes
(Schirmer
et al.
1993, ±oster
et al.
1995).
Seis géneros relativamente no muy comunes de
microorganismos degradadores de PHA de cadena
media fueron aislados de suelos contaminados con
hidrocarburos composteados (Ramsay
et al.
1994).
La velocidad de biodegradación del polímero
depende de varios factores, incluyendo el área su-
perFcial del polímero, actividad microbiana, pH,
temperatura, humedad y la presencia de otros nu-
trientes (Lee 1996). Los parámetros del polímero
que afectan tal velocidad incluyen la composición
monomérica del polímero, el nivel de cristalinidad
o de regiones amorfas (a mayor cristalinidad menor
biodegradación) (Nishida y Tokiwa 1995, Spyros y
Kimmich 1997) y el peso molecular (polímeros de
bajo PM se degradan más rápidamente que los de alto
PM) (Jendrossek
et al
. 1996). Los microorganismos
colonizan la superFcie de los polímeros, secretando
despolimerasas, las que hidrolizan los enlaces éster de
los PHA generando oligómeros, dímeros que subse-
cuentemente son llevados a sus formas monoméricas
(p.e. P3HB a hidroxibutirato, P3HV a hidroxivale
-
rato, etc.) por hidrolasas de oligómeros (Shirakura
et al.
1983). Estos monómeros son suFcientemente
pequeños para pasar a través de la membrana mi-
crobiana semipermeable para ser metabolizados por
β-oxidación y el ciclo de los ácidos tricarboxílicos en
dióxido de carbono y agua en condiciones aeróbicas
(Scott 1990), mientras que en condiciones anaerobias
también es producido metano (Luzier 1992).
La biodegradación de PHA puede ser claramente
distinguida entre la realizada al interior y al exterior
de la célula a partir del hecho que dicho polímero
puede estar presente en dos conformaciones biofísi-
cas. En la biodegradación intracelular los gránulos
amorfos de PHA se acumulan
in vivo
y presentan
una capa superFcial intacta compuesta de proteínas y
fosfolípidos, y en la extracelular la pérdida de dicha
capa (después de la lisis celular o de la extracción del
polímero) provoca la coalescencia de los gránulos y la
formación de cristales de la estructura amorfa previa
del polímero (Merrik
et al.
1965, Jendrossek 2001).
La mayoría de las enzimas que hidrolizan P3HB son
especíFcas para las formas nativa y desnaturalizada
de P3HB (Handrick
et al
. 2004). La degradación en
-
zimática de PHA está in²uenciada por la composición
monomérica, estructura estereoquímica, distribución
de la secuencia, área superFcial y morfología (Sche
-
rer
et al
. 2010).
La capacidad de utilizar extracelularmente PHA
como fuente de carbono y energía está ampliamente
distribuida entre bacterias (Gram + y –), hongos
y actinomicetos, sin estar limitada únicamente a
organismos productores de PHA. La degradación
extracelular se presenta en microorganismos no
necesariamente acumuladores de PHA, que les
permite utilizar como fuente de carbono exógena
estos polímeros extracelulares liberados por células
muertas
acumuladoras de PHA. Las enzimas clave
que participan en ambos procesos de degradación
son denominadas de manera genérica como despo-
limerasas (intra y extracelulares) especíFcas de PHA
(despPHA), las cuales son carboxiesterasas (EC 3.1.1)
que hidrolizan los polímeros insolubles en agua en
monómeros y oligómeros solubles. La mayoría de las
Y. González García
et al.
98
bacterias producen despPHA que son específcas para
polímeros de cadena corta o media, aunque existen
algunas excepciones (Schirmer
et al.
1995).
La degradación microbiana y enzimática de PHA
puede ser abordada desde dos puntos de vista: uno
basado en las características microbianas (enzimáti-
ca) y otro sobre las correspondientes de los bioplás-
ticos. Los PHA pueden ser utilizados como fuente de
carbono por una amplia variedad de bacterias y de
eucariontes. Estos microorganismos emplean varias
despolimerasas específcas de estos polímeros (Ue
-
fuji
et al.
1997, Schöber
et al.
2000), las cuales son
carboxiesterasas (EC 3.1.1.75 y EC 3.1.1.76) (Jendros
-
sek y Handrick 2002). La degradación enzimática de
polímeros por hidrólisis es un proceso de dos pasos en
la interface sólido-líquido: primero, la enzima enlaza
al polímero-sustrato y susecuentemente cataliza el
rompimiento hidrolítico.
Las propiedades de las despolimerasas de P3HB
(despPHB) han sido ampliamente estudiadas, te
-
niendo en común varias características bioquímicas
tales como: peso molecular relativamente pequeño
(<100 kDa); están conFormadas por una sola cade
-
na polipeptídica; no se enlazan a intercambiadores
aniónicos como la dietilaminoetil-celulosa, aunque
tienen una Fuerte afnidad a materiales hidroFóbicos
tales como el butilo o Fenilo Toyopearl; el pH óptimo
está entre 7.5-9.8, a excepción de la polimerasa de
Pseudomonas picketti
y de
Penicillium funiculosum
que se encuentra entre 5.5 y 7; alta estabilidad en un
amplio rango de pH, temperatura y fuerza iónica. La
mayoría de las despolimerasas bacterianas no son
glicosiladas aunque las de eucariontes y de
Pseudo-
mona lemoignei
sí lo son. Esta característica no es
esencial para la actividad, pero podría ayudar en la
estabilidad de la enzima. Todas las despolimerasas
son específcas para la confguración (R) aunque los
polímeros (R-S)-3HB son degradados en oligómeros
más largos puesto que al parecer no son capaces de
hidrolizar los enlaces éster entre monómeros de la
confguración (S). La mayoría de estas enzimas pa
-
recen ser serina hidrolasas, las que son específcas
para PHA de cadena corta o media; son inhibidas por
inhibidores de serina esterasas (diisopropil-±uoril
fosfato o compuestos acil sulfonilo), los que se enla-
zan covalentemente con la serina del sitio activo de
las serina hidrolasas (Jendrossek
et al
. 1996, 1998).
La hidrólisis enzimática de PHA se lleva a cabo
primero en la región amorfa y subsecuentemente en
la cristalina. Para películas de poli-3-hidroxibutirato
con grados similares de cristalinidad, la velocidad
de hidrólisis enzimática depende del tamaño y de la
estructura de las esferulitas (cristalinas).
Varias despolimerasas de PHA han sido aisladas
y purifcadas de microorganismos pertenecientes a
los géneros
Alcaligenes
(Shirakura
et al.
1986,
Ba
-
chmann y Seebach 1999),
Comomonas
(Jendrossek
et al.
1993,
Kasuya
et al.
1994) y
Pseudomonas
(Mukai
et al.
1993, Mukai
et al.
1994, Schöber
et
al.
2000). En la última década más de 20 diFerentes
despolimerasas extracelulares de P3HB han sido
caracterizadas (Jendrossek y Handrick 2002). Estas
han sido analizadas a nivel de sus genes estructu-
rales, encontrando que mientras la mayoría de las
bacterias degradadoras de PHA contiene únicamente
una despolimerasa, aunque
Paucimonas lemoignei
presenta siete despolimerasas con diferente especi-
fcidad hacia los diFerentes sustratos (Jendrossek y
Handrick 2002). Las despolimerasas son secretadas
al ambiente y catalizan la degradación endo y exo de
las cadenas de PHA. El ataque exo ocurre estricta-
mente en la parte terminal o extremo del polímero,
frecuentemente con una preferencia por uno de éstos
(p.e. el hidroxilo fnal del hidroxiácido del poliéster
es atacado más que el ácido carboxílico fnal del otro
extremo), produciendo exclusivamente pequeños oli-
gómeros o monómeros metabolizables. En el caso del
ataque endo, éste ocurre en cualquier lugar a lo largo
de la cadena del polímero, generando una mezcla de
oligómeros y una reducción rápida del peso molecu-
lar (Lenz 1993). Las despolimerasas también pueden
combinar sinérgicamente los dos tipos de actividad.
La secreción de las despolimerasas ocurre principal-
mente al fnal de la Fase de crecimiento exponencial y
es usualmente reprimida en presencia de una fuente
de carbono soluble, mientras que el agotamiento de
nutrientes promueve la síntesis de éstas (Jendrossek
et al.
1996). El metabolismo de 3HB suprime la pro
-
ducción de enzimas y causa una desaparición de la
enzima secretada. La despolimerasa extracelular po-
dría representar al menos el 25 % o más del total de la
proteína extracelular. También el 3HB parece inhibir
la excreción de la despolimerasa, lo cual indica que
su producción podría estar sujeta a represión catabó-
lica. Es posible que esta enzima sea reabsorbida por
las células o que sea destruida en la superfcie de la
célula (Delafeld
et al.
1965). La estructura de estas
enzimas secretadas al medio incluye varios dominios
y un péptido señal. Estas proteínas despolimerasas
de PHA (PhaZ) tienen un amplio dominio catalítico
(320-350 aminoácidos) en el extremo N-terminal, un
dominio de enlace al sustrato (40-50 aminoácidos) en
el extremo C-terminal y un dominio de unión (50-100
aminoácidos) conectando los dominios (Jendrossek y
Handrick 2002). El dominio de enlace es el respon
-
sable de la adsorción de la enzima a la superfcie del
SÍNTESIS Y BIODEGRADACIÓN DE PHA
99
polímero insoluble en agua (PHA sólido), lo que per-
mite al dominio catalítico interactuar con la cadena
del polímero (Fukui
et al.
1998). El sitio activo está
conformado por el dominio catalítico constituido por
tres aminoácidos altamente conservados semejante
al de lipasas: serina, aspartato e histidina (Brucato
y Wong 1991) conocido como caja lipasa (lipase
box) y un grupo de aminoácidos que estabilizan el
oxianión. La serina que ataca nucleofílicamente el
enlace éster es parte del pentapéptido (Gly-X-Ser-
X-Gly) que forma la caja lipasa, la cual ha sido
encontrada en todas las hidrolasas conocidas tales
como lipasas, esterasas y proteasas séricas (Jaeger
et al.
1994). Recientemente se han clasi±cado las
despPHA en tres tipos en función de la estructura
de su dominio de enlace del anclaje al sustrato o de
la posición de la caja lipasa en el dominio catalítico
(Jendrossek
et al.
1995, Klingbeil
et al
. 1996). En-
tre las enzimas, de tipo I se encuentran la PhaZ4 de
Pseudomonas lemoignei
(Jendrossek
et al.
1995b)
y la de
Alcaligenes faecalis
T1 (actualmente
Rals-
tonia pickettii
T1) (Shiraki
et al
. 1995), mientras
que las de tipo II son producidas por
Comamonas
testoteroni
(Jendrossek
et al.
1995),
Streptomyces
exfoliatus
(Klingbeil
et al
. 1996) y
Comamonas
acidovorans
YM1609 (Kasuya
et al
. 1997). Las
despolimerasas del tipo I y II (
Fig. 10
) tienen una
±bronectina tipo III (Fn3) como dominio de enlace
al sustrato, mientras que en las del tipo III, como la
P. lemoignei
PhaZ5 (isoenzima A) (Jendrossek
et
al.
1995b) dicho dominio está conformado por una
región rica en treonina. Las enzimas de tipo I y II se
distinguen por la posición de la caja lipasa en el do-
minio catalítico; en las del tipo I tal secuencia se sitúa
alrededor del centro del dominio catalítico, mientras
que en el tipo II se encuentra cercana al extremo N-
terminal. Adicionalmente en las del tipo I, el orden
de la secuencia de aminoácidos activos es histidina
(sitio oxianión)-serina-aspartato-histidina del N
terminal al C terminal. En las del tipo II, el orden es
serina-aspartato-histidina-histidina (sitio oxianión).
Recientemente, se ha propuesto que el dominio de
enlace al sustrato tiene una función adicional sobre la
modi±cación de la estructura del polímero (Murase
et al.
2002a, b). El dominio de unión podría funcio
-
nar como un espaciador que con±ere ²exibilidad
a los dominios de enlace al sustrato y al catalítico,
incrementando la e±ciencia hidrolítica del dominio
catalítico (Nojiri y Saito 1997).
Las despPHA no actúan como lipasas puesto
que éstas no pueden enlazarse a las largas cadenas
de triacilglicerol e hidrolizarlas. Además éstas pre-
sentan como residuo X1 en su sitio activo leucina,
mientras que en las lipasas bacterianas este aminoá-
cido es substituido por histidina. Esto sugiere que
las lipasas de
P. alcaligenes
y
P. aeruginosa
y las
despolimerasas de PHA comparten un mecanismo
similar de hidrólisis de sustrato (Jaeger
et al.
1995).
Sin embargo, algunas lipasas pueden degradar pelí-
culas de P3HB, P4HB, P5HV y P6HHx. Las lipasas
de procariontes hidrolizan exclusivamente películas
de P3HP mientras que las de eucariontes tienen una
amplia especi±cidad de sustrato y pueden degradar al
menos entre 2 a 4 tipos de películas de PHA (Mukai
et al.
1993). También existen despP3HB como la
de
P. funiculosum
que no presentan un dominio de
enlace de sustrato, que no son especí±cas y con una
débil capacidad de enlace a la super±cie del políme
-
ro. Este tipo degrada el P3HB, dímeros y trímeros
de 3HB. Los residuos catalíticos Ser39, Asp121 y
His155 están localizados en una hendidura formada
en la super±cie de la estructura de la enzima. El inte
-
rior de esta hendidura sirve como un sitio de enlace
al sustrato, el cual es su±cientemente amplio para
permitir la incorporación de una sola cadena del
polímero. El ambiente hidrofóbico al interior de la
hendidura enzimática favorece el enlace de las cade-
nas del polímero, permitiéndole degradar el 100 %
de P3HV (Miyazaki
et al.
2000). Las interacciones
hidrofóbicas desestabilizan las interacciones intra e
Fig.10.
Diferencias estructurales de los tipos de despolimerasas de
A. faecalis, C.
acidovorans YM1609
y
P. lemoignei.
1
1
1
138
Dominio
Catalítico
Dominio
fibronectina
tipo III
Dominio de
enlace o
anclaje al
substrato
Pseudomonas lemoignei
Comamonas acidovorans YM1609
Alcaligenes faecalis T1
Región
rica en
treonina
Caja
lipasa
20
137
Tipo I
Tipo II
Tipo III
307
355
407
318
417
469
319
409
461
Y. González García
et al.
100
inter cadena de las cadenas de P3HB, lo cual podría
generar un daño mecánico a las regiones ordenadas
de las cadenas del polímero, incrementando la movi-
lidad de éstas y creando una región susceptible para
la hidrólisis enzimática, resultando en la degradación
efciente de P3HB. El rearreglo espacial de los resi
-
duos catalíticos indica que el mecanismo de despoli-
merización podría ser similar al de una lipasa/serina
esterasa (Yamashita
et al.
2006). La Ser39 juega un
papel central en la reacción catalítica, participando
en un ataque nucleofílico sobre el átomo de carbono
del carbonilo de la cadena de P3HB, mientras que los
residuos His155-Asp121 Forman un sistema de puen
-
tes de hidrógeno con la cadena de P3HB, mejorando
la nucleoflicidad del grupo hidróxilo de la Ser39. El
incremento del tamaño del monómero dentro de la
cadena del PHA incrementa la longitud de la parte
hidrofóbica de la cadena, lo cual podría cubrir pre-
ferencialmente o bloquear la hendidura hidrofóbica
de la enzima evitando o inhibiendo la degradación.
La mayoría de las despolimerasas purifcadas son
específcas para P3HB y para PHA de cadena corta
(desp-scl-PHA). Los microorganismos productores
de despolimerasas extracelulares de cadena media
(desp-mcl-PHA) son relativamente raros y la ma-
yoría pertenece al género
Pseudomonas
(Ramsay
et al.
1994). Una desp-scl-PHA Fue obtenida de
P.
fuorescens
GK123 la que Fue capaz de descomponer
el 95 y 82 % de poli-3-hidroxioctanoato (P3HO)
y poli-3-hidroxidecanoato-co-3-hidroxioctanoato
(P3HDco3HO) después de 38 h y 5 días de cultivo en
condiciones aerobias, respectivamente. Esta despoli-
merasa está constituida por dos cadenas polipeptídi-
cas idénticas con un PM alrededor de 50 kDa con un
rango de pH activo de 6.3 a 9.3 (Schirmer
et al.
1993).
Otra desp-mcl-PHA fue producida recientemente por
una nueva bacteria (
Pseudomonas
sp. RY-1) capaz
de crecer en poli-3-hidroxiheptanoato, octanoato,
nonanoato y conteniendo otros grupos funcionales
(Kim
et al.
2000a, b, c). A diFerencia de la anterior
despolimerasa, ésta tiene cuatro subunidades idén-
ticas, un PM de 115 kDa, un pI de 5.9, una actividad
superior al 80% a un rango de pH de 7.0 a 10 y una
actividad máxima a pH de 8.5 a una temperatura de
35 ºC. Esta despolimerasa Fue parcialmente inactivada
por EDTA pero no inhibida por los inhibidores usuales
de desp-scl-PHA (ditiotreitol y ±uoruro de Fenilmetil
-
sulfonilo) (Shiraki
et al.
1995, Müller y Jendrossek
1993). Estos resultados sugieren que los residuos de
serina, grupos tiol reducidos o puentes disulfuros
no son esenciales en el sitio activo de la enzima,
en analogía con la despolimerasa de P3HO de
P.
fuorescens
GK13 y de
Xantomonas
sp. JS02 (Kim
et al.
2000a, b, c). La importancia de los residuos
de serina en la hidrólisis de PHA de cadena media
ha sido evidenciado en despolimerasas aisladas y
purifcadas de
Pseudomonas luteola
M13-4 (Rhee
et al.
2006) y
P. alcaligenes
LB19 (Kim
et al.
2002). En contraste con otras despolimerasas, la
correspondiente de
P. luteola
M13-4 presentó un
bajo peso molecular (28 kDa), pI de 6, actividad
óptima a pH de 10 a una temperatura de 40 ºC. Esta
enzima degradó totalmente P3HO mientras que
sólo parcialmente el poli-3-hidroxihexanoato y un
copolímero de P(3HB-co-60%3HV). La hidrólisis
enzimática de PHA primero ocurre en la fase amorfa,
seguida por la zona cristalina del polímero. La velo-
cidad de degradación de películas de P3HB y de sus
copolímeros ha sido evaluada, encontrando que el
incremento de la cristalinidad, el tamaño del cristal y
espesor de la película tienen un efecto marcado sobre
dicho parámetro (Kasuya
et al.
1999). El dominio
hidroFóbico de enlace de sustratos de las despP3HB
permite la adsorción a la superfcie del cristal o pe
-
lícula del polímero, incrementando la movilidad y el
desorden de las cadenas empaquetadas de P3HB. Esto
es necesario para iniciar el ataque enzimático sobre
las cadenas del polímero por el dominio catalítico
(Sudesh
et al
. 2000). La velocidad global de degrada
-
ción se incrementa rápidamente con la concentración
y velocidad de ataque de la despP3HB hasta el valor
máximo, seguida por una disminución gradual y una
variación en la pérdida de peso de la película del po-
límero, sin un cambio en la cristalinidad total durante
la hidrólisis. La degradación enzimática de cristales
de P3HB con despP3HB de
P. lemoignei
(Nobes
et al.
1996) y
R. picketti
T1 (Iwata
et al.
1997b, Murase
et
al.
2001a) Fue observada por microscopia de Fuerza
atómica y de transmisión de electrones, encontrando
que la hidrólisis enzimática progresa de las partes
terminales cortas de los cristales formando grietas a
lo largo del eje longitudinal, mientras que la hidrólisis
lateral de los mismos difícilmente ocurre. La tripsina
o activador modifca la estructura de la superfcie
de los gránulos del polímero eliminando proteínas
de ésta, permitiéndole a la despolimerasa encontrar
y enlazarse a la superfcie del polímero. El tercer
componente del sistema biocatalítico de PHA es una
hidrolasa dimérica responsable de la degradación de
los productos de hidrólisis primaria de P3HB (p.e.
dímeros y oligómeros de 3HB) a 3HB.
La degradación intracelular es una respuesta en-
dógena de la bacteria que le permite emplear (hidro-
lizar) sus reservas de carbono acumuladas en forma
de PHA a monómeros mediante la participación de
despolimerasas intracelulares de PHA (despintPHA).
SÍNTESIS Y BIODEGRADACIÓN DE PHA
101
En el caso del P3HB, éste es hidrolizado a 3HB y a
su vez oxidado a acetoacetato por una deshidrogena-
sa dependiente de NAD. El acetoacetato es conver-
tido a acetoacetil-CoA por la succinato deshidroge-
nasa. Sin embargo, existe otro mecanismo en
Zoo-
gloea ramigera
de formación de acetoacetato-CoA
mediante una reacción de esterifcación catalizada
por una CoA-sintetasa usando ATP (Dawes 1988).
Las despintPHA son específcas para la Forma nativa
y amorfa del PHA intracelular. Al respecto, pocos
estudios sobre la degradación intracelular de P3HB
han sido publicados, por lo que se sabe poco sobre
las despolimerasas involucradas. La estrecha asocia-
ción de estas enzimas con la superfcie de los gránu
-
los conteniendo este polímero y la dependencia de
la actividad enzimática con la integridad estructural
de los gránulos han difcultado adicionalmente el
estudio de las mismas. Las despintPHA han sido
menos estudiadas que sus contrapartes extracelulares,
permaneciendo algunos mecanismos como el de su
regulación aún no muy bien entendidos. Merrick y
DoudoroFF (1964) Fueron los primeros en reportar el
sistema intracelular de despolimerasa de P3HB de
Rhodospirillum rubrum
, el cual fue usado para de-
gradar gránulos nativos de P3HB aislados de
Bacillus
megaterium
. Este sistema está compuesto de un ac-
tivador termoestable (tripsina) que actúa sobre las
proteínas de la capa superfcial de los gránulos nati
-
vos de P3HB para ser hidrolizados posteriormente
por una despolimerasa termolábil. Los sistemas de
degradación intracelular de P3HB son Frecuentemen
-
te muy complejos, como el de
Ralstonia eutropha
(Uchino
et al.
2008), que podría tener hasta nueve
despP3HB clasifcadas en cuatro clases (PhaZa, b, c
y d) (Pohlmann
et al.
2006). La PhaZa1 está amplia
-
mente distribuida entre bacterias (York
et al.
2003),
no contiene el pentapéptido de la caja lipasa (Glu-
X1-Ser-X2-Gly) como todas las despolimerasas
extracelulares de P3HB (despextP3HB). En esta
clase de enzimas la cisteína substituye a la serina en
el sitio activo (Kobayashi y Saito 2003). La PhaZb
y PhaZc presentan la secuencia de la caja lipasa en
sus sitios activos. Estas diferencias estructurales
entre los diferentes grupos de despolimerasas deter-
minan en gran medida la especifcidad de las mismas
por diferentes sustratos. La enzima PhaZa hidroliza
P3HB pero no oligómeros lineales o cíclicos de 3HB
a diferencia de la PhaZb que lo realiza preferencial-
mente de manera endo y exo (Scherer
et al.
2000).
Este tipo de enzima se ha encontrado en el género
Wautersia
(especies:
eutropha y metallidurans
). Los
principales productos generados por la PhaZ1 a
partir de P3HB son oligómeros de 3HB de diFerentes
longitudes, sobre los cuales actúa la PhaZb, que
presenta una amplia especifcidad por este tipo de
sustratos produciendo los monómeros correspondien-
tes. Estas enzimas actúan sinérgicamente y la loca-
lización de ambas en los gránulos de P3HB garanti
-
za una rápida degradación de P3HB
in vivo
. La pri-
mera secuencia de una despolimerasa intracelular
(PhaZ1Rue;
Ralstonia eutropha
H16) fue reportada
por Saegusa
et al.
(2001), la cual pudo degradar
P3HB amorFo pero no cristalino. Recientemente, una
despintPHA de
R. eutropha
Fue efcientemente puri
-
fcada, maniFestando una actividad hidrolasa del tipo
exo y endo sobre oligómeros lineales y cíclicos de
3HB, respectivamente. Las propiedades cinéticas de
esta enzima fueron muy similares a las de una oligó-
mero-hidrolasa extracelular de 3HB de
R. picketii
T1, reportada como una hidrolasa del tipo exo (Ko-
bayashi
et al.
2003). La enzima PhaZc tiene un bajo
PM (30 kDa) con una alta actividad hidrolasa de
oligómeros de 3HB comparada con otras hidrolasas
de oligómeros de 3HB. La enzima PhaZc no es ni
lipasa ni una esterasa no específca que se ha encon
-
trado en gránulos nativos de P3HB y que degrada
P3HB amorFo artifcial. La síntesis y degradación de
P3HB parece ocurrir simultáneamente (Kawaguchi
y Doi 1992), sin embargo, este recambio desde el
punto de vista de economía energética parece ser una
desventaja para la bacteria. La degradación
in vivo
de P3HB se inicia con la acción de la despolimerasa
PhaZa1 o PhaZb que provoca varias incisiones en las
cadenas de las moléculas amorFas de P3HB, dando
como resultados oligómeros de 3HB de longitud
mediana que permanecen unidos a los gránulos y que
mantienen la hidrofobicidad de los mismos. De ma-
nera consecuente se origina una descompactación de
las mismas cadenas de P3HB y una cantidad peque
-
ña de monómeros de 3HB y oligómeros de 3HB de
cadena corta que difunden de los gránulos. La PhaZb
degrada de manera exo los oligómeros y cadenas
descompactadas de 3HB sobre los gránulos de P3HB
a 3HB. ±inalmente, la PhaZb localizada en el citosol
hidroliza los oligómeros de 3HB diFundidos. En
contraste con otras despintPHA conocidas, las PhaZ
de
B. thuringiensis
y
B. megaterium
generan una
mayor cantidad de monómeros de 3HB de los grá
-
nulos nativos de P3HB, correspondiendo aproxima
-
damente a un 42 y 34 % del total, respectivamente.
Estos valores en el caso de la despolimerasa PhaZ7
de
Paucimonas lemoignei
se encuentran apenas entre
el 0.5-2.5 % del total de equivalentes de 3HB pre
-
sentes en los gránulos de P3HB (Handrick
et al.
2001). Se evaluó la degradación intracelular de varias
inclusiones de PHA en
Hydrogenophaga pseudofa
-
Y. González García
et al.
102
va
, incluyendo copolímeros de 3HB, 4HB y de 3HV
y de homopolímeros de estos monómeros acumula-
dos separadamente en la célula (Yoon
et al.
1995,
Yoon y Choi 1999). El copolímero de 3HB/4HB fue
degradado cuando el polímero contenía un nivel
mínimo de 3HB, mientras que en el caso de los ho
-
mopolímeros de 3HB (P3HB) ó 4HB (P4HB), úni
-
camente el P3HB fue degradado. Esto muestra la
inactividad total de la despolimerasa intracelular
contra el P4HB. Estos resultados, aunados a los ob
-
tenidos mediante resonancia magnética nuclear de
13
C de la degradación de copolímeros conformados
con diferentes relaciones molares de 3HB, 4HB y
3HV, han demostrado que la degradación intracelular
de PHA es dependiente de la secuencia local del
polímero y que el paso de despolimerización es uno
de los limitantes en la velocidad de degradación in-
tracelular de PHA. La velocidad de despolimeriza-
ción está gobernada por la especiFcidad de la enzima
hacia la secuencia de monómeros, tales como díme-
ros, trímeros y tetrámeros. La despintPHA de
H.
pseudofava
no es una enzima que rompa la cadena
del polímero de manera secuencial. Además, su in-
capacidad de degradar P(4HB) y de copolímeros
ricos en 4HB, permite concluir que la presencia de
un carbono quiral en el grupo éster y la posición gama
al carbonilo susceptible a la oxidación, son esencia-
les para la reacción de hidrólisis por la despolimera-
sa. Para el caso de P3HB se reportó una velocidad
de degradación de primer orden y la comparación
de las constantes de velocidad de los diferentes PHA
determinaron que la especiFcidad relativa hacia los
sustratos de la despolimerasa es en el orden:
3HB>3HV>4HB. Recientemente, una desp-mcl-
PHA de
T. thermophilus
HB8, diferente a las pre
-
viamente reportadas en bacterias, ha sido puriFcada
y caracterizada cinéticamente (Papaneophytoua
et
al.
2011). Este es de los pocos microorganismos
capaces de secretar diferentes despolimerasas que
degradan P3HB de cadena corta y mediana, depen
-
diendo de las condiciones de crecimiento. La desp-
mcl-PHA es secretada en presencia de alcanoatos
de cadena media pero no en presencia de glucosa o
de alcanoatos de cadena corta. A pesar de que con-
tiene los tres dominios característicos en su estruc-
tura, no presenta la secuencia típica del pentapép-
tido situado en la caja lipasa, puesto que en lugar
de tener isoleucina (X1) y Ser (X2) contiene glici
-
na y tirosina, respectivamente. Adicionalmente en
el sitio de formación del oxianión durante la hidró-
lisis del PHA, la histidina es remplazada por aspa-
ragina. Esta metaloproteína de bajo PM (28 kDa)
tiene un pH óptimo de actividad a 8.5 mientras que
su temperatura óptima (70 ºC) es superior a las
reportadas previamente para despolimerasas de
Xantomonas
sp
.
JS02 (60 ºC),
Streptomyces
sp
.
KJ-
72 (50 ºC) y
P. alcaligenes
LB19 (35 ºC), debido
probablemente a su gran número de aminoácidos
cargados (64), que promueven una mayor interac
-
ción electrostática entre éstos (puentes de hidróge-
no y salinos) estabilizando la estructura de la enzi-
ma a altas temperaturas.
Estudios en
Pseudomonas oleovorans
sobre la
síntesis y degradación intracelular de P3HO, demos
-
traron que antes de que la bacteria complete la utili-
zación de la fuente de carbono del medio, la célula
disminuye la concentración de polimerasa (de 20 a
12%) mientras que incrementa la producción de la
despolimerasa (de 10 al 15%) (Lenz y Marchessault
2005). Este comportamiento parecería representar la
respuesta de la célula a un ambiente metabólico cada
vez menos permisible (Stuart
et al.
1996), preparán-
dose las células a movilizar las reservas intracelulares
de carbono para su supervivencia. En
Alcaligenes
eutropha
, la síntesis y degradación de poliésteres
puede proceder simultáneamente (Doi
et al
. 1990).
La velocidad de degradación
in vitro
del ácido poli-
hidroxinonanoico (PHN) en
P. oleovorans
a pH 9 y
30 ºC, ha sido determinada en 0.92 mg/h, siendo muy
similar a las reportadas previamente para cuerpos de
inclusión de P3HO y poli-3-hidroxi-5-fenilvalerato
(PHPV) (0.98 mg/h). Sin embargo, en inclusiones
conteniendo mezclas de PHN/PHPV la velocidad de
degradación fue muy baja (0.30 mg/h), posiblemente
por la distribución inusual de los polímeros dentro
de los cuerpos de inclusión. La actividad de despoli-
merasas intracelulares en estudios
in vitro
contrasta
con aquellas obtenidas en pruebas de degradación
in vivo
de inclusiones de P3HN, PHPV y P3HV/
PHPV. En estos casos, la degradación
in vivo
de
P3HN procedió signiFcativamente más rápido que
la de su contraparte para PHPV. Además de que, la
degradación de P3HN se lleva a cabo preferencial
-
mente cuando se encuentra en las inclusiones con
PHPV. Entre las razones reportadas para explicar
la diferencia entre las velocidades de degradación
in vitro
e
in vivo
, se encuentran, primero que la ve-
locidad de degradación
in vivo
pudiera ser limitada
respecto a la
in vitro
debido a la variedad de enzimas
o a la falta de especiFcidad por el sustrato para la
utilización del polímero que se puede presentar
in
vivo
, comparado con una sola despolimerasa que se
utiliza en los ensayos
in vitro
. Una segunda razón,
podría ser que los estudios
in vitro
se realizan a las
condiciones óptimas determinadas y requeridas por
la(s) enzima(s), lo cual no necesariamente ocurre
in
SÍNTESIS Y BIODEGRADACIÓN DE PHA
103
vivo
. En este sentido, estudios
in vitro
demostraron
que la despolimerasa intracelular de
P. oleovorans
fácilmente degradó P3HN y PHPV, mientras que
in
vivo
, el P3HN fue degradado preferencialmente. Esto
sugiere que en este microorganismo otros procesos
en el metabolismo de PHA limitan la velocidad de
degradación de PHPV
in vivo
. La presencia del grupo
aromático en las unidades del polímero posiblemente
es el factor limitante, tal y como lo han sugerido
otros estudios empleando PHPV y despolimerasas
extracelulares de
P. maculicola
(Foster
et al.
1995).
El sistema de despolimerización intracelular de PHA
de cadena mediana aún no ha sido bien elucidado
en comparación con la información disponible de
los genes que codi±can para las enzimas intracelu
-
lares que degradan los PHA de cadena corta. En los
últimos años se ha caracterizado el gene de la des-
polimerasa phaZ de
P. putida
KT2442, que es capaz
de hidrolizar especí±camente PHA de cadena media
conteniendo monómeros alifáticos y aromáticos. Esta
despolimerasa, localizada en los gránulos de PHA, se
comporta como una serina hidrolasa y degrada tales
polímeros de manera endo y exo (de Eugenio
et al.
2007, 2008). La degradación intracelular de PHA
acumulado con cierta heterogeneidad estructural en
P. putida
y
P. citronellolis
(Chung
et al.
2001) fue
catalogada como una cinética de primer orden, con
dos diferentes constantes de velocidad (k
1
) una de
0.087 y otra de 0.015 h
–1
durante las primeras 20 h
de degradación. En la última etapa de degradación,
la velocidad de desaparición de las unidades de 3HO
fue estimada en 0.020 h
–1
y comparable a la de HPV
(de 0.015 h
–1
). Inicialmente una más alta desaparición
de 3HO se observa debido a la degradación de P3HO,
mientras que en la última fase ésta fue más lenta como
consecuencia de la degradación de las unidades de
3HO incorporadas con las de HPV en las cadenas del
copolímero. En contraste, los valores de k
1
para el
PHA de
P. citronellolis
fueron de 0.035 y 0.029 h
–1
para las unidades de 3HO y HPV, respectivamente;
indicando esta similitud de velocidades la naturaleza
al azar del copolímero del PHA de
P. citronellolis
.
Adicionalmente, la velocidad de degradación de
P3HO respecto a la de PHPV por la despolimerasa
intracelular de
P. putida
indica que ésta es más es-
pecí±ca para el PHA alifático que para el aromático.
La evaluación de la cinética de adsorción e hidrólisis
de la despextP3HB de
A. faecalis
sobre la super±cie
de cinco tipos de películas de PHA, permitió poner
en evidencia que las películas de P3HB, P3HP y
P4HB fueron hidrolizadas por la enzima, en tanto
que las correspondientes de P(S-2-hidroxipropionato)
y P6HHx no lo fueron. La despP3HB se adsorbió
sobre todas las películas siguiendo una cinética
descrita por la isoterma de Langmuir (Kasuya
et al.
1996). Esto evidencia que el dominio de enlace de la
despolimerasa no es especí±co para las películas de
PHA mientras que el sitio activo es especí±co para la
hidrólisis de PHA. Debido a la escasa información de
las estructuras terciarias de despP3HB, no se conoce
especí±camente cuales aminoácidos del dominio
de enlace de la enzima están involucrados en la
adsorción a la super±cie del polímero y como éstos
contribuyen en tal proceso. Últimamente, mediante
estudios de mutagénesis aleatoria y de microscopía
de fuerza atómica se pudo identi±car los aminoácidos
involucrados en la reacción, así como la fuerza de
adhesión (100 pN) implicada en la adsorción al P3HB
de la despP3HB (PhaZ
RpiT1
) de
Ralstonia pickettii
T1. Entre los aminoácidos del dominio de enlace de
la enzima, la Ser, Val, Leu, Ala y Tyr probablemente
participan en la adsorción de la enzima a la super±cie
del P3HB mientras que la Leu441, Tyr443 y Ser445
podrían estar directamente implicadas en la adsorción
(Hirashi
et al.
2010). El análisis sugiere que la alta
hidrofobicidad de estas tres posiciones mejora la
capacidad de adsorción de la enzima.
En general, los PHA son insolubles en agua y
pueden ser degradados a una velocidad moderada
(3-9 meses) por muchos microorganismos. La eva
-
luación y monitoreo de la biodegradación de PHA
incluye: observación visual (rugosidad de la super±
-
cie, formación de ori±cios o grietas, fragmentación,
cambios en color o formación de biopelículas sobre
la super±cie); microscopía electrónica de barrido
(SEM) o de fuerza atómica (AFM); cambios en las
propiedades mecánicas y masa molar (Erlandsson
et al.
1997); medición de la pérdida de peso y el
empleo de la técnica de formación de zona clara
(Nishida y Tokiwa 1993, Abou-Zeid 2001). La
mayoría de las bacterias y hongos degradadores de
polímeros en cultivos puros hasta ahora son inicial-
mente aislados sobre cajas Petri con esta técnica.
La respirometría (producción o evolución de CO
2
/
consumo de O
2
) (Püchner
et al.
1995) o exclusiva
-
mente la formación de CO
2
(prueba de Sturm) es el
método más frecuentemente empleado para medir
la biodegradación en pruebas de laboratorio, obte-
niendo información directa sobre la bioconversión
del esqueleto carbonado del polímero al producto
±nal metabólico (Pagga
et al.
2001). Una manera
rápida de evaluar la capacidad de degradación de
PHA es mediante el empleo de medios sólidos a
base de agar y gránulos desnaturalizados del polí-
mero (método de zona clara) o considerando una
película delgada de dicho material asociada con un
Y. González García
et al.
104
colorante (p.e. rojo Sudán) para el caso de poner en
evidencia despolimerasas de PHA de cadena corta
o de cadena media, respectivamente. De manera
paralela se han desarrollado emulsiones de PHA y
surfactantes, estables y resistentes al calor para la
rápida identifcación y aislamiento de microorga
-
nismos degradadores de PHA (Ramsay
et al.
1994,
Horowitz
et al.
1994 y 1995, Marchessault
et al.
1995, Schirmer
et al.
1995). Las bacterias con rápi
-
do crecimiento y altas velocidades de hidrólisis de
los polímeros pueden ser diferenciadas de aquellas
con bajas capacidades de hidrólisis de PHA por la
medición del diámetro de las colonias y de las zonas
claras (halos) generadas alrededor de las mismas.
En la actualidad, los polímeros residuales tales
como los biopoliésteres han tenido mucha atención
como fuentes concentradas de monómeros, lo que ha
permitido la reducción de costos de producción y de
la emisión de dióxido de carbono (Tokiwa y Jarerat
2004). El reciclado químico de estos materiales es
un proceso rápido que convencionalmente involucra
degradaciones térmicas e hidrolíticas como primer
paso para la generación de sustratos monoméricos
u oligoméricos a partir de poliésteres. Sin embargo,
estos métodos producen subproductos indeseables,
tales como racematos y compuestos tipo crotonato
(Fan
et al.
2003, Saeki
et al.
2005, Abe 2006). Una
posible solución a este problema es la aplicación de
enzimas, tales como las despP3HB para el reciclado
de P3HB, debido a las ventajas que presentan. Entre
éstas podemos destacar, su alta especifcidad que
evita la formación de productos indeseables, su ca-
pacidad de funcionar bajo condiciones moderadas y
su formación a partir de fuentes renovables (Schulze
y Wubbolts 1999, Ran
et al.
2008).
CONCLUSIONES
Los PHA son plásticos microbianos biodegra-
dables y biocompatibles que se obtienen a partir
de fuentes renovables. Actualmente se producen a
escala industrial usando principalmente bacterias
silvestres, aunque también se está estudiando su ob-
tención con microorganismos recombinantes, y por
vía enzimática. Sus propiedades físicas dependen
en gran medida de su estructura química, siendo los
PHA de cadena corta los más estudiados, en especial
el P3HB, mientras que la investigación de los PHA
de cadena media aún representa un gran campo de
de estudio. Con base en las propiedades físicas de
los PHA que se conocen hasta el momento, estos
podrían utilizarse como sustitutos de algunos plás-
ticos derivados del petróleo, como el polipropileno
y el polietileno y su uso ha sido enfocado como
materia prima para fabricar productos desechables
biodegradables. Sin embargo, la principal desven-
taja para utilizarlos extensivamente es su precio, el
cual resulta superior al de los plásticos derivados
del petróleo. No obstante, en los últimos años se han
ido ampliando y popularizando sus aplicaciones en
áreas más especializadas, como la biomédica y la
farmacéutica, en donde la biocompatibilidad y fun-
cionalidad de estos biopolímeros justifcan su costo.
Las tendencias actuales en cuanto a la producción
de PHA por microorganismos se enfocan en dos
puntos centrales:
a) Lograr que el proceso de producción sea com-
petitivo económicamente y sea ambientalmente
amigable. En este sentido, los trabajos de inves-
tigación se han focalizado en la optimización
de procesos de fermentación para aumentar
su productividad, obteniendo cultivos de alta
densidad y con alto contenido de polímero;
también se ha buscado mejorar los procesos de
extracción y purifcación del PHA para alcanzar
mayores efciencias de recuperación, minimi
-
zando el uso de solventes tóxicos. Asimismo,
se ha investigado sobre el uso de fuentes de
carbono económicas, renovables y altamente
disponibles, con el fn de disminuir los costos de
producción. En este sentido el glicerol derivado
de la producción de biodiesel, los hidrolizados
de residuos celulósicos y diversos e±uentes
agroindustriales, son sustratos con gran poten-
cial para este fn. En México, en particular sería
interesante utilizar como fuente de carbono
residuos de la industria tequilera y cervecera,
así como subproductos y residuos del cultivo
de maíz y de los procesos industriales basados
en este grano. De manera paralela se están
buscando nuevos microorganismos, capaces de
acumular grandes cantidades de polímero, que
presenten un crecimiento rápido bajo diversas
condiciones ambientales y utilicen fuentes de
carbono económicas; así como el estudio del
metabolismo de microorganismos ya conocidos,
para llevar a cabo modifcaciones genéticas exi
-
tosas que den lugar a cepas superproductoras.
b) Obtener PHA con propiedades físicas nuevas
o mejoradas que permitan ampliar su uso en
aplicaciones de alto valor agregado, mediante la
búsqueda nuevos microorganismos silvestres o
modifcados genéticamente, capaces de sintetizar
copolímeros con estructura y peso molecular de-
seable. Una segunda estrategia considerada es la
SÍNTESIS Y BIODEGRADACIÓN DE PHA
105
modifcación química o enzimática del polímero
previamente producido y extraído, con el fn de
lograr las características deseables del mismo.
En cuanto a la biodegradación de estos materiales,
aún faltan estudios que permitan comprender mejor los
mecanismos y la importancia de los microorganismos
implicados en el proceso de degradación, especialmen-
te de los PHA producidos mediante la incorporación
de algunos precursores complejos, modifcados quí
-
micamente o mezclados con otros compuestos, ya que
estos factores podrían afectar su biodegradabilidad.
Adicionalmente, una línea emergente de investigación
con un amplio potencial en esta área es el estudio y
caracterización de las enzimas despolimerasas para
aplicarlas en la degradación controlada de PHA, con el
fn de obtener oligómeros y monómeros con potencial
de uso en aplicaciones especializadas.
En Latinoamérica el único país que produce
comercialmente estos bioplásticos es Brasil, espe
-
cífcamente la empresa Biocycle que utiliza como
fuente de carbono azúcar de caña. En el caso de
México, la investigación sobre PHA por los cen-
tros de investigación y universidades existentes
es escaso. Sin embargo en nuestro país existe una
gran área de oportunidad en el estudio de diferentes
residuos agroindustriales como materia prima para
la biosíntesis de PHA. Por otro lado, los países
latinoamericanos y en especial México, tienen una
enorme diversidad biológica la cual no ha sido ex-
plotada para la búsqueda de nuevos microorganis-
mos, que produzcan PHA más efcientemente, o que
sinteticen polímeros con propiedades novedosas,
lo cual es también un área de oportunidad para la
investigación científca.
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