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Red de Revistas Científicas de América Latina y el Caribe, España y Portugal
Rev. Int. Contam. Ambie. 29 (2) 189-200, 2013
EXTRACCIÓN ASISTIDA POR MICROONDAS Y LIMPIEZA EN FASE SÓLIDA
COMO MÉTODO DE ANÁLISIS PARA LA DETERMINACIÓN DE PLAGUICIDAS
ORGANOFOSFORADOS EN
Ambystoma mexicanum
Manuel HERNÁNDEZ QUIROZ
1
, Jesús HERNÁNDEZ SOTO
2
, Francisco ROJO CALLEJAS
2
,
Cecilia ROBLES MENDOZA
3
, Cecilia VANEGAS PÉREZ
1
y Claudia PONCE DE LEÓN HILL
1*
1
Facultad de Ciencias, Universidad Nacional Autónoma de México, Av. Universidad 3000 Delegación Coyoacán
04510, México D.F.
2
Facultad de Química, Universidad Nacional Autónoma de México, Av. Universidad 3000 Delegación Coyoacán
04510, México D.F.
3
Facultad de Ciencias, Unidad Multidisciplinaria de Docencia e Investigación-SISAL, Universidad Nacional
Autónoma de México, Sisal, Yucatán
*Autora responsable: caplh@ciencias.unam.mx
(Recibido junio 2012, aceptado febrero 2013)
Palabras clave: ajolote, anfbios, extracción asistida por microondas, cromatograFía de gases
RESUMEN
En los últimos años la población del ajolote
Ambystoma mexicanum
ha disminuido
drásticamente en su hábitat natural en los canales de Xochimilco y Chalco. Entre otras
causas se proponen la pesca Furtiva, la depredación y competencia con especies no na
-
tivas introducidas en su hábitat y los eFectos adversos ocasionados por contaminantes.
Con respecto a este último, hay una creciente preocupación a nivel mundial acerca de
los eFectos subletales de los plaguicidas organoFosForados en humanos y animales,
incluyendo su posible papel en la disminución global de las poblaciones de anfbios. A
diFerencia de otros grupos de vertebrados, los anfbios presentan características que los
hacen más vulnerables a los cambios ambientales como son la piel “desnuda”, glandular
y permeable, lo cual determina que sean considerados buenos indicadores de la calidad
del ambiente. Es por ello que el desarrollar y contar con métodos óptimos para la detec
-
ción de los plaguicidas organoFosForados en el medio externo y en los organismos es un
aspecto Fundamental para estudios toxicológicos, máxime cuando estas concentraciones
se encuentran en niveles subletales. El análisis de los plaguicidas en organismos acuáticos
no es un procedimiento sencillo debido a que los tejidos son matrices muy complejas por
la diversidad de compuestos y sustancias que contienen, muchas de ellas con la posibi
-
lidad de interFerir en la determinación del contaminante. En todos los casos se requiere
de al menos un paso de extracción y uno de limpieza para evitar las interFerencias en la
detección de los plaguicidas de interés. Es por ello que el objetivo del presente estudio es
proponer un método efciente para la determinación de los plaguicidas organoFosForados
etoproFos, diazinón, metil-paratión, malatión y clorpiriFos en tejidos de ajolotes y su cuan
-
tifcación por cromatograFía de gases (GC). En el presente estudio se utilizó la extracción
asistida por microondas (EAM) para la extracción de plaguicidas organoFosForados en
ajolote y se demostró que la EAM con diclorometano durante 15 min a una potencia de
1200 W, es un método de extracción adecuado, simple y efcaz que evita la pérdida de
los analitos al extraerlos en un solo paso en un sistema cerrado. La limpieza del extracto
con cartuchos combinados con C18-Florisil® logró recuperaciones arriba del 90 % para
todos los plaguicidas organoFosForados estudiados en este anfbio. Los parámetros de
M. Hernández Quiroz
et al.
190
validación del método como linealidad, límites de detección y cuantifcación, repetibili
-
dad, reproducibilidad e índice HorRat Fueron evaluados para dar confablidad al método
y tuvieron valores apropiados para la identifcación de los plaguicidas organoFosForados
etoproFos, diazinón, metil-paratión, malatión y clorpiriFos. El método pudo ser utilizado
exitosamente al evaluar la bioacumulación de clorpiriFos en ajolotes expuestos a 0.05 y
0.1 mg/kg del plaguicida.
Key words: axolotl, amphibians, microwave assisted extraction, gas chromatography
ABSTRACT
In recent years the population oF
Ambystoma mexicanum
has declined dramatically in
their natural habitat in the canals oF Xochimilco and Chalco. Among others, the proposed
main causes For its decline are poaching, depredation and competition with introduced
non-native species in their habitat, and adverse eFFects due to contaminants. The latter is
oF growing global concern owing to the sublethal eFFects oF organophosphorus pesticides
in humans and animals, including their possible role in the overall decline oF amphibian
populations. Unlike other vertebrate groups, several aspects make amphibians more vul-
nerable to environmental changes such as “naked”, glandular and permeable skin. This
Feature makes amphibians to be considered as good indicators oF environmental quality. In
this respect, the development oF optimum methods For the detection oF organophosphorus
pesticides in the environment and the organisms under study is a Fundamental aspect For
toxicological studies, especially when their concentrations are Found at sublethal levels.
The analysis oF pesticides in aquatic organisms is not a simple procedure due to the Fact
that tissues are a highly complex matrix that contains a diversity oF compounds and sub
-
stances, all with the possibility oF interFering in the determination oF the pollutant. All
pesticide analysis require an extraction and a cleaning step to avoid interFerence in the
detection oF the pesticides oF interest. ThereFore the objective oF this study is to propose
an eFfcient method For the determination oF organophosphorus pesticides (ethoprophos,
diazinon, methyl parathion, malathion and chlorpyriFos) in axolotl tissue with gas chroma
-
tography (GC) quantifcation. The present study describes the use oF microwave-assisted
extraction (MAE) For the extraction oF organophosphorus pesticides in
A. mexicanum
. It
was demonstrated that the use oF MAE with dichloromethane For 15 min at a power oF
1200 W is a suitable extraction method, simple and eFFective to prevent the loss oF the
analytes to be extracted in a single step in a closed system. The cleaning oF the extract
with C18-±lorisil® cartridges achieved recoveries above 90% For all the organophosphate
pesticides studied. The validation parameters oF the method, linearity, limit oF detection
and quantifcation, repeatability, reproducibility and HorRat index were evaluated to
certifcate it as a trustworthy method. Appropriate values For the identifcation oF the
organophosphorus pesticides ethoprophos, diazinon, methyl parathion, malathion and
chlorpyriFos in the axolotl were obtained For the validation parameters.
The method was
successFully used to evaluate the bioaccumulation oF chlorpyriFos in axolotls exposed to
sublethal concentrations (0.05 and 0.1 mg/kg) oF the pesticide.
INTRODUCCIÓN
En los últimos años, la población del ajolote
Ambystoma mexicanum
ha disminuido drásticamente
en su hábitat natural, los canales de Xochimilco y
Chalco. En 2007, Zambrano y colaboradores registra-
ron una densidad de sólo 0.001 organismos por m
2
. La
baja densidad poblacional de este anfbio se atribuye
a varios Factores ambientales como son la destruc
-
ción y modifcación de su hábitat, la pesca Furtiva,
la introducción de especies no nativas (depredadoras
y competidoras por alimento), el incremento de la
radiación ultravioleta, la presencia de patógenos y los
eFectos adversos ocasionados por la contaminación
por residuos domésticos e industriales (Zambrano
et al.
1999, Zambrano
et al.
2007). Con respecto a
este último Factor, hay una creciente preocupación
a nivel mundial sobre los eFectos subletales de los
DETERMINACIÓN DE PLAGUICIDAS ORGANOFOSFORADOS EN
Ambystoma mexicanum
191
plaguicidas organofosforados (OP) en humanos y
animales (Gralewicz y Socko 1997, Azaroff 1999,
Jaga y Dharmani 2003), incluyendo su posible pa-
pel en la disminución global de las poblaciones de
anFbios (Schuytema
et al.
1993, Taylor
et al.
1999,
Kiesecker 2002, Gilbertson
et al.
2003).
Debido a la reducción de las poblaciones silvestres,
A. mexicanum
ha sido clasiFcada dentro de la Norma
Oficial Mexicana NOM-059-SEMARNAT-2001
publicada en el Diario OFcial como especie sujeta a
protección especial. A su vez, la autoridad cientíFca
mexicana perteneciente a la Convención sobre el
Comercio Internacional de Especies Amenazadas de
Fauna y Flora Silvestres (CITES por sus siglas en
inglés) ha propuesto la reclasiFcación de la especie
del Apéndice II al Apéndice I, donde son incluidas las
especies que no deben ser objeto de comercio debido
a la problemática de su conservación (CITES 2005).
Estas características catalogan obligatoriamente al ajo-
lote como una especie de estudio dentro de los planes
de acción para la conservación del sistema lacustre de
Xochimilco, para lo cual es necesario determinar las
medidas de conservación, manejo y aprovechamiento
sustentable de la ±ora y fauna nativa del área. Dentro
de los planes de acción, la diagnosis de la vulnerabili-
dad del ajolote ante los factores de estrés presentes en
su hábitat natural es de particular importancia. Cabe
resaltar que, a diferencia de otros grupos de verte
-
brados, los anFbios presentan características que los
hacen más vulnerables a cambios ambientales como
son su piel “desnuda” (por la carencia de escamas,
pelo o plumas como en otros organismos), glandular
y permeable, y el estadio de huevo carente de cáscara,
lo que los hace estar en contacto directo con el medio
circundante (agua, suelo, luz, etc.) (Lagerspetzj 1977,
Álvarez
et al.
1995). Por estas características los anF
-
bios han sido considerados indicadores de la calidad
del ambiente (Banerjee 1991).
Las fuentes potenciales de contaminación de los
canales de Xochimilco son diversas. Tomando en
cuenta que Xochimilco es uno de los principales
abastecedores de hortalizas y ±ores del Distrito
Federal y de la zona metropolitana (Banerjee 1991),
se considera que el uso de compuestos agroquímicos
es elevado y por ende su aportación al sistema es
considerable. En México, la aplicación de com-
puestos organofosforados para el control de plagas
en cultivos agrícolas es una práctica común y su
acumulación se ha detectado en diversos organismos
acuáticos vertebrados e invertebrados (Alejandre
2007). A nivel nacional se calcula que, producto de
la actividad agrícola, se descargan 380 m
3
/s de agua
conteniendo plaguicidas y fertilizantes (CNA 1996).
Los plaguicidas organofosforados han sustituido a
los más perniciosos organoclorados y aunque los
primeros son menos persistentes que los organo
-
clorados, algunos de ellos pueden presentar una
elevada toxicidad (Routt y James 1999).
En México, los estudios referentes a la evalua
-
ción del destino ambiental Fnal de los agroquími
-
cos y de los efectos en la biota acuática y terrestre
son escasos o nulos, lo cual limita el desarrollar
e implementar un programa de manejo y control
ambiental de sus aportes. Entre los organismos
acuáticos, los peces han sido el grupo más estudiado
particularmente en relación a la bioacumulación
de plaguicidas, debido a su facilidad de manejo, su
abundancia en los sistemas y su importancia comer-
cial como producto de consumo humano. En el caso
de los anFbios, son escasos los estudios realizados
a pesar de ser considerados buenos indicadores de
estrés químico debido a la permeabilidad de su piel
al agua y a los electrolitos (Loumbardis
et al.
1999,
Berzins y Bundy 2002, Scott
et al.
2006).
La determinación de la bioacumulación de pla-
guicidas en relación con la concentración ambiental
es una herramienta valiosa para la evaluación de la
exposición y de los efectos adversos potenciales de
estos xenobióticos (Sparling
et al.
2000). No obstante
el análisis de los plaguicidas en organismos acuáticos
no es un procedimiento sencillo debido a que los te
-
jidos son matrices muy complejas por la diversidad
de compuestos y sustancias que contienen, muchas
de ellas con la posibilidad de interferir en la determi
-
nación del contaminante. Las técnicas de extracción
para algunos plaguicidas que se han utilizado particu
-
larmente en peces, incluyen extracción por sonicación
con mezcla de solventes (Kim
et al.
2005), extracción
acelerada con solvente (Wu
et al
. 2011) y extracción
asistida con microondas (EAM) (Vetter
et al.
1998,
Weichbrodt
et al.
2000). En la EAM, la aplicación
de energía de microondas ocasiona un calentamiento
selectivo de la matriz sobre el extractante. El aumento
de la temperatura y la presión, altamente localizado,
ocasiona la migración selectiva de los compuestos de
estudio al área circundante, a mayor velocidad y con
una recuperación similar a los métodos de extracción
convencionales (Pare
et al
. 1997). Después de la ex-
tracción se requiere un paso de limpieza para evitar la
interferencia en la detección de los plaguicidas de inte
-
rés. La separación y la detección de los plaguicidas ha
sido comúnmente realizada con cromatografía de gases
y con detectores nitrógeno-fósforo y espectrometría de
masas (Kim
et al.
1998, Vetter
et al.
2000, Giampiero
et al
. 2005). En cualquier caso, el desarrollar y contar
con los métodos óptimos para la detección de los
M. Hernández Quiroz
et al.
192
plaguicidas organofosforados en el medio externo y
en las especies en estudio es un aspecto fundamental
para los estudios toxicológicos, máxime cuando estas
concentraciones se encuentran en niveles muy bajos
que ocasionan efectos subletales. De tal manera el
objetivo del presente estudio fue el desarrollar un
método eFciente de extracción y limpieza para la
determinación de plaguicidas organofosforados en
tejidos del ajolote
Ambystoma mexicanum
.
MATERIALES Y MÉTODOS
Todos los reactivos utilizados fueron de grado
analítico. El material utilizado fue lavado previamente
con ácido nítrico, agua desionizada y acetona y fue
colocado durante 2 h a 100 ºC. Se prepararon disolu-
ciones patrón por gravimetría de cinco plaguicidas or-
ganofosforados, clorpirifos, metil-paratión, diazinon,
etoprofos y malatión (Pestanal®) a una concentración
de 100 mg/L utilizando acetona como disolvente (J.T.
Baker; grado HPLC). A partir de esta solución patrón
se prepararon soluciones individuales de 1 mg/L. El
estándar interno utilizado fue trifenil fosfato (Supel
-
co®) en una concentración de 1 mg/L. Las soluciones
se almacenaron a –50 ºC hasta su utilización.
Los ajolotes crecidos en cautiverio fueron man
-
tenidos libres de plaguicidas en condiciones ideales
de desarrollo (Robles-Mendoza
et al.
2009, Robles-
Mendoza
et al.
2011). Para obtener los tejidos de
ajolote, organismos (etapa 57; juvenil temprano)
fueron sacriFcados y disecados y los tejidos res
-
guardados a –60 ºC para su posterior análisis. Para el
desarrollo del método y su validación, se preparó una
solución de los plaguicidas a partir de los plaguicidas
individuales y con ella se enriquecieron muestras de
músculo de un gramo de tejido húmedo (g PH) para
obtener concentraciones de 25, 75 y 150 mg /kg
PH
de los plaguicidas. Se realizaron tres réplicas para
cada concentración de cada plaguicida. En cada caso
se dejó evaporar el solvente (acetona) a temperatura
ambiente y posteriormente se dejaron reposar las
muestras en la oscuridad a 4
o
C durante 24 horas.
Para los estudios de la aplicación del método,
ajolotes juveniles (etapa 57) fueron expuestos al
plaguicida clorpirifos (CP±) en pruebas de toxici
-
dad con renovación del plaguicida acorde al pro-
cedimiento señalado por Robles
et al
. (2011). Los
juveniles se expusieron a dos tratamientos (0.05
y 0.1 mg CPF/L), donde las concentraciones del
plaguicida se consideraron ambientalmente realis-
tas ya que se han reportado en la zona lacustre de
Xochimilco, hábitat del ajolote (Alcántara, datos no
publicados). El período de exposición al clorpirifos
fue de 48 h, periodo que puede re²ejar el régimen
normal de aplicación del CPF en las actividades
agrícolas de Xochimilco (Robles
et al.
2011). En
cada condición experimental se colocaron cuatro
organismos en acuarios de 20 L con 18 L de las solu-
ciones de ensayo en las concentraciones señaladas.
La cantidad máxima de acetona adicionada en los
acuarios experimentales como solvente acarreador
del plaguicida fue del 0.01% del volumen total (18
L). Durante los ensayos el agua se mantuvo a 20 ±
1 ºC, pH de 8.5±0.2 y oxígeno disuelto a saturación
(> 5.6 mg/L). Al término del periodo de exposición,
los organismos fueron sacriFcados, disecados y los
tejidos resguardados a –60 ºC para su futuro análisis.
Extracción asistida por microondas (EAM)
De manera inicial, se determinó la estabilidad
de extracción de los plaguicidas en el sistema EAM
(MARS 5) y los parámetros de limpieza del extracto
en fase sólida (tipo de adsorbente, volumen de elu
-
yente y tiempo de extracción), se optimizaron a Fn
de minimizar el número de pasos involucrados en
el análisis de los plaguicidas organofosforados bajo
estudio. Con este propósito, a partir de la solución
patrón de cada plaguicida se prepararon soluciones
hijas individuales de 200 mg/L. Se llevó a cabo la
extracción de los plaguicidas en EAM añadiendo
10 mL de diclorometano (DCM; grado HPLC) en
una sola etapa, con una energía máxima de 1200
W. Se deFnieron 10 min de espera hasta llegar a la
temperatura de extracción (110 ºC) que se mantuvo
durante 15 min sin sobrepasar una presión de 200
PSI. Posteriormente se dejó enfriar hasta tempe
-
ratura ambiente para evitar la fuga de analitos. Se
realizaron cinco réplicas por plaguicida. El músculo
de los organismos provenientes tanto del enriqueci
-
miento de los cinco plaguicidas organofosforados
(tres muestras de tejido) como de los estudios de
bioacumulación con organismos completos expues-
tos a concentraciones subletales del CPF en ensayos
de 48 h (cuatro por concentración), fue procesado
de manera similar. En cada caso, las muestras de
músculo y los organismos completos fueron seca
-
dos, pulverizados y homogeneizados con sulfato de
sodio anhidro en una proporción 1:1 (m/m; peso/
peso) con la ayuda de un mortero. Posteriormente
la muestra fue colocada dentro de los vasos de
te²ón del sistema EAM y se adicionó aproximada
-
mente 10 mL de DCM por cada gramo de tejido.
Las condiciones del EAM para la extracción de los
plaguicidas fueron las previamente optimizadas,
de 1200 W durante 15 min a 110 ºC y enfriamiento
DETERMINACIÓN DE PLAGUICIDAS ORGANOFOSFORADOS EN
Ambystoma mexicanum
193
de extracción), fueron optimizados, lo cual permi
-
tió minimizar el número de pasos involucrados en
el análisis de los plaguicidas organofosforados en
estudio. Para realizar las extracciones asistidas por
microondas (EAM) es imprescindible que los analitos
a determinar sean estables tanto a la radiación como
al calentamiento que se suscitan en la EAM. Se ha
reportado que, por ejemplo, el malatión presenta una
cierta inestabilidad térmica en presencia de humedad
(Koivistoinen
et al.
1964); por otro lado la recupera
-
ción del clorpirifos se ha correlacionado inversamente
con la temperatura en la etapa de extracción por EAM
(Bouaid
et al
. 2000) y algunos otros grupos de plagui-
cidas se han degradado a altas temperaturas en la EAM
(Molin
et al.
2000). De esta manera, para determinar
la estabilidad de los plaguicidas bajo las condiciones
previstas de extracción, se irradiaron los plaguicidas
organofosforados clorpirifos, metil-paratión, diazinon,
etoprofos y malatión en una concentración de 200
mg/L bajo las condiciones de extracción en una sola
etapa con DCM como disolvente, con el uso de una
energía máxima de 1200 W. Se deFnieron 10 min de
espera hasta llegar a la temperatura de extracción (110
ºC) que se mantuvo durante 15 min sin sobrepasar una
presión de 200 PSI. Posteriormente se dejó enfriar has
-
ta temperatura ambiente para evitar la fuga de analitos.
Bajo este procedimiento se obtuvieron recuperaciones
promedio de 99% con desviaciones estándar relativas
(DSR) menores a 3 (
Cuadro I
).
Una vez asegurada la estabilidad de los plaguici-
das, el siguiente paso consistió en estudiar las mejores
condiciones para la extracción y limpieza de los pla-
guicidas. Para ello se analizaron los tejidos de ajolote
enriquecidos con los plaguicidas bajo estudio. Las
condiciones de extracción por microondas fueron las
mismas que se utilizaron para establecer la estabilidad
de los plaguicidas. La potencia del magnetrón fue de
1200 W con un tiempo de extracción de 15 min. Cabe
resaltar que un paso importante para evitar la pérdida
CUADRO I.
PORCENTAJES DE RECUPERACIÓN PROME-
DIO (n=3) DE SOLUCIONES DE 200 µg/L DE
PLAGUICIDAS OP IRRADIADOS A 1200 W
DURANTE 15 MIN
Plaguicida
Recuperación, %
Diazinon
Metil-paratión
Corpirifos
Etoprofos
Malatión
100 (1.6)
99 (2.1)
102 (1.4)
100 (3.0)
101 (0.8)
( ) Desviación estándar relativa
posterior hasta temperatura ambiente. Los extractos
se Fltraron en Fltros Whatman® grado 5 y se depo
-
sitaron en matraces bola de fondo plano aptos para
rotavapor. Todos los extractos fueron concentrados
en un rotavapor (Heidolph, Laborota 4011) a 3 mL.
Limpieza de extractos
Para la optimización de esta etapa, la limpieza se
llevó a cabo por el fraccionamiento de los extractos
en columna con diferentes adsorbentes en fase sólida
o cartuchos SPE (extracción en fase sólida por sus
siglas en inglés; 1 g/6 mL; Strata
TM
). Se analizó el
comportamiento de tres adsorbentes: Florisil® (re-
comendado para la separación de plaguicidas), C18
(recomendado para la separación de compuestos
orgánicos no polares) y sílica recomendado para
compuestos polares (USEPA 3630C 1996). A la vez,
se analizaron dos eluyentes: el acetato de etilo y el
acetonitrilo. En esta etapa, se optimizaron además
los volúmenes y el tiempo de elución para obtener la
mejor recuperación de los plaguicidas bajo análisis.
Cuantifcación por cromatograFía de gases
Los plaguicidas en los extractos bajo análisis fue
-
ron detectados y cuantiFcados mediante cromatógrafo
de gases con detector de nitrógeno-fósforo (GC/NPD;
Agilent Technologies 6890N) bajo las siguientes
condiciones: columna HP-5 de 30m × 0.25mm × 0.25
µm; temperatura del inyector = 250 ºC; temperatura
del detector = 300 ºC; el programa del horno = 120 ºC
durante 1 minuto, 5 ºC/min hasta 200 ºC por 2 minutos,
2 ºC/min hasta 205 ºC por 1 minuto hasta 300 ºC por
5 minutos. El tiempo de análisis fue de 35.42 minutos
con un volumen de inyección de 2 mL con automues-
treador y en modo
split-splitless
. Las concentraciones
de los plaguicidas en tejido se expresaron como µg
plaguicida kg/PS.
Validación del método
Para la validación del método implementado se
determinaron los límites de detección, cuantiFcación,
linealidad y exactitud, a su vez se calcularon los
parámetros de precisión: repetibilidad y precisión in-
termedia. Para estos últimos parámetros, se utilizaron
siete repeticiones a una concentración intermedia.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Desarrollo del método
La estabilidad de extracción por EAM y los
parámetros de limpieza del extracto en fase sólida
(tipo de adsorbente, volumen de eluyente y tiempo
M. Hernández Quiroz
et al.
194
5
10
20
30
40
50
Norm.
A
NPD1 A. (250908POF00030D)
a
b
c
d
e
7.5
10
12.5
17.5
20
22.5
25
17
B
NPD1 A. (271008POF00067.D)
a
b
c
d
e
7.
51
01
2.
51
7.
52
02
2.
52
5
17
5
5
7.5
10
12.5
15
17.5
22.5
25
20
Norm.
Fig. 1.
Cromatogramas GC-NPD correspondientes a una muestra de tejido de ajolote fortiFcado con 100 µL de una
solución de 1 mg/L de plaguicidas organofosforados después de la extracción con EAM y limpieza con SPE
utilizando: A) C18-±lorisil® y B) Sílica-±lorisil. a) Etoprofos, b) Diazinón, c) Metil-paratión, d) Malatión
y e) Clorpirifos
de los plaguicidas por evaporación es, como se men-
cionó previamente, dejar enfriar completamente los
vasos del sistema de microondas hasta temperatura
ambiente. Las condiciones determinadas resultaron
efectivas para extraer los plaguicidas de estudio.
El siguiente paso examinado fue la determina
-
ción de un método de limpieza adecuado para los
extractos por microondas de los tejidos. Este paso de
limpieza es absolutamente necesario ya que debido
a las altas presiones y temperaturas que se alcanzan
dentro de los vasos, se extrae simultáneamente con
los plaguicidas diferentes compuestos de los tejidos,
en general lípidos, que interFeren con la detección
de los plaguicidas en estudio (Juhler 1997). El pro-
cedimiento de limpieza es el fraccionamiento del ex
-
tracto en una columna con diferentes adsorbentes en
fase sólida o cartuchos SPE. Estos cartuchos tienen
la ventaja que la cantidad de disolvente necesario
para eluir los analitos de interés es pequeña, por
lo que se evita el consumo de grandes cantidades
de solvente. Para la elución de los plaguicidas con
Florisil® se utilizaron solventes de mediana polari-
dad, en este caso, acetato de etilo y acetonitrilo. De
estos dos solventes, el acetonitrilo mostró mejores
recuperaciones de los plaguicidas que el acetato
de etilo; sin embargo, con el acetonitrilo eluyeron
a la par de los plaguicidas numerosos compuestos
pertenecientes a los tejidos estudiados, enmasca-
rando la detección de los plaguicidas. Por lo que se
decidió estudiar combinaciones de Florisil® con
C18 y Florisil® con sílica para evitar la coelución
de compuestos de la matriz de tejido junto con los
plaguicidas. La combinación de los adsorbentes dio
como resultado una drástica disminución de com-
puestos no deseados en los cromatogramas como
se observa en la
fgura 1
. A pesar de que en ambos
cromatogramas la detección de los plaguicidas es
cuantiFcable, se observó una mayor intensidad de
los picos cromatográFcos con la combinación C18-
±lorisil® , por lo que se decidió continuar con esta
combinación de fases sólidas. La combinación de
distintas fases sólidas también ha demostrado su
eFciencia en otras determinaciones de plaguicidas
en organismos, donde Florisil® igualmente ha de-
mostrado ser muy eFciente en la remoción de ácidos
grasos (Le Doux 2011).
Para obtener la mejor recuperación de todos los
plaguicidas bajo estudio, se continuó con la optimi-
zación de las condiciones de limpieza, para lo cual se
analizaron diversas condiciones de volumen y tiempo
de elución. Los resultados obtenidos de la relación
entre el tiempo de elución y el volumen de elución
se señalan en las
fguras 2
y
3
, respectivamente. Con
respecto al tiempo de elución, generalmente 1 min
de elución no fue suFciente para obtener una recu
-
peración mayor al 70% para todos los plaguicidas.
No obstante, esta recuperación aumentó signiFca
-
tivamente (p < 0.05) cuando el tiempo de elución
se incrementó a 3 ó 5 min si bien no hubo cambios
signiFcativos (p > 0.05) cuando los tiempos de elu
-
ción fueron mayores a 5 min. Para el volumen de
elución, cuatro de los cinco plaguicidas presentaron
valores de recuperación menores al 70% al utilizarse
2 mL del disolvente, a excepción del metil-paratión
que presentó valores de recuperación del 76%. Esta
recuperación se incrementó signiFcativamente (p <
0.05) al aumentar el volumen del disolvente hasta 6
mL, si bien con volúmenes mayores (8 mL) no se
DETERMINACIÓN DE PLAGUICIDAS ORGANOFOSFORADOS EN
Ambystoma mexicanum
195
110
100
90
80
70
60
50
40
01234567
8
Duración de la elución (min)
Recuperación %
9
Etoprofos
Diazinon
Metil-paratión
Malatión
Clorpirifos
Fig. 2
. Efecto del tiempo de elución (min) en la recuperación de los cinco plaguicidas bajo estudio. Los
resultados de las recuperaciones son el promedio de tres mediciones
110
100
90
80
70
60
50
01234567
8
Volumen de solvente de elución (mL)
Recuperación %
9
Etoprofos
Diazinon
Metil-paratión
Malatión
Clorpirifos
Fig. 3.
Efecto del volumen de disolvente (mL) en la recuperación de los cinco plaguicidas bajo estudio.
Los resultados de las recuperaciones son el promedio de tres mediciones
incrementó signiFcativamente la recuperación de
los plaguicidas (p > 0.05). Acorde con los resultados
obtenidos, se deFnieron como parámetros óptimos 5
min de tiempo de elución y 6 mL de disolvente para
obtener recuperaciones de los plaguicidas mayores al
90%. Estas recuperaciones son similares a las reporta-
das por Solé y colaboradores (2000) para plaguicidas
organofosforados en bivalvos, aunque su método
involucra dos pasos en la extracción, mientras que el
presente trabajo involucra un solo paso de limpieza.
Parámetros de validación: exactitud
Con el objeto de evaluar la precisión del método en
cuanto a la recuperación de los plaguicidas, se procedió
a su extracción considerando tres concentraciones:
25, 75 y 150 mg/kg, con tres repeticiones en cada
nivel. Los resultados obtenidos denotan que en las tres
concentraciones, las recuperaciones fueron mayores
al 90% con desviaciones estándar relativas menores
al 10%, demostrando así una buena recuperación de
los plaguicidas con el método utilizado (
Cuadro II
).
Parámetros de validación: límites de detección y
cuantifcación y linealidad
Como parte de los parámetros de validación se
calcularon los límites de detección y cuantiFcación,
los cuales se obtuvieron a partir de la adición al tejido
de ajolote de los plaguicidas a la concentración más
baja estudiada (25 mg/kg). Cabe aclarar que estos
límites de detección y cuantiFcación se determinaron
para todo el método como sugiere la Real Sociedad
Química de Londres (RSOC 1987) y no se reFeren
sólo para el equipo CG-NPD, de esta manera se da un
límite de detección realista en el análisis de muestras
M. Hernández Quiroz
et al.
196
CUADRO II.
PORCENTAJES DE RECUPERACIÓN PROMEDIO
(n=3) DE PLAGUICIDAS EN TEJIDO DE AJOLOTE
ENRIQUECIDO A TRES NIVELES (µg/kg)
Plaguicida
Recuperación, %
25 µg/kg
75 µg/kg
150 µg/kg
Etoprofos
Diazinón
Metil-paratión
Malatión
Clorpirifos
96 (2.4)
98 (4.7)
98 (2.0)
101 (9.4)
96 (1.5)
95 (3.2)
97 (6.0)
97 (1.8)
100 (7.1)
96 (2.0)
94 (6.1)
97 (3.9)
98 (2.7)
100 (5.6)
94 (2.0)
( ) Desviación estándar relativa
CUADRO III.
DATOS DE CALIBRACIÓN Y LÍMITES DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DEL MÉTODO
Plaguicida
tR
(min)
Intervalo de
calibración
(µg/kg)
Ecuación de
la curva
Linealidad
(r
2
)
LD
(µg/kg)
LC
(µg/kg)
Etoprofos
Diazinón
Metil-Paratión
Malatión
Clorpirifos
11.05
14.21
16.14
17.53
17.74
3-250
3-250
3-250
3-250
3-250
Y=0.015X–0.003
Y=0.013X+0.013
Y=0.015X+0.034
Y=0.008X–0.008
Y=0.014X+0.034
0.994
0.998
0.993
0.996
0.998
0.03
0.12
0.27
0.25
0.17
0.12
0.41
0.92
0.86
0.6
tR: tiempo de retención; LD: límite de detección; LC: límite de cuantiFcación
ambientales. El límite de detección (LD) se calculó
como LD = 3 × DS x la concentración promedio (con
la sustracción del blanco cuando fue necesario), donde
DS es la desviación estándar de las mediciones. El
límite de cuantiFcación (LC) se calculó como LC =
3.3 × LD (SANCO 2007).
Los resultados obtenidos señalan que los límites
de detección oscilaron entre 0.03 µg/kg para etopro-
fos hasta 0.27 µg/kg para metil-paratión (
Cuadro
III
). Estos límites de detección y desviaciones
estándar relativas son comparables a los valores
reportados en la literatura para clorpirifos, en tejido
de pescado (You y Lydy 2004) y diez veces menores
que para tejido de ballena (Serrano 1999) y carne
de res (Juhler 1997). Por otra parte, se comprobó
la linealidad del intervalo de las concentraciones
de los plaguicidas bajo estudio (3 a 250 mg/kg) a
partir del coeFciente de correlación de las curvas
de calibración (r
2
) cuyos valores fueron mayores a
0.99 (p < 0.05).
Parámetros de validación: repetibilidad y pre
-
cisión intermedia
Las mediciones de repetibilidad y precisión in-
termedia (reproducibilidad) se realizaron evaluando
siete repeticiones (RSOC 1987) de los extractos de
los estándares de plaguicidas obtenidos con el mé-
todo descrito anteriormente a lo largo de un solo día
(RSOC 1987, Horwitz y Albert 2006 ) y diariamente
a lo largo de 15 días, utlizando la concentración de
50 µg/kg para todos los plaguicidas, concentración
considerada baja pero pero no cercana al límite de
detección obtenido.
La repetibilidad, que es la medida de las deter
-
minaciones llevadas a cabo por un solo operador en
un mismo instrumento en un periodo corto (en un
día), se estableció a partir de los valores de la des-
viación estándar relativa (DSR) de las mediciones.
En el presente estudio, la DSR obtenida para cada
plaguicida fue menor al 10%, indicando así una buena
repetibilidad (
Cuadro IV
).
Por otro lado, la reproducibilidad o precisión
intermedia, que es la medida de la variabilidad de
la medición a largo plazo en un mismo laboratorio
que toma en consideración las variaciones por el
mismo operador, diferentes operadores, diferen
-
tes instrumentos, diferentes lotes de reactivos,
estándares, etc., es la más importante medida de
precisión (RSOC 1987). En el presente estudio, los
resultados obtenidos demuestran que la DSR de la
reproducibilidad, no fue mayor al 10%, indicando
una buena precisión intermedia (
Cuadro IV
). Una
medida adicional de la calidad de las repeticiones en
un método analítico, es el índice HorRat (Horwitz y
Albert 2006). Este índice se calcula como HorRat =
DSR/PRSD donde PRSD es la desviación estándar
DETERMINACIÓN DE PLAGUICIDAS ORGANOFOSFORADOS EN
Ambystoma mexicanum
197
CUADRO IV.
VALORES DE DESVIACIÓN ESTÁNDAR RELATIVA, DESVIACIÓN ESTÁNDAR E ÍNDICE
HorRat PARA LA EVALUACIÓN DE REPETIBILIDAD Y PRECISIÓN INTERMEDIA EN LA
EXTRACCIÓN DE CINCO PLAGUICIDAS FORTIFICADOS EN TEJIDO DE AJOLOTE
Plaguicida
Ca
DSR
del día
DSR
entre días
DE
del día
DE
entre días
DE
Total
DSR Total
[%]
PRSD
Índice
HorRat
Etoprofos
48.8
4.7
8.5
2.3
4.1
4.5
9.2
24.99
0.37
Diazinón
47.7
3.5
9.1
1.7
4.4
4.9
10.3
25.07
0.41
Metil-paratión
50.1
6.7
7.2
3.4
3.6
5.3
10.5
24.89
0.42
Malatión
48.6
5.2
7.6
2.5
3.7
4.6
9.6
25.00
0.38
Clorpirifos
49.9
4.0
8.1
2.0
4.0
5.1
10.3
24.91
0.41
Ca: concentración en µg/kg; DSR: desviación estándar relativa; DE: desviación estándar; PRSD: desviación estándar
predicha (por sus siglas en inglés); (n=7).
Fig. 4.
Cromatograma CG-NPD correspondiente a la extracción del clorpirifos
con el método estudiado en ajolote expuesto a una concentración de 0.1
mg CPF/L (dilución 1:20)
5
10
20
30
40
50
60
Norm.
NPD1 A. (271006POF002DE.D)
7.5
10
12.5
17.5
20
22.5
25
mh
16
predicha (por sus siglas en inglés) calculada como
2C
–0.15
, donde C es la concentración de estudio ex-
presada en m/m (masa/masa) (en este caso 50 µg/
kg para cada uno de los plaguicidas) y donde DSR
se calcula de la desviación estándar del día y la des-
viación estándar entre los días de análisis (la repeti-
bilidad y la precisión intermedia) usando el análisis
de varianza de un solo factor. Valores del índice
HorRat igual a uno muestran una correspondencia
entre el valor predicho y el obtenido, mientras que
valores menores a uno y especíFcamente debajo de
0.5, describen precisiones mayores a las esperadas;
valores mayores a 1 y especíFcamente arriba de 2,
indican precisiones no aceptables (Horwitz y Albert
2006). De acuerdo con los resultados obtenidos en
este estudio, el índice HorRat para todos los plagui-
cidas varió entre 0.4 y 0.47 indicando así una buena
exactitud del método (
Cuadro IV
).
Aplicación del método: estudio de bioacumulación
Una vez validado el método de análisis de los
plaguicidas bajo estudio se procedió a analizar la
concentración de clorpirifos (CP±) en músculo de
ajolote en organismos expuestos a concentraciones
subletales del plaguicida (0.05 y 0.1 mg CPF/L).
En el cromatograma obtenido de la determinación
del clorpirifos en el músculo del ajolote (
Fig. 4
) se
observó una señal deFnida correspondiente al clor
-
pirifos, sin interferencias con ningún otro compuesto
proveniente de los tejidos del ajolote. De esta manera,
con el método propuesto se determinaron las concen-
traciones de clorpirifos en ocho ajolotes sometidos
a la exposición del clorpirifos y cuatro testigos
(blancos) cuya bioacumulación de clorpirifos estuvo
debajo del límite de detección (no mostrado). Debido
al poco tejido que se obtiene de los ajolotes, no es
posible obtener repeticiones de la medición para cada
ajolote, pero cada nivel de exposición tiene cuatro
ajolotes que nos da la bioacumulación promedio de
clorpirifos en el ajolote para cada nivel de exposición
(
Cuadro V
). Los resultados obtenidos denotaron una
mayor bioacumulación del plaguicida al aumentar
M. Hernández Quiroz
et al.
198
CUADRO V.
BIOACUMULACIÓN DE CLORPIRIFOS (mg CPF/kg PS) EN EL TEJIDO DE AJOLOTE EXPUESTO A
DOS NIVELES DEL PLAGUICIDA POR 48 h
Concentración de exposición
0.05 mg/L
Concentración de exposición
0.1 mg/L
Ajolote
Ajolote
1
2
3
4
Promedio
1
2
3
4
Promedio
0.14
0.05
0.20
0.09
0.12±0.06
1.56
1.06
0.59
1.16
1.09±0.2
la concentración de exposición y demuestran clara-
mente que aún bajo concentraciones subletales de
exposición (consideradas bajas), el método desa-
rrollado permite cuantifcar la bioacumulación del
plaguicida en el ajolote. De esta manera, el método
desarrollado se utilizó exitosamente en el estudio
de Robles y colaboradores (2011) para determinar
el eFecto de la exposición subletal del clorpiriFos
y su bioacumulación sobre la actividad enzimática
de esterasas y la actividad motora en juveniles tem-
pranos de
Ambystoma mexicanum
. Asimismo, el
método desarrollado puede ser aplicado para estudios
ambientales y ecotoxicológicos que evalúen el im
-
pacto de los plaguicidas analizados en condiciones
ambientalmente realistas, tanto en anfbios como en
otras especies de organismos.
CONCLUSIONES
El presente estudio demostró que el método
desarrollado tiene valores de los parámetros de
validación adecuados para la identifcación de los
plaguicidas organoFosForados etoproFos, diazinón,
metil-paratión, malatión y clorpiriFos en anfbios,
y de manera particular en ajolote. Se demostró que
la extracción asistida por microondas (EAM) con
DCM durante 15 min a una potencia de 1200 W, es
un método de extracción adecuado, simple y efcaz
que evita la pérdida de los analitos al extraerlos en
un solo paso y en un sistema cerrado. La limpieza
del extracto con cartuchos con C18-Florisil® logró
recuperaciones arriba del 90% para todos los pla-
guicidas organoFosForados estudiados. El método
permite la determinación de los plaguicidas en un
intervalo de concentraciones de 3 a 250 µg/kg con
límites de detección de hasta 0.03 µg/kg. El índice
HorRat demostró que la precisión intermedia del
método es buena. El método desarrollado pudo ser
utilizado con éxito en la evaluación de la bioacu-
mulación de clorpiriFos (CP²) en ajolotes expuestos
a niveles subletales del plaguicida (0.05 y 0.1 mg
CPF/kg).
AGRADECIMIENTOS
Agradecemos al Proyecto PAPIME, DGAPA,
UNAM 206210.
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