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Red de Revistas Científicas de América Latina y el Caribe, España y Portugal
Rev. Int. Contam. Ambie. 29 (Número especial sobre plaguicidas) 105-119
MICROORGANISMOS, ENZIMAS, PLÁSMIDOS Y GENES INVOLUCRADOS EN LA
DEGRADACIÓN DE PLAGUICIDAS N-METILCARBAMATOS
José CASTELLANOS ROZO
1
* y Leidy Yanira RACHE CARDENAL
2
1
Laboratorio de Microbiología, Departamento de Biología y Microbiología, Universidad de Boyacá, Campus
Universitario Tunja-Colombia: Carrera 2ª Este No. 64-169
2
Laboratorio de Biología molecular, Departamento de Biología y Microbiología, Universidad de Boyacá,
Campus Universitario Tunja-Colombia: Carrera 2ª Este No. 64-169
*Autor responsable: joscastellanos@uniboyaca.edu.co
(Recibido marzo 2013, aceptado mayo 2013)
Palabras clave: biorremediación, toxicidad, bacterias, rutas catabólicas, mecanismos moleculares
RESUMEN
Los plaguicidas N-metilcarbamatos, son muy utilizados a nivel mundial para controlar
insectos, ácaros, nemátodos, hongos y malezas en diferentes cultivos. Son altamente
tóxicos para humanos y animales, persisten en el ambiente y tienen movilidad signif
-
cativa en suelos. Una posible alternativa para mitigar los efectos provocados por estos
plaguicidas, es la biorremediación, que puede ser mediada por microorganismos capaces
de degradar moléculas tóxicas y altamente complejas a moléculas menos complejas, no
tóxicas y que pueden ser utilizadas por otros organismos. En esta revisión, se pretende
hacer un análisis detallado acerca de los microorganismos biorremediadores de plagui-
cidas N-metilcarbamatos, puesto que se ha encontrado una gran diversidad de especies
con rutas catabólicas de degradación diferentes; además, se analizarán las enzimas
carbamato hidrolasas, que actúan sobre un amplio rango de sustratos, bajo distintas
condiciones y los diversos mecanismos moleculares (plásmidos y genes) involucrados
en los procesos de biodegradación de plaguicidas. La información recopilada es útil
para entender los mecanismos que han desarrollado los microorganismos para degradar
los plaguicidas N-metilcarbamatos.
Key words: bioremediation, toxicity, bacteria, catabolic pathway, molecular mechanisms.
ABSTRACT
N-methylcarbamates are widely used worldwide to control insects, mites, nematodes,
fungi and weeds in different crops. These are highly toxic to humans and animals,
persist in the environment and have signifcant mobility in soils. Biorremediation is a
possible alternative to mitigate the effects caused by these pesticides, which may be
mediated by microorganisms capable of degrading toxic and highly complex molecules,
in less complex molecules, non-toxic and that can be used by other organisms. In this
review, we performed a detailed analysis of N-methylcarbamate pesticides degrading
microorganisms, since a great diversity of species with different catabolic pathways of
degradation have been found; also, we analyzed carbamate hydrolase enzymes, which
act on a wide range of substrates, under different conditions and different molecular
Septiembre 2013
J. Castellanos Rozo y L.Y. Rache Cardenal
106
INTRODUCCIÓN
Los N-metilcarbamatos son compuestos orgánicos
derivados del ácido carbámico, utilizados ampliamente
como insecticidas, fungicidas, acaricidas y nemati-
cidas (Castillo
et al
. 2003, Chelinho
et al
. 2011). La
actividad común de estos plaguicidas es inhibir de
forma reversible la acetilcolinesterasa, lo cual causa
espasmos y parálisis en insectos y mamíferos (Bretaud
et al.
2000, Jiandong
et al
. 2007, Dong
et al
. 2012).
Entre los N-metilcarbamatos más utilizados se
encuentran: carbofuran (2,2-dimetil-2,3-dihidro-
1-benzofuran-7-il metilcarbamato), carbaril (1-naf-
til metilcarbamato), aldicarb (2-metil-2-(metiltio)
propanal O-(N-metilcarbamoil) oxima) (No-
gueira
et al
. 2003, Naqvi
et al
. 2009, Dong
et al
.
2012), fenoxicarb (etil N-(2-(4-fenoxifenoxi)etil)
carbamato), fenobucarb ((2-Butan-2-ilfenil) N-
metilcarbamato) (Dong
et al
. 2012), metomil (S-
metil-N-(metilcarbamoil-oxi)-tioacetimidato), piri-
micard ((2-dimetilamino-5,6-dimetilpirimidin-4-il)
dimetilcarbamato), carbosulfan (2,3-dihidro-2,2-
dimetilbenzofuran-7-il (dibutilaminotio) metilcar-
bamato), oxamil (N,N-dimetil-2-metilcarbamoil
oximino-2-(metilito) acetamida) (Nogueira
et al
.
2003), bendiocarb (2,2-dimetil-1,3 -benzodioxol-
4-il-metilcarbamato) y propoxur (2-isopropoxifenil
N-metilcarbamato) (Topp
et al
. 1993). Su alta to-
xicidad en animales y seres humanos, signifcativa
movilidad en suelos y las malas prácticas de manejo
asociadas entre otras a la sobredosifcación, pueden
generar posible riesgo para la salud pública, pro-
duciendo enfermedades como cáncer de pulmón
(Bonner
et al
. 2005) y problemas reproductivos
(Goad
et al
. 2004).
Una de las estrategias actuales empleadas para
mitigar los efectos que tienen los plaguicidas es la
biorremediación, la cual puede ser defnida como
el uso de organismos vivos, componentes celulares
y enzimas libres, con el fn de realizar una trans
-
formación parcial o mineralización de compuestos
xenóbióticos (Megharaj
et al
. 2011).
El potencial de la biorremediación, a diferencia
de los métodos fsicoquímicos, reside en que es una
estrategia de bajo costo, bajo mantenimiento, ami-
gable con el ambiente y fácilmente aplicable
in situ
(Megharaj
et al
. 2011).
Estudios a nivel mundial han determinado que los
microorganismos son los principales responsables de
la degradación de compuestos plaguicidas (Parekh
et al.
1994). Esto se debe al uso extenso de estos
compuestos en suelos agrícolas, lo cual ha inducido
mecanismos de adaptación genética en los microor-
ganismos, que ha conllevado a la síntesis de enzimas
que oxidan, hidrolizan e hidroxilan los plaguicidas,
permitiendo su utilización como única fuente de
carbono, nitrógeno, azufre o fósforo, facilitando
la eliminación de la toxicidad del compuesto por
actividad cometabólica o mineralización completa
(Desaint
et al.
2000, Grenni
et al.
2012).
El objetivo de este trabajo es realizar una revisión
sobre los diversos microorganismos degradadores
de plaguicidas N-metilcarbamatos, las rutas de de-
gradación, las enzimas y los genes involucrados en
este proceso.
I. DIVERSIDAD DE MICROORGANISMOS
DEGRADADORES DE PLAGUICIDAS
N-METILCARBAMATOS
Se ha descrito gran diversidad de microorganis-
mos capaces de degradar plaguicidas N-metilcarba-
matos. Entre ellos están bacterias Gram negativas
como
Rhizobium
sp. (Hashimoto
et al.
2002),
Sphin-
gomonas
sp. (Feng
et al
. 1997, Park
et al
. 2006; Wu
et al.
2006, Xu
et al
. 2011),
Novosphingobium
sp.
(Yan
et al.
2007)
Paracoccus
sp. (Xu
et al
. 2009),
Sphingobium
sp. (Sipilä
et al
. 2010)
Bosea
spp.
(Dong
et al
. 2012),
Pseudomonas
sp. (Slaoui
et al
.
2001, Bano y Musarrat 2004),
Burkholderia
sp.
(Plangklang y Reungsang 2011, 2012) y bacterias que
pertenecen al grupo heterogéneo de los metilótrofos
facultativos como
Aminobacter ciceronei
nov. ER2
(Topp
et al.
1993, McDonald
et al.
2005).
Chauldry y Ali (1988), fueron los primeros en
aislar microorganismos de suelos con historia de
aplicación de carbofuran, todos correspondieron a
bacilos Gram negativos solos o en cadenas cortas,
oxidasa y catalasa positivos, pertenecientes a los
géneros
Flavobacterium
sp. o
Pseudomonas
sp.
Posteriormente Parekh
et al.
(1994), obtuvieron
68 aislamientos de suelos con diferente historia de
aplicación de carbofuran, que también fueron bacilos
mechanisms (plasmids and genes) involved in pesticide biodegradation processes. The
information collected is useful for understanding mechanisms that have developed
microorganisms to degrade N-methylcarbamate pesticides.
MICROORGANISMOS Y DEGRADACIÓN DE PLAGUICIDAS N-METILCARBAMATOS
107
aerobios Gram negativos, la mayoría oxidasa y cata-
lasa positivos. Todos los aislamientos de este estudio
hidrolizaron carbofuran a carbofuran 7-fenol sin uti-
lizar este último compuesto como fuente de carbono.
De otro lado, se han aislado especies Gram positi-
vas como
Micrococcus
sp. (Hanumanthanaik y Hari-
chandra 2001),
Rhodococcus
sp. y
Microbacterium
sp.
(Dong
et al
. 2012) y otros aislamientos ambientales
con características fsiológicas y químicas, que a me
-
nudo no coinciden con especies previamente descritas
y en algunos casos con ningún género, siendo estos
microorganismos mal identifcados o no identifcados
(Parekh
et al
. 1995).
Además de ello, se ha comprobado la existencia de
microorganismos no cultivables capaces de degradar
N-metilcarbamatos en suelos con historia de aplica-
ción de estos compuestos (Desaint
et al.
2000) y un
alto grado de diversidad genética (Karpouzas
et al
.
2000). Desaint y colaboradores (2000), observaron
mediante análisis de restricción del gen 16S ADNr
amplifcado (ARDRA) y por análisis enzimático de
restricción de la región espaciadora del 16S-23S
ADNr (IGS), la diversidad genética de 128 bacterias
degradadoras de carbofuran en suelos franceses e
ingleses. Los aislamientos fueron distribuidos en 26
grupos ARDRA y 45 tipos IGS, revelando de igual
manera un alto nivel de diversidad microbiana.
Estudios realizados por Dong
et al.
(2012) me-
diante secuenciación del 16S ADNr y amplifcación
de elementos palindrómicos extragénicos repetitivos
a través de reacción en cadena de la polimerasa (REP-
PCR), revelaron que 37 aislamientos bacterianos de
diferentes suelos de Corea, capaces de degradar car-
bofuran al utilizarlo como única fuente de carbono,
presentaron patrones idénticos de ADN cromosómico
conformando 15 grupos REP-PCR. Concluyeron
que los aislamientos bacterianos dentro de cada
grupo están estrechamente relacionados con
Sphin-
gomonas
sp.
y
Sphingobium
sp. Los aislamientos
de este estudio Fueron clasifcados en cuatro grupos
de acuerdo con las características de crecimiento
y degradación, comprobando que todos utilizaron
carbofuran y carbaril como única fuente de carbono
y energía. Entre los aislamientos la cepa SS1 fue
capaz de degradar todos los plaguicidas evaluados,
carbofuran, carbofuran 7-fenol, aldicarb, fenoxicarb,
propoxur, carbaril, 4-nitrofenil acetato, mientras las
cepas MW3 y TA5, sólo degradaron carbofuran y
carbaril (Dong
et al.
2012).
Por otro lado, se han reportado diversos hongos
degradadores de plaguicidas N-metilcarbamatos como
Mucor ramanianus
(Seo
et al
. 2007),
Aspergillus niger
(Qing y Yang 2003),
Gliocladium sp
. (Slaoui
et al
.
2007), levaduras como
Pichia anomala
cepa HQ-C-
01, capaces de degradar carbofuran como única fuente
de carbono y/o de nitrógeno (Yang
et al
. 2011).
También se ha evaluado la degradación cruzada por
hongos de plaguicidas del grupo N-metilcarbamatos
como carbofuran y otro grupo de plaguicidas no rela-
cionados como fenamifos y cadusafos, pertenecientes
al grupo de los organofosforados (Slaoui
et al
. 2007).
Se han reportado consorcios de hongos y bacterias
capaces de ejercer degradación cruzada de plaguici-
das no relacionados químicamente como aldicard,
atrazina y alaclor (Hai
et al
. 2011).
II. RUTAS CATABÓLICAS DE
DEGRADACIÓN MICROBIANA DE LOS
PLAGUICIDAS N-METILCARBAMATOS
La utilización de técnicas como cromatografía
líquida de alta efciencia con Fase reversa acoplada a
espectrofotometría de masas (RP-HPLC/MS) (Dong
et al
. 2012), cromatografía de gases acoplada a espec-
trofotometría de masas (GC/MS) (Yang
et al
. 2011)
y resonancia magnética nuclear (RMN) (Park
et al
.
2006), han permitido identifcar diFerentes rutas de
degradación que emplean los microorganismos para
la degradación de los plaguicidas N-metilcarbamatos.
Se han propuesto dos rutas principales de de-
gradación bacteriana de los N-metilcarbamatos, la
vía oxidante y la hidrolítica. Sin embargo, se ha
comprobado que la degradación por la vía oxidante
de los N-metilcarbamatos, produce metabolitos que
son más tóxicos que el mismo compuesto parental
(Mateen
et al
. 2002).
De otro lado, se ha reportado ampliamente que la
hidrólisis enzimática del enlace N-metilcarbamato
es el mecanismo primario de inactivación de estos
plaguicidas carbamatos en suelos previamente trata-
dos (
Fig. 1a
, Chaudhry y Ali 1988). La hidrólisis del
enlace carbamato podría ocurrir por cualquiera de las
dos vías, por rompimiento del enlace éster (el grupo
carbonilo del ácido N-metilcarbámico unido al fenol),
o por rompimiento del enlace amida. En ambos casos,
tanto con la amidasa o con la esterasa, el producto de
la hidrólisis es idéntico por la inestabilidad del enlace
del ácido N-metilcarbamato, produciendo carbofuran
7-fenol (2,3-dihidro-2,2-dimetil-7-benzofuranol),
metabolito menos tóxico que el carbofuran, y me-
tilamina, la cual actúa como fuente de carbono y/o
de nitrógeno para un grupo diverso de bacterias que
hidrolizan carbofuran en suelos previamente tratados
(Topp
et al
. 1993, Feng
et al
. 1997, Kim
et al
. 2004,
Yan
et al
. 2007, Dong
et al
. 2012).
J. Castellanos Rozo y L.Y. Rache Cardenal
108
Fig. 1.
Rutas metabólicas empleadas por los microorganismos para la degradación de carbofuran
a).
Ruta propuesta por Chaudhry
y Ali (1988).
b).
Ruta propuesta por Mateen
et al
. (2002) para
Pseudomonas
sp. 50432.
c).
Ruta propuesta por Park
et al.
(2006) para
Sphingomonas
sp. SB5.
d).
Ruta propuesta por Yan
et al
. (2007) para
Novosphingobium
sp. FND-3
e).
Ruta
propuesta por Behki
et al
. (1994) para
Rhodococcus
sp.TE1. Fuente autores.
OCONHCH
3
OCONHCH
3
CH
3
CH
3
7
6
5
OH
5-hidroxicarbofuran
4-hidroxicarbofuran
Metilamina
Carbofuran
Carbofuran 7-fenol
3-(2-Hidroxi-2-metilpropil)benceno-1,2-diol
M-1
M-1
2-hidroxi-3-(3-metilpropan-2-ol) benceno N-metilcarbamato
(e).
(a).
(c).
++
(d).
(b).
4
3
2
1
O
CH
3
CH
3
7
6
5
4
3
2
1
O
OH
CH
3
NHCH
3
CH
3
7
6
5
4
3
2
1
O
O
CH
3
CH
3
7
6
5
4
3
2
1
O
OCONHCH
3
CH
3
OH
C
CH
3
5
4
3
6
1
2
OH
OCONHCH
3
CH
3
Metabolitos desconocidos
CO
2
CO
2
CH
3
7
6
5
43
2
1
O
OH
OH
CH
3
OH
C
CH
3
5
4
3
6
1
2
OH
O
O
O
O
O
O
OH
O
CH
3
CH
3
CH
3
H
3
C
H
3
C
H
3
C
7
6
5
4
4
8a
8
7
4a
3
3
Metabolito rojo
5-(2-hidroxi-2-metil-propil)-2,2-dimetil-2,3-dihidrofnato[2,3-6 furan-4,6,7,9-tetrona
3a
9a
2
2
9
5
6
1
1
O
MICROORGANISMOS Y DEGRADACIÓN DE PLAGUICIDAS N-METILCARBAMATOS
109
De acuerdo con la forma de utilización del car-
bofuran (carbono y/o nitrógeno) y al mecanismo de
degradación que emplean las bacterias (oxidante
y/o hidrolítico), se han reportado diferentes grupos
bacterianos degradadores. Chauldry y Ali (1988)
reportaron tres grupos microbianos que degradaban
carbofuran de distinta manera. El grupo I correspon-
dió a seis aislamientos bacterianos que fueron capa-
ces de hidrolizar el carbofuran a carbofuran 7-fenol
y metilamina, utilizando esta última como única
fuente de nitrógeno. El grupo II correspondió a siete
bacterias que hidrolizaron carbofuran a carbofuran
7-fenol y metilamina usando esta última como única
fuente de carbono (
Fig. 1a
). El grupo III correspon-
dió a dos aislamientos bacterianos, caracterizados
como
Pseudomonas
sp. los cuales mineralizaron
rápidamente el anillo aromático del carbofuran como
fuente de carbono para su crecimiento. Subsiguientes
pruebas determinaron que eran incapaces de crecer
a partir de carbofuran 7-fenol y metilamina como
única fuente de carbono y nitrógeno respectivamente,
lo cual sugirió que podrían degradar carbofuran por
vía oxidante (
Fig. 1b
).
Experimentos posteriores determinaron que
Pseu-
domonas
sp. 50432, posee ambos mecanismos de
degradación de carbofuran (oxidante e hidrolítico),
concluyendo que el mecanismo oxidante, dado por
una enzima hidroxilasa, es de carácter inducible y
convierte el carbofuran en un metabolito identiFcado
como 4-hidroxicarbofuran, que a su vez es degradado
a otros metabolitos aún no conocidos, hasta alcanzar
la mineralización completa (
Fig. 1b
, Mateen
et al
.
2002).
No obstante, son pocos los estudios que describen
bacterias involucradas en la degradación completa
de la estructura del anillo aromático del carbofuran.
Aislamientos bacterianos obtenidos por Parekh
y colaboradores en 1995, de suelos con diferente
historial de tratamiento con N-metilcarbamatos,
fueron caracterizados por 125 pruebas fenotípicas
y por patrones de R±LP (polimorFsmo de longitud
de fragmentos de restricción) del ADN total. Estos
aislamientos fueron capaces de hidrolizar carbofuran,
suplementado como única fuente de carbono y nitró-
geno a carbofuran 7-fenol y metilamina. También
fueron capaces de hidrolizar carbaril y aldicard, no
obstante ninguno pudo metabolizar el anillo aromá-
tico de estos compuestos (
Fig. 1a
).
De otro lado, una bacteria Gram negativa aislada
de un suelo agrícola en Canadá, que presenta degra-
dación acelerada de plaguicidas, creció en carbofuran
como fuente de carbono y nitrógeno, con un tiempo de
duplicación de tres horas, en medio mínimo de sales
minerales, sin metabolizar el anillo aromático. Esta
bacteria denominada ER2, fue capaz de hidrolizar
otros N-metilcarbamatos como carbaril, bendiocarb
y propoxur, acumulando de igual manera el respec-
tivo fenol. ER2 presentó características fenotípicas
y algunas genotípicas similares a
Achromobacter
sp.
cepa WM111, descrita por Karns y Tomasek en 1991
(Topp
et al
. 1993). Se determinó que estas dos cepas
a pesar de ser aisladas de zonas geográFcamente
distintas, poseen un perFl plasmídico similar. Ambas
bacterias poseen el gen
mcd
, que codiFca la enzima
carbofuran hidrolasa, en plásmidos de igual tamaño
(Topp
et al.
1993). Sin embargo, el análisis Flogené
-
tico basado en la secuencia del gen 16S ARNr, indicó
que la cepa ER2, está estrechamente relacionada a
metilótrofos de la vía serina. El análisis de las carac-
terísticas morfológicas, Fsiológicas, composición de
ácidos grasos y caracterización Flogenética, basada
en los registros de la secuencia del gen 16S ARNr y
la hibrización ADN-ADN, determinaron que la cepa
metilotróFca ER2 pertenece a una nueva especie de
-
nominada
Aminobacter ciceronei
sp. nov. cepa tipo
ER2 (McDonald
et al.
2005).
Por otro lado se han reportado
Sphingomonas
sp. degradadoras de plaguicidas.
El gran interés por
estas bacterias
se debe a su extraordinaria versati-
lidad metabólica, principalmente a la capacidad de
degradar un amplio rango de compuestos aromáticos,
diferentes herbicidas y plaguicidas, compuestos xe-
nobióticos y naturales (Basta
et al
. 2005, Stolz 2009).
Ogram
et al
. (2000) aislaron de suelos de Wash-
ington, 55 microorganismos que pudieron utilizar
el carbofuran como única fuente de carbono y/o
de nitrógeno. Estudios realizados con carbofuran
radiomarcado en la cadena lateral y en el anillo
aromático, determinaron que todos los aislamientos
fueron capaces de mineralizar la cadena lateral del
carbofuran, pero solo dos pudieron mineralizar el
anillo aromático. Una de esas bacterias fue la cepa
CF06, un bacilo Gram negativo perteneciente al
género
Sphingomonas
sp., miembro del grupo ά
proteobacteria, degrada el anillo aromático del car-
bofuran, el carbaril, gentisato, ácido procatecuico
y metilamina como única fuente de carbono y de
energía. Sin embargo, se determinó que no puede
utilizar tolueno, benzofuran, dibenzofuran ni 2,4-di-
clorofenoxiacetato (Feng
et al
. 1997). No obstante, se
ha reportado la cepa
S. yanoikuyae
B1, que degrada
compuestos BTEX (benceno, tolueno, etilbenceno
y xileno) y poliaromáticos, aunque no degrada aro-
máticos clorinados o herbicidas (Romine
et al
. 1999,
Kim y Zylstra 1999, en Stolz 2009). Sin embargo,
S.
herbicidovorans
MH, puede degradar varios herbi-
J. Castellanos Rozo y L.Y. Rache Cardenal
110
cidas, pero no poliaromáticos o componentes BTEX
(Kohler 1999). También se han aislado las cepas
Sphingomonas
sp. KS14,
S. paucimobilis
TNE12 y
S. xenophaga
BN6, que degradan compuestos aro-
máticos policíclicos como el fenantreno, naftaleno,
fuoranteno y naFtalensulFonato.
Estudios posteriores hechos en Corea, aislaron
de suelos agrícolas expuestos a carbofuran durante
cinco años,
Sphingomonas
sp., capaces de crecer
en carbofuran como única fuente de carbono y ni-
trógeno (Kim
et al
. 2004).
Sphingomonas
sp. SB5,
fue seleccionada por su capacidad de hidrolizar 0.91
milimolar (mM) de carbofuran a carbofuran 7-fenol
y metilamina, en un tiempo de 12 horas e hidrolizar
a su vez carbofuran 7-fenol a un producto metabólico
denominado 2-hidroxi-3-(3-metilpropan-2-ol) fenol,
por adición de una molécula de agua al enlace éter del
anillo furanil, en un tiempo de 48 horas. Metabolitos
rojos resultantes del 2-hidroxi-3-(3-metilpropan-2-ol)
fenol, fueron observados y posteriormente caracte-
rizados por espectrofotometría de masas y análisis
RMN (
1
H,
13
C). Los resultados sugirieron que el
metabolito rojo es 5-(2-hidroxi-2-metil-propil)-2,2-
dimetil-2,3 dihidronafto [2,3-6]furan-4,6,7,9-tetrona,
el cual se forma como producto de la condensación de
algunos metabolitos provenientes de la degradación
del 2-hidroxi-3-(3-metilpropan-2-ol) fenol (
Fig. 1c
,
Park
et al
. 2006).
Se han reportado otros aislamientos capaces de
hidrolizar carbofuran 7-fenol y producir metabolitos
rojos (Dong
et al
. 2012, Yan
et al.
2007, Xu
et al
.
2011).
Sphingomonas
sp. CDS-1 ha sido descrita
por ser oxidasa, catalasa y Voges Proskauer positivo,
fermentar la glucosa, la xilosa, la fructosa, la 3-ceto-
lactosa e incapaz de hidrolizar el almidón, la gelatina
y reducir nitratos. Las pruebas para L-fenilalanina y
rojo de metilo también fueron negativas (Xu
et al
.
2011). Los análisis de homología de secuencia del
16S ADNr demostraron 99 % de similitud con la
cepa degradadora de carbofuran
Sphingomonas
sp.
CF06 descrita por Feng y colaboradores (1997). Estas
bacterias fueron capaces de hidrolizar el carbofuran
a carbofuran 7-fenol en 48 horas, en medio mínimo
de sales minerales, a una concentración de 100 ppm,
pH 7 y 180 rpm. También se observaron metabolitos
rojos para estas cepas creciendo en carbofuran y en
carbofuran 7-fenol como única fuente de carbono. Se
identi±có por análisis GC/MS el producto hidrolítico
de la degradación del carbofuran 7-fenol denomina-
do 2-hidroxi-3-(3-metilpropan-2-ol) fenol, en tales
bacterias, sugiriendo que poseen la misma ruta de
degradación de carbofuran descrita para
Sphingo-
monas
sp. SB5 (
Fig. 1
).
Por otra parte,
Novosphingobium
sp. cepa FND-
3 degradadora de carbofuran, descrita como bacilo
corto Gram negativo, con dimensiones de 1.5–2.0 x
0.6–1.0 µm sin fagelo, oxidasa positiva, nitrato re
-
ductasa positiva, Voges Proskauer positiva, hidrólisis
de almidón negativa, producción de L-fenilalanina
negativa y rojo de metilo negativa, fue aislada por
la técnica de cultivo enriquecido, de lodos de un
sistema de tratamiento de aguas residuales en una
compañía manufacturera de plaguicidas en China
(Yan
et al.
2007).
Novosphingobium
sp. cepa FND-
3, además de hidrolizar el enlace éster para formar
carbofuran 7-fenol y metilamina y posteriormente
producir 2-hidroxi-3-(3-metilpropan-2-ol) fenol,
también posee la capacidad de hidrolizar el enlace
éter produciendo 2-hidroxi-3-(3-metilpropan-2-ol)
benceno N-metilcarbamato (
Fig. 1d
) e hidroxilar el
anillo bencénico del carbofuran, constituyendo el
metabolito 5-hidroxicarbofuran como se ha descrito
para otras bacterias como
Rhodococcus
sp. TEI
(
Fig. 1e
) (Behki
et al
. 1994). Ello indica que los
microorganismos no solo adquieren un mecanismo
único de degradación sino que tienen la capacidad
de degradar un mismo compuesto utilizando varias
rutas metabólicas.
Yan
et al
. (2007) secuenciaron el gen 16S ARNr
de
Novosphingobium
sp. cepa FND-3. La secuencia
del gen fue comparada con secuencias disponibles
en el GenBank demostrando 99.4 % de similitud
con
Novosphingobium subarcticum
KF1 (X94102)
degradadora de clorofenol, 97 % con
Sphingomonas
sp. SB5 (Kim
et al.
2004) y 93 % de semejanza con
Sphingomonas
sp. CF06 (Feng
et al
. 1997).
III. ENZIMAS MICROBIANAS
INVOLUCRADAS EN LA DEGRADACIÓN
DE CARBOFURAN
Los enzimas carbamato hidrolasas han sido detec-
tadas en
Blastobacter
sp. (Hayatsu y Nagata 1993)
Arthrobacter
sp. (Pohlenz
et al
. 1992),
Pseudomo-
nas
sp. (Mulbry y Eaton 1991),
Achromobacter
sp.
(Karns y Tomasek 1991),
Micrococcus
sp. (Dodda-
mani y Ninnekar 2001),
Rhizobium
sp. (Hashimoto
et al
. 2002) y
Aspergillus
sp. (Qing y Yang 2003).
En general las hidrolasas involucradas en la de-
gradación de carbofuran parecen tener diferencias
en sus características bioquímicas y en su actividad
sobre un amplio rango de sustratos relacionados,
bajo el mismo grupo de plaguicidas carbamatos
(
Cuadro I
). Estudios realizados por Mulbry y Ea-
ton (1991), determinaron que la enzima carbamato
MICROORGANISMOS Y DEGRADACIÓN DE PLAGUICIDAS N-METILCARBAMATOS
111
hidrolasa producida por
Pseudomonas
sp. CRL-OK,
fue sintetizada de forma inducible y está conformada
por un dímero con subunidades idénticas de aproxi-
madamente 85 kiloDaltones (kDa). Su temperatura
óptima es de 60 ºC y pH entre 8 y 9. Características
relativamente parecidas han sido determinadas para
las enzimas de
Achromobacter
sp. y
Rhizobium
sp.
No obstante, a diferencia de la enzima carbamato
hidrolasa de
Pseudomonas
sp. cepa CRL-OK, la
enzima de
Pseudomonas aeruginosa
está formada
por un monómero sintetizado constitutivamente por
la bacteria, con temperatura óptima de reacción de
45 ºC y pH óptimo 8.5 (
Cuadro I
, Chapalmadugu y
Chaudhry 1993).
Otra de las características en las que diferen estas
enzimas es el rango de sustratos N-metilcarbamatos
sobre los cuales actúan. Las carbamato hidrolasas
parecen ser capaces de hidrolizar un gran número de
compuestos con enlaces químicos similares. Estudios
realizados para evaluar la afnidad de sustrato de las
carbamato hidrolasas, determinaron que la enzima de
Pseudomonas
sp. cepa CRL-OK, presentó afnidad
semejante para los plaguicidas carbaril y carbofuran,
con menor afnidad para aldicard. No se detectó
actividad enzimática para EPTC (dipropiltiocarba-
mato de etilo), CIPC (isopropil m-cloro carbanilato)
y o–NPDC (orto-nitrofenil-dimetilcarbamato). De
otro lado, estudios realizados con la hidrolasa de
Rhizobium
sp., determinaron mayor especifcidad
en la actividad hidrolítica para carbaril, seguida por
propoxur, fenobucard e isoprocard. No se detectó
actividad hidrolítica con carbofuran y clorprofam
(
Cuadro I
, Hashimoto
et al
. 2002).
La enzima de
Pseudomonas
sp. cepa CRL-OK.,
actúa sobre un rango relativamente amplio de sus-
tratos N-metilcarbamatos, mientras la hidrolasa de
Achromobacter
sp. y la de
Pseudomonas aeruginosa
posee mayor especifcidad hacia los plaguicidas
carbamatos. La enzima de
Pseudomonas aerugino-
sa
sólo hidroliza carbaril, mientras la hidrolasa de
Achromobacter
sp., hidroliza carbaril y carbofuran
principalmente, como también o-NPDC. No obstante,
ambas enzimas citosólicas tienen aproximadamente
la misma afnidad por el carboFuran y el carbaril. La
enzima carbamato hidrolasa de
Achromobacter
sp.,
no demostró actividad frente a fenilcarbamatos y
tiocarbamatos (
Cuadro I
, Karns y Tomasek 1991,
Mulbry y Eaton 1991).
Por otra parte, estudios de caracterización de la
enzima carbamato hidrolasa de
Blastobacter
sp.,
determinaron una alta actividad de esta enzima para
hidrolizar carbaril. También se determinó hidrólisis
de propoxur, xililcarb y 4–nitrofenilacetato en menor
grado. La hidrólisis de carbamatos por la carbaril hi-
drolasa de
Blastobacter
sp. parece estar muy afectada
por los sustituyentes alquilo que se encuentran en el
anillo aromático, ya que la actividad relativa hacia
fenobucarb e isoprocarb fue la más baja de todos
los carbamatos evaluados. Así, las hidrolasas de
Pseudomonas
sp., cepa CRL-OK y
Achromobacter
sp., cepa WM111, son más efectivas en hidrolizar N-
metilcarbamatos que tienen grupos aromáticos. Esto
se debe a que la carbaril hidrolasa de
Blastobacter
sp. cepa M501, parece tener cierta especifcidad por
el enlace éster de los N-metilcarbamatos (Hayatsu y
Nagata 1993).
Con excepción de algunos carbamatos, las enzi-
mas hidrolasas de
Blastobacter
sp.,
Rhizobium
sp. y
Aspergillus
niger
, tienen la capacidad de hidrolizar
otros ésteres de carboxilo como 4-nitrofenil acetato,
1-naftil acetato (Hayatsu y Nagata 1993) y p-nitrofe-
nil butirato (Pohlenz
et al
. 1992), lo cual determina
que las enzimas son esterasas (CbEs).
Otro aspecto bioquímico, en el cual se presentan
grandes diferencias entre las enzimas, es la inhibición
o estimulación de su actividad hidrolítica bajo un
amplio rango de condiciones de reacción, como es
la presencia de detergentes, cationes divalentes como
Hg
2+
y Al
2+
y sales como el dodecil sulfato de sodio
(SDS), entre otras sustancias químicas. Las enzimas
carbamato hidrolasas producidas por
Pseudomonas
sp. CRL-OK y
Pseudomonas
aeruginosa
, retienen
su actividad en presencia de detergentes, agentes
reductores sulfhidrilo y presencia de sales como SDS,
mientras que la actividad de las enzimas de
Rhizo-
bium
sp.,
Blastobacter
sp.
y
Aspergillus
niger
, son
inhibidas por iones Hg
2+
, lo cual indica la presencia
de grupos sulfhidrilo en el sitio activo de estas enzi-
mas. No obstante, retienen su actividad enzimática
con yodo acetamida, dihidroisopropil±uoroFosFato,
paraoxon y ácido etilendiaminotetraacético, deter-
minando que los iones divalentes no son necesarios
para su actividad enzimática (Mulbry y Eaton 1991,
Hayatsu y Nagata 1993, Qing y Yang 2003).
Otros estudios de caracterización de la enzima
carbamato hidrolasa producida por
Aspergillus
niger
, determinaron que esta enzima es inhibida
por la unión de FenilmetilsulFonil ±uoruro (PMS²),
cloromercurio benzoato (PCMB), ácido iodoacético
(IAA) y diiso±uoroFosFato (DIP²), estos compuestos
son inhibidores de los residuos de serina en su centro
activo, los cuales son indispensables para la catálisis
enzimática (Qing y Yang 2003).
Estudios detallados del sitio activo de las enzimas
carboxilesterasas (CbEs), han determinado que la
hidrólisis enzimática de ésteres de carboxilo se basa
J. Castellanos Rozo y L.Y. Rache Cardenal
112
CUADRO I.
PRINCIPALES CARACTERÍSTICAS DE LAS ENZIMAS CARBAMATO HIDROLASAS PRESENTES EN MICROORGANISMOS
Enzima
Subunidades
Temperatura
óptima ºC
pH
óptimo
Actividad
enzimática
Agente
inhibidor
Km
(μM)
a
carbofuran
Km
(μM)
a
carbaril
Actividad
no detectada
Referencia
Pseudomonas
sp. cepa 50432
Monómero de 88 kDa
37
8.5
Detergentes, iones
metálicos, EDTA
2-mercaptoetanol
16
12
o-NPDC.
Chaudhry
et al
.
(2002)
Pseudomonas
sp. cepa
CRL-OK
Dímero con
subunidades idénticas
de 85 KDa
60
8.0
Detergentes, EDTA,
iones metálicos,
2-mercaptoetanol.
ND
140
213
o-NPDC.
EPTC.
CIPC
Mulbry y Eaton
(1991)
Pseudomonas
aeruginosa
cepa
50581
Monómero de
65 kDa
45
8.5
Iones metálicos
ditioeritritol,
ditiotreitol,
2-mercaptoetanol.
ND
ND
9
Carbofuran
Chapalmadugu. y
Chaudhry (1993).
Achromobacter
sp. cepa WM111
Dímero con
subunidades 70 kDa
50
9
ND
EDTA
56
15
Propoxur
Isoprocarb
Fenobucarb
Karns y Tomasek
(1991).
Rhizobium
sp.
cepa
AC100
Dímero con
subunidades idénticas
de 70 kDa
45
9
IAA, DIPF,
paraoxon, EDTA
Iones Hg
2+
ND
62
Carbofuran
Clorprofam
Chapalmadugu y
Chaudhry (1993).
Blastobacter
sp.
cepa M501
Dímero con
subunidades idén ticas
de 84 kDa
45-50
9
Iones metálicos,
DIPF, paraoxon,
EDTA.
Iones Hg
2+
---
55
Fenitrotion
Metilparation
Paraoxon
Clorprofam
Hayatsu y Nagata
(1993).
Aspergillus
niger
cepa
PY168
Monómero de 50 kDa
45
7.5
Fenaltrolina,
EDTA
Iones Hg
2+
y Al
2+
,
IAA,
DIPF,
PMSF, PCMB
67
12
---
Qing y Yang (2003).
Ácido iodoacético: IAA; diisopropilfuoroFosFato: DIP±; FenilmetilsulFonil fuoruro: PMS±; cloromercurio benzoato: PCMB; orto-nitroFenil-dimetilcarbamato: o-NPDC; dipro
-
piltiocarbamato de etilo: EPTC; isopropil m-cloro carbanilato: CIPC; ND (no detectado); ácido etilendiaminotetraacético: EDTA
MICROORGANISMOS Y DEGRADACIÓN DE PLAGUICIDAS N-METILCARBAMATOS
113
en la acilación reversible de un residuo de serina en
el centro activo de la proteína. Esta acilación provoca
la liberación de la molécula y de la correspondiente
enzima covalentemente acilada. Este intermediario
acilado es hidrolizado por ataque nucleofílico del
agua que libera la fracción del ácido carboxílico
correspondiente, además de las enzimas activas, las
cuales quedan dispuestas para iniciar un nuevo ciclo
catalítico. Las secuencias de aminoácidos de algunas
de estas CbEs, presentan importantes homologías con
esterasas eucariotas como las presentes en el hígado
y en la albúmina de suero (Sogorb y Vilanova 2002).
IV. PLÁSMIDOS Y GENES IMPLICADOS EN
LA DEGRADACIÓN DE PLAGUICIDAS
N-METILCARBAMATOS
Estudios realizados a nivel mundial indican que la
capacidad de degradación de la mayoría de los microor-
ganismos se debe a la presencia de varios plásmidos
que codifcan enzimas que les permiten degradar xe
-
nobióticos, plaguicidas N-metilcarbamatos, entre otros
(Desaint
et al
. 2000, Ogram
et al
. 2000, Basta
et al
.
2004) y que están implicados en las vías degradantes
de diversos componentes heterocíclicos. Se demostró
que casi todas las cepas analizadas contenían de 2 a
5 plásmidos circulares con tamaños entre <50 - >400
kilobases (Kb) (Basta
et al
. 2004, Stolz 2009).
También se han encontrado plásmidos grandes
>500, 240 y 180 kb conteniendo genes que codifcan
enzimas para la degradación de compuestos aromáti-
cos (Shuttleworth
et al
. 2000, Cho y Kim 2001, Basta
et al
. 2004, en Stolz 2009) y/o compuestos xenobióti-
cos poliméricos tales como polietilenglicoles (PEGs)
y/o polivinil alcoholes (Tani
et al
. 2007, Stolz 2009).
La primera prueba de la importancia de esos plás-
midos en la degradación de compuestos orgánicos
fue obtenida por Romine
et al
. (1999), al reportar
la secuencia de un plásmido de 184 kb (pNL1) de
Sphingomonas aromaticivorans
F199, que contiene
todos los genes necesarios para la degradación de
naftaleno, bifenil y tolueno. Posteriormente, Ogram
y colaboradores (2000) y Lim y colaboradores,
encontraron evidencia fuerte sobre la participación
de plásmidos en la degradación de varios biocidas
(carbofuran y mecoprop), por diferentes especies de
Sphingomonas
(Stolz 2009). En el año 2004, con la
secuenciación del genoma de
S. wittichii
RW1, se
demostró la presencia de dos plásmidos en esta cepa
(pSWIT01 y pSWIT02 con tamaños de 310 y 223
kb, respectivamente, Basta
et al
. 2004). Shintani
et
al
. (2007), detectaron en
Sphingomonas
sp. KA1 un
plásmido (pCAR3-225 kb) con genes para la degra-
dación, que le permiten a la cepa mineralizar carbazol
en intermediarios del ciclo del ácido tricarboxílico.
Recientemente se ha registrado que los plásmidos de
S. francense
y
S. japonicum
UT26, están involucra-
dos en la degradación de lindano y que
S. japonicum
UT26, contiene un replicón de 185 kb (pCHQ1)
que le permite convertir 2,5 diclorohidroquinona a
maleilacetato (Cérémonie
et al
. 2006, Nagata
et al
.
2006, Stolz 2009).
Algunos autores sugieren que estos plásmidos son
transmitidos por conjugación entre
Sphingomonas
sp.
y que su transferencia es limitada hacia otros géneros
de bacterias (Romine
et al
. 1999, Tiirola
et al
. 2002,
Nagata
et al
. 2006), lo cual contribuye a reducir el
Fujo de genes desde
Sphingomonas
a otras bacterias.
Probablemente esta es una de las razones de la acu-
mulación de cepas de
Sphingomonas
degradadoras
de xenobióticos y el bajo grado de homología de las
secuencias de sus genes con los de otros géneros de
bacterias (Stolz 2009).
La transferencia por conjugación de plásmidos de
gran tamaño entre
Sphingomonas
sp., fue previamen-
te evidenciada
in vitro
para el plásmido (pNL1) de
Sphingomonas aromaticivorans
(Romine
et al
. 1999).
Tiirola
et al
. (2002), propusieron una diseminación
por conjugación específca para genes pcpB (codif
-
can para la pentaclorofenol-4-monooxigenasa) por
medio de análisis de secuencias, donde demostraron
un alto grado de identidad, mayor al 98.9 % de la
secuencia de genes pcpB, aislados entre
Sphingomo-
nas
sp., y una ausencia del gen en bacterias distintas
a
Sphingomonas
sp., aisladas de la misma fuente y
degradadoras de policlorofenol.
Adicionalmente, se ha estudiado en diferentes ce-
pas de
Sphingomonas
sp., plásmidos involucrados en
la degradación de naftalensulfonatos, naftaleno, bife-
nil y tolueno marcados con resistencia a kanamicina,
que únicamente pudieron ser transmitidos dentro de
la familia Sphingomonadaceae (Basta
et al
. 2004), lo
cual hace evidente la limitación de la transferencia de
material genético extra-cromosómico involucrado en
el metabolismo de distintos compuestos xenobióticos
hacia otros grupos de bacterias.
Por otra parte, los plásmidos de este grupo de
bacterias presentan rearreglos genéticos masivos,
como ha sido descrito para bacterias degradadoras
de carbofuran (Ogram
et al
. 2000). Los principales
rearreglos fueron observados en la transferencia por
conjugación del plásmido pNL1 a
Sphingomonas
sp.
HH69 y pBN6 a
Sphingomonas
sp., SS3, donde el
plásmido recibido experimentó alteraciones signif
-
cativas en el tamaño (Basta
et al
. 2004, Stolz 2009).
J. Castellanos Rozo y L.Y. Rache Cardenal
114
Algunos autores atribuyen estos cambios a numero-
sos elementos de inserción y transposones presentes
en los plásmidos de las
Sphingomonas
sp., lo cual
les permitiría tener mayor adaptabilidad a diferentes
condiciones ambientales (Shintani
et al
. 2007, Sipilä
et al
. 2010). Sin embargo, aún falta profundizar en los
análisis de secuencias y los genes codifcados por los
diferentes plásmidos presentes en
Sphingomonas
sp.,
dada su relevancia aplicativa en diferentes procesos
agroindustriales y de biorremediación.
Topp
et al
. (1993), Parekh
et al
. (1995) y Desaint
et al
. (2000), caracterizaron 55 bacterias aisladas de
suelos ingleses y franceses con diferentes historia-
les de tratamiento con N-metilcarbamatos. En estos
aislamientos se encontraron 10 perfles plasmídicos
diferentes, con un tamaño entre 84 y aproximadamen-
te 438 kb, de los cuales el 60 % de los plásmidos tu-
vieron perfles plasmídicos similares (tipo VII ó IV),
es decir, plásmidos con tamaños mayores a 330 kb y
el 40 % restante de los aislamientos tuvieron perfles
de plásmidos I-IV que corresponden a plásmidos con
tamaños de 100, 105, 115 y 124 kb.
Hayatsu
et al
. (1999) demostraron que
Arthro-
bacter
sp. cepa RC100, posee tres plásmidos distin-
tos de los cuales dos, denominados pRC1 y pRC2,
están implicados en la degradación del carbaril.
El tamaño total de los plásmidos fue estimado con
base en la movilidad electroforética de los frag-
mentos (obtenidos previamente por digestión con
las enzimas
BamHI
y
PstI
), comparados con los
patrones de digestión del fago lambda de tamaños
conocidos. Se observó que la cepa RC100 contiene
plásmidos de 110 kb (pRC1), 120 kb (pRC2) y 130
kb (pRC3), muy similares a los obtenidos por Parekh
y colaboradores (1995).
Los resultados de estos experimentos por téc-
nicas de curación con mitomicina C y ensayos de
transconjugación, demostraron que el plásmido
pRC1, codifca la proteína necesaria para hidrolizar
carbaril, mientras que el plásmido pRC2, codifca la
proteína que actúa en la vía metabólica del 1-naftol
a ácido gentísico y el ADN cromosómico codifca
las proteínas necesarias para la degradación restante
del ácido gentísico. Los plásmidos involucrados en
la degradación de carbaril actúan sincronizadamente
para la degradación completa del compuesto, de tal
manera que si faltara la función de un plásmido no
se podría completar la degradación del plaguicida
(Hayatsu
et al
. 1999).
Los plásmidos bacterianos, por tanto, son im-
portantes en la naturaleza y en el laboratorio por
su diversidad genética. Entre las funciones de los
plásmidos están la degradación de agentes químicos
recalcitrantes, producción de antibióticos, resistencia
y factores de virulencia, que evidentemente tienen
un impacto sobre la salud humana (Yeon y Chang
2011). Además, los plásmidos han sido evaluados
como aproximaciones moleculares promisorias para
ser usadas en biología sintética, medicina, ecología y
evolución, como también en investigación básica en
biología molecular y estructural (Azuma
et al
. 2009).
Por ejemplo,
Sphingobium chungbukense
DJ77,
fue aislada a partir de sedimentos de agua fresca
contaminada químicamente, con base en su habilidad
para degradar hidrocarburos aromáticos policíclicos
(HAP) (Pinyakong
et al
. 2003) y su resistencia a la
estreptomicina (Pal
et al
. 2005). Luego, esa cepa fue
estudiada por su habilidad para degradar tolueno,
benzoato, bifenil, antraceno y fenantreno (Basta
et al
.
2004, Yeon y Chang 2011). Actualmente, mediante
ingeniería genética, se transformó una cepa de
Sphin-
gomonas
sp. CDS-1, que degradaba carbofuran con
el gen paration metil hidrolasa (
mpd
) que le confería
a este microorganismo además, la capacidad de de-
gradar simultáneamente paration metílico (PM). Se
obtuvo un microorganismo útil para la biorremedia-
ción de plaguicidas (Jiandong
et al
. 2007).
Acerca de los genes que se han encontrado en los
plásmidos y que están involucrados en el catabolis-
mo de aromáticos, a partir de cepas cultivadas se
han identifcado y clonado alrededor de 300 genes,
número que sigue incrementándose constantemente
(Widada
et al
. 2002a, 2002b).
Derk
et al
. (2003) en
Achromobacter
sp. cepa
WM111, identifcaron y clonaron el gen (
mcd
), que
codifca la enzima metilcarbamato hidrolasa encar
-
gada de degradar el plaguicida carbofuran. El gen
mcd
fue localizado en un plásmido (pPDL11) de
100 kb y se encontró que algunas bacterias que de-
gradan carbofuran tienen secuencia homóloga con
el gen
mcd
(Parekh
et al
. 1996, Dong
et al
. 2012).
Hashimoto
et al
. (2006) realizaron una compa-
ración entre la proteína recombinante de 77 kDa de
Pseudomonas putida
y la proteína purifcada carbo
-
furan hidrolasa de
Achromobacter
cepa WM111 y
observaron bandas idénticas, determinando que los
genes clonados codifcaban la enzima carboFuran
hidrolasa responsable de la hidrólisis primaria del
carbofuran.
Secuencias homólogas para el gen
mcd
fueron de-
tectadas inicialmente en un plásmido llamado pER2a,
de la cepa metilotrópica ER2, aislada de suelos cana-
dienses, con grandes similitudes plasmídicas (Topp
et al
. 1993, McDonald
et al
. 2005). Sin embargo, se
ha demostrado la existencia de secuencias homólogas
para el gen
mcd
en otras bacterias degradadoras de
MICROORGANISMOS Y DEGRADACIÓN DE PLAGUICIDAS N-METILCARBAMATOS
115
N-metilcarbamatos con profundas diferencias fenotí-
picas, genómicas y geográfcas (Parekh
et al
. 1996).
Los estudios de Parekh
et al
. (1995) reportaron
un método para la detección específca del gen
mcd,
en aislamientos bacterianos por la técnica de PCR
(reacción en cadena de la polimerasa). El diseño y
uso de oligonucleótidos específcos para la amplifca
-
ción de un fragmento de 590 pb, en 24 aislamientos
bacterianos, permitió la detección específca del gen
mcd
en bacterias, comprobando que esas secuencias
iniciadoras son altamente específcas y que podrían
ser apropiadas para la identifcación del gen por PCR
en aislamientos bacterianos y directamente del suelo
(Parekh
et al.
1996).
La detección de este gen usando oligonucleóti-
dos específcos Fue Fuertemente correlacionada para
su determinación por hibridación con el gen
mcd
utilizándolo como sonda (Parekh
et al
. 1995). El
alto grado de homología de las secuencias entre los
productos de la PCR, como se determinó por hibri-
dación y por PCR-RFLP, demostró que el fragmento
interno de 590 pb del gen
mcd,
está muy conservado
entre bacterias del suelo que poseen profundas dife-
rencias Fenotípicas, genéticas y geográfcas (Parekh
et al
. 1996).
Parekh
et al
. (1995) utilizaron el plásmido
pPDL11 entero como sonda universal. Se obtuvo
hibridación de perfles de plásmidos de 57 bacterias
degradadoras de N-metilcarbamatos con la sonda
para el plásmido pPDL11, demostrando que existe
una extensa homología entre éste y otros plásmidos
de aproximadamente 100 kb de 24 aislamientos
bacterianos de suelos geográfcamente separados,
fenotípica y genéticamente diferentes, todos con se-
cuencias homólogas al gen
mcd
(Parekh
et al
. 1996).
Los patrones de RFLP obtenidos usando como sonda
el plásmido, demostraron que hay al menos cinco
tipos polimórfcos de este plásmido degradador y
que plásmidos muy similares están presentes en
bacterias con profundas diferencias cromosómicas
y plasmídicas.
En el estudio de Desaint
et al
. (2003), los perfles
plasmídicos y los patrones de ADN total digeridos
con
EcoRI
, fueron hibridados con un fragmento
interno del gen
mcd
, resultando 22 aislamientos
bacterianos de suelos distintos (40 %) con secuencias
homólogas para la sonda de este gen. En 28 aisla-
mientos el ADN cromosómico y plasmídico fue dige-
rido y en cinco aislamientos no se detectó plásmido
(60 %). Estos resultados indican que las secuencias
homólogas para el gen
mcd
, están localizadas en un
fragmento conservado de 12 y 14 kb, obtenido por
la digestión con
EcoRI
de plásmidos con tamaños
similares entre 100, 105, 115 y 124 kb, encontrados
en bacterias con profundas diferencias fenotípicas,
genéticas (plasmídicas y cromosómicas) y aisladas de
zonas geográfcamente distantes (Desaint
et al
. 2000).
Chapalamadugu y Chaudhry (1991) observaron
que 13 aislamientos bacterianos capaces de hidrolizar
N-metilcarbamatos (incluyendo al carbofuran) aisla-
dos de áreas geográfcas diFerentes, no presentaron
secuencias homólogas para el gen
mcd,
y Hashimoto
et al
. (2006) purifcaron y caracterizaron una enzima
N-metilcarbamato hidrolasa de
Pseudomonas
sp.
cepa CRL-OK, diferente a la aislada de
Achromo-
bacter
sp. cepa WM111 y demostraron que el ADN
de la
Pseudomonas sp
., no hibridó con el gen
mcd
.
En otro estudio se determinó que 58 de los 128
aislamientos con actividad degradadora de N-me-
tilcarbamatos no tenían el gen
mcd,
no siendo clara
la relación entre la presencia del gen y la posición
flogenética de la cepa. Lo anterior sugiere que un
número signifcativo de poblaciones del suelo que
hidrolizan carbofuran, no pueden ser detectadas
por el gen sonda
mcd
, indicando que existen otras
secuencias genéticas que codifcan para la Función
N-metilcarbamato hidrolasa. Esto puede deberse a
que cada cepa aislada contiene plásmidos distintos
que les permiten tomar vías diferentes de degradación
(Desaint
et al
. 2000).
En el estudio de Dong
et al
. (2012), se aislaron
37 bacterias degradadoras de carbofuran de varios
suelos agrícolas. Su diversidad y propiedades para la
degradación de carbofuran fueron analizadas usando
métodos flogenéticos, Fenotípicos y genotípicos.
Las secuencias obtenidas se investigaron utilizando
oligonucleótidos para amplifcar la región 16S ADNr
y encontraron que los aislamientos se relacionaban
con miembros de los géneros
Sphingomonas
,
Sphin-
gobium
,
Rhodococcus
,
Bosea
y
Microbacterium
.
Los aislamientos que degradaban carbofuran
Fueron clasifcados en cuatro grupos teniendo en
cuenta sus características de degradación y creci-
miento. Los aislamientos ES2, IJ1, NS2, SS1, TA5 y
YJ1, clasifcados en el grupo A, pertenecientes a los
géneros
Sphingomonas
y
Sphingobium,
degradaron
carbofuran rápidamente después de un periodo de
adaptación inicial al estar expuestos al plaguicida.
Los aislamientos JE1, SS3 y YJ2 clasifcados en el
grupo B, pertenecen al género
Sphingobium
y se
caracterizan por degradar rápidamente carbofuran
sin presentar periodo de adaptación inicial al estar
expuestos al plaguicida.
Los grupos A y B de los aislamientos contie-
nen diversos plásmidos que tienen muchos de los
genes que codifcan las proteínas necesarias para
J. Castellanos Rozo y L.Y. Rache Cardenal
116
degradar plaguicidas carbamatos. Mientras que los
aislamientos del grupo C, que pertenecen al género
Rhodococcus
, degradan y crecen sobre carbofuran a
una proporción moderada, pero ningún aislamiento
tiene ADN plasmídico. Se evidenció que la elimina-
ción de los plásmidos resultó en la pérdida total de
las capacidades de degradación de los aislamientos
para los plaguicidas carbamatos. Lo anterior propor-
ciona evidencia de que los plásmidos contienen genes
esenciales involucrados en la degradación de los car-
bamatos y que el mismo gen o genes similares, están
comprometidos en las reacciones catabólicas. Por
tanto, la hidrólisis del enlace éster o de las uniones
éter de los plaguicidas carbamatos son cruciales para
eliminar la toxicidad de estos compuestos, por lo que
el gen carbamato hidrolasa recibe atención potencial
por su uso en biodegradación (Dong
et al
. 2012).
CONCLUSIONES
Se ha comprobado que existe una gran diversidad
de microorganismos degradadores de plaguicidas N-
metilcarbamatos y sus vías de degradación oxidante
y/o hidrolítica. Sin embargo, se considera necesario
identifcar algunos productos de degradación no co
-
nocidos y su impacto en el ambiente. Los análisis se
han centrado en las enzimas carbamato hidrolasas, las
cuales actúan en la hidrólisis primaria de carbofuran;
sin embargo, existe un vacío sobre el aislamiento y
caracterización del resto de las enzimas que inter-
vienen en el proceso de degradación. Las diferencias
encontradas entre las enzimas carbamato hidrolasas,
aisladas de distintos microorganismos, han permitido
identifcar genes ubicados en diversos plásmidos,
los cuales pueden ser transferidos entre especies
diferentes o sólo entre la misma especie.
La importancia de identifcar los genes que co
-
difcan para enzimas degradadoras de plaguicidas
radica en la posibilidad de utilizarlos en procesos de
ingeniería genética, específcamente en la transFor
-
mación genética, que tendría como fn transFerirle
esta característica a otros microorganismos con
características de interés agrícola y ambiental, como
microorganismos degradadores de compuestos xe-
nobióticos, solubilizadores de FosFato, fjadores de
nitrógeno y controladores biológicos, entre otros.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen a la Universidad de Bo-
yacá por el apoyo otorgado y por el fnanciamiento
del proyecto: Degradación de los plaguicidas N-
metilcarbamatos carbofuran y carbaril por la cepa
bacteriana 8-M3-13, en condiciones
in vitro
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