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EVALUACIÓN DE LA FRECUENCIA Y TIPO DE MICRONÚCLEOS EN NIÑOS CON
DESNUTRICIÓN MODERADA Y GRAVE
Elsa CERVANTES RÍOS
1
, Leonor RODRÍGUEZ CRUZ
1
, Jaime GRANIEL GUERRERO
2
y
Alda Rocío ORTIZ MUÑIZ
1*
1
Departamento de Ciencias de la Salud. Laboratorio de Biología Celular y Citometría de Flujo. Universidad
Autónoma Metropolitana Unidad Iztapalapa. Av. San Rafael Atlixco 186, Vicentina, 09340, México, D.F.
2
Hospital Pediátrico Iztapalapa del Gobierno del Distrito Federal. Av. Ermita Iztapalapa No. 780. Col. Granjas
San Antonio, Iztapalapa, C.P. 09070, D.F.
* Autor de correspondencia: arom@xanum.uam.mx
(Recibido noviembre 2013; aceptado septiembre 2014)
Palabras clave: desnutrición, micronúcleos, aneugénico, clastogénico, citometría de fujo, niños desnutridos
RESUMEN
A nivel mundial la desnutrición es responsable, directa o indirectamente, del 60 %
de los 10.9 millones de muertes que ocurren anualmente entre niños y niñas menores
de 5 años y más de las dos terceras partes se asocian con prácticas inadecuadas de
alimentación durante el primer año de vida. La relación entre este padecimiento y
el daño genético ha sido ampliamente estudiada en humanos y modelos animales.
El análisis de micronúcleos (MN) empleando citometría de fujo es una herramienta
útil para evaluar daño cromosómico
in vivo
. El objetivo de este estudio fue evaluar el
efecto de la infección y la desnutrición en la frecuencia de MN y distinguir entre los
MN formados por fragmentos de cromosomas y los formados por cromosomas com-
pletos rezagados durante la anaFase; en eritrocitos de sangre periFérica de niños bien
nutridos no inFectados y con inFección asociada y en niños con desnutrición moderada
y grave, ambos con inFección. El análisis se eFectuó utilizando citometría de fujo.
Los resultados del presente trabajo indican que los niños con desnutrición moderada
y grave con infecciones asociadas, presentan un incremento en la frecuencia de MN
y como consecuencia inestabilidad génica. Muy pocos MN en los grupos de estudio
fueron cinetocoro positivos, lo cual sugiere que los MN se derivaron principalmente de
rupturas cromosómicas en lugar de pérdida de cromosomas enteros. Los datos indican
que la de±ciencia de nutrientes y las inFecciones podrían actuar conjuntamente para
inducir daño al ADN de estos niños.
Key words: malnutrition, micronuclei, aneugenic, clastogenic, fow cytometry, malnourished children
ABSTRACT
Around the world, malnutrition is responsible, directly or indirectly, For 60 % oF the
million deaths that occur annually among children under the age oF 5 years and more
than two-thirds oF these deaths are associated with not appropriate Feeding practices
during the ±rst year oF liFe. The relationship between malnutrition and genetic damage
Rev. Int. Contam. Ambie. 30 (Número especial sobre ambiente y genética) 23-35
E. Cervantes Ríos
et al.
24
has been widely studied in humans and animal models. Micronuclei (MN) analysis
via fow cytometry is a useFul tool to assess chromosomal damage
in vivo
. The aim oF
this study was to evaluate the eFFects oF inFection and malnutrition on the Frequency
oF MN and distinguish between chromosome Fragments and whole chromosomes lag
-
ging behind in anaphase; in erythrocytes From the peripheral blood oF well-nourished,
uninFected and well-nourished, inFected children, and moderately malnourished and
severely malnourished children, both with inFection, using a fow cytometric analysis
technique. The results oF this study indicate that children with moderate and severe
malnutrition associated with inFections, shows an increase in the Frequency oF MN
and gene instability as a result. Very Few MN From either well-nourished inFected and
malnourished children exhibited kinetochore staining, suggesting that the MN were
derived From chromosome breakage rather than From whole chromosome loss. The
data indicate that malnutrition and inFection could act together to induce damage to
DNA oF these children.
INTRODUCCIÓN
El estado nutricional afecta cada aspecto de la
vida y salud de los niños, incluyendo un crecimiento
y desarrollo normal, así como la actividad física y
la respuesta adecuada a enfermedades (Rodríguez
et al.
2011).
La desnutrición puede originarse por la ingesta
de±ciente de cualquier nutriente. El establecimiento
y gravedad de ésta depende de la causa e intensidad.
Puede ser originada por una dieta inadecuada o por
causas secundarias como de±ciencias o alteraciones
en la absorción gastrointestinal, un incremento en
la demanda de nutrientes o una excesiva excreción
de éstos, como es el caso de los cuadros diarreicos
(Scrimshaw y SanGiovanni 1997, Rodríguez
et al
.
2011). Así, la de±ciencia en la ingesta de macro
-
nutrientes como proteínas, carbohidratos y lípidos
deriva en un estado patológico conocido como des-
nutrición calórico proteica (DCP).
Este padecimiento se encuentra entre los princi-
pales problemas de salud pública en países en vías de
desarrollo y está asociado con una alta mortalidad y
morbilidad en niños menores de cinco años (Müller
y Krawinkel 2005, Rodríguez
et al.
2011). Más de
77 millones de niños nacen cada año en países con
altos índices de desnutrición. De éstos, alrededor
de 7.4 millones mueren antes de los tres años y 0.6
millones mueren entre los tres y cinco años (Elsayh
et al.
2013).
Es importante recalcar que generalmente, los
niños con desnutrición padecen de inFecciones, en
este sentido, se ha documentado ampliamente que la
relación entre este síndrome y las infecciones es bi-
direccional (Brown 2003, Müller y Krawinkel 2005).
Existen múltiples mecanismos de acción en la rela-
ción entre éste y la susceptibilidad a las infecciones
bacterianas. Se ha reportado que la DCP aFecta el
funcionamiento del sistema inmunológico. Ante la
presencia de infecciones, la respuesta inmunológica
deber ser estimulada adecuadamente, esto depende
de nutrientes que no están disponibles cuando un
organismo se encuentra en un estado nutricional
de±ciente, por lo que se establece un círculo vicioso
entre esta condición,
la de±ciencia de respuesta del
sistema inmunológico y la susceptibilidad a infec-
ciones. Los niños desnutridos, por lo general, suFren
de infecciones gastrointestinales y respiratorias (Ro-
dríguez
et al.
2011).
Por otro lado, la gravedad de la desnutrición
puede ser clasi±cada de acuerdo al dé±cit de peso/
talla para la edad cronológica del niño, de tal Forma
que si este parámetro disminuye entre el 10 y el 24 %
se considera leve, si se reduce del 25 al 40 % se con-
sidera moderada y si supera el 40 % es grave (Gómez
1946, Gómez
et al
. 2003).
La desnutrición es una condición que afecta de
manera multisistémica a los organismos que la pa-
decen. En este sentido, se ha determinado que tiene
un efecto deletéreo sobre la integridad del ADN de
los individuos con este síndrome (Betancourt
et al.
1995, Ortiz
et al.
1997, 2004). Recientemente Ortiz
et al.
(2011) demostraron que en ratas con desnutri-
ción inducida por competencia de alimento, existe
una alta frecuencia de micronúcleos (MN) y que ésta
incrementaba con la administración de trimetoprim-
sulfametoxasol (medicamento frecuentemente utili-
zado en el tratamiento de infecciones respiratorias en
niños). De igual Forma, Cervantes-Ríos
et al.
(2012),
demostraron que los niños con desnutrición mode
-
rada y grave presentaban inestabilidad genómica, la
cual estaba refejada por una alta Frecuencia de MN
en reticulocitos (RET) y eritrocitos (E) de sangre
periFérica, en comparación con niños bien nutridos.
TIPO DE MICRONÚCLEOS EN NIÑOS CON DESNUTRICIÓN
25
Por su gran sensibilidad, el ensayo de MN es una
herramienta confable y reproducible para evaluar
genotoxicidad, lo cual ha sido confrmado a través
de diversos protocolos de investigación en sistemas
vegetales y animales (Valencia-Quintana
et al
. 2013).
Debido a estas características, actualmente, numero-
sos estudios incluyen el ensayo de MN para medir
daño al ADN y evaluar la genotoxicidad de Factores
físicos, químicos, ambientales y de estilo de vida
(Lau
et al.
2009, Cveticanin
et al.
2010, Lal y Ames
2011), dentro de ellos se incluye el estado nutricional
de los individuos. En años recientes se han implemen
-
tado métodos para realizar el ensayo de MN usando
citometría de ±ujo (Dertinger
et al.
2011). Esto ha
hecho posible analizar muestras de sangre periFérica
en lugar de células de médula ósea, lo cual confere al
estudio una serie de ventajas importantes, ya que no
es invasivo, se requiere poca muestra de sangre para
llevarlo a cabo, se analizan un gran número de células
(lo cual da un alto poder estadístico), es confable y
proporciona resultados objetivos (Dertinger
et al.
2000, 2003, 2006, Tourus
et al.
2003). Actualmente
estos métodos pueden implementarse para analizar
eritrocitos de sangre periférica de especies en las
cuales el efecto del bazo es particularmente eviden-
te, ya que éste es capaz de fltrar los eritrocitos que
presenten inclusiones intracelulares, lo cual podría
reducir la sensibilidad de la prueba, sin embargo,
existe amplia evidencia de que el ensayo es confable
y reproducible (Stopper
et al
. 2005, Dertinger
et al.
2006, 2007, Witt
et al.
2008).
Los MN son pequeños cuerpos extranucleares de
cromatina que se forman durante la división celular y
pueden estar constituidos por fragmentos acéntricos
de cromosomas o de cromátidas, o en su defecto, por
cromosomas completos. Estas estructuras se originan
debido a que los fragmentos acéntricos o los cromo-
somas completos, se encuentran separados durante
la anafase y no son incluidos en el núcleo principal
durante la teloFase (Sedelnikova
et al.
2007, ²enech
et
al.
2011). Los MN están envueltos por una membrana
nuclear, similar a la del núcleo de la célula hija, sin
embargo, su tamaño es muy pequeño en comparación
a éste (Zalacain 2005).
Cuando un MN está formado por fragmentos
acéntricos, se considera de tipo clastogénico, y si está
formado por cromosomas completos se considera de
tipo aneugénico (Cervantes
et al.
2012). Bajo este
criterio, detectar el centrómero y el cinetocoro en los
MN puede incrementar la especifcidad del ensayo
de MN, ya que los MN de tipo aneugénico pueden
ser reconocidos por anticuerpos dirigidos contra el
cinetocoro (cinetocoro positivos). Por otro lado, los
de tipo clastogénico, carecen de cinetocoro/centró
-
mero, por tanto son cinetocoro/centrómero-negativos
(Luzhna
et al.
2013). Alternativamente las regiones
centroméricas pueden ser reconocidas mediante
la técnica de hibridación
in situ
con ±uorescencia
(FISH, por sus siglas en inglés de,
Fluorescent In
Situ Hybridization
) (Mateuca
et al.
2006).
En general, un MN de tipo clastogénico se for-
ma después de que el ADN ha suFrido daño, como
puede ser el rompimiento de doble cadena, que si
no es reparado adecuadamente da como resultado
el rearreglo asimétrico de cromosomas e intercam-
bio de los mismos. Por otro lado, los MN de tipo
aneugénico se Forman por defciencias en la segre
-
gación cromosómica durante la anafase, usualmente
causada por Fallas en el huso mitótico, daño en el
cinetocoro, hipometilación del ADN centromérico
y alteraciones en la regulación del ciclo celular
(Mateuca
et al.
2006).
En estudios anteriores, se ha demostrado que la
desnutrición favorece la inestabilidad génica, ya que
se han registrado altas Frecuencias de MN en niños y
ratas (Cervantes
et al.
2012, Ortiz
et al.
2004, 2011).
Sin embargo, no se había determinado el tipo de MN
que se Forman. Identifcar el tipo o tipos de MN que
se generan, nos proporcionará un panorama general
sobre las alteraciones en las vías de reparación y en
la segregación de cromosomas que estos organismos
pueden estar exhibiendo. Así, el objetivo de este tra
-
bajo fue determinar el tipo de MN que se forman en
niños con desnutrición moderada y grave con el fn
de lograr un mejor entendimiento de la relación entre
el estado nutricional y los mecanismos que pueden
estar implicados en la formación de MN.
MATERALES
Reactivos: heparina sódica (250 U/mL, Micro
-
lab, México). BBS (BBS: 0.9 g de NaCl + 0.0444
g de NaHCO
3
en 100 mL de H
2
O destilada) a pH
7.5. RNasa (1 mg/mL) (M.P. Biomedicals, Inc.
Francia). Anticuerpo dirigido contra CD71 con-
jugado con ²ITC (anti-CD71-²ITC; Chemicon
International, USA & Canada). Anticuerpo dirigido
contra CD61 conjugado con PE (anti-CD61-PE;
Chemicon International, USA & Canada). Isotipo
conjugado con FITC (anti-IgG1-FITC; Millipore,
Australia Pty. Limited). Tween al 0.1 %. Anticuerpo
dirigido contra cinetocoro (anti-K; Chemicon Inter
-
national, USA &Canada). Cy5 (Chemicon Internatio
-
nal, USA
& Canada). Yoduro de propidio (IP; 2
μg/mL,
Sigma).
E. Cervantes Ríos
et al.
26
MÉTODO
3.1 Grupos de estudio
Para la realización del estudio se obtuvo la apro-
bación del Comité de Ética y Bioseguridad del Hos-
pital Pediátrico Iztapalapa, del Gobierno del Distrito
Federal. Se realizó un muestreo aleatorio simple para
colectar muestras de sangre periférica de pacientes
pediátricos con edades entre los 6 y los 60 meses. Se
contó con el consentimiento informado de los padres
de los niños que participaron en este estudio.
Para colectar las muestras, se utilizaron jeringas
heparinizadas. Se tomaron aproximadamente 2 mL
de sangre periférica. Una vez tomadas las muestras,
fueron almacenadas a 4 ºC para ser transportadas en
una nevera portátil para muestras biológicas hasta el
laboratorio, en donde fueron procesadas.
De acuerdo al estado nutricional, los niños in
-
cluidos en el estudio se dividieron en cuatro grupos:
Bien nutridos (BN): Con peso y talla adecuados
para la edad, sin infecciones.
Bien nutridos con infecciones (BNI): Con peso
y talla adecuados para la edad, con infecciones gas-
trointestinales y/o respiratorias de tipo bacteriano.
Desnutrición moderada con infecciones (DESMI):
Con défcit de peso/talla mayor al 25 % y menor
al 40 % para la edad y talla, así como infecciones
gastrointestinales y/o respiratorias de tipo bacteriano.
Desnutrición grave con infecciones (DESGI):
Con défcit de peso/talla superior al 40 % además
de inFecciones gastrointestinales y/o respiratorias
de tipo bacteriano.
El grado de la desnutrición se evaluó de acuerdo
a los signos clínicos y a los síntomas presentados, así
como con la valoración del défcit peso/talla, según
lo establecido en las tablas de peso/talla para niños
mexicanos de Ramos-Galván (1976). Las infecciones
bacterianas fueron diagnosticadas rigurosamente de
acuerdo a los datos clínicos y a las pruebas de labora-
torio de rutina. No se incluyeron en el estudio a niños
que presentaron infecciones virales, tuberculosis,
enfermedades cardiacas o alergias. No se analizaron
las muestras que se hemolizaron, se coagularon o no
presentaron integridad celular.
La inclusión del grupo bien nutridos con infeccio-
nes, Fue necesaria ya que los niños desnutridos son
también infectados.
3.2 Fijación de la muestra
La sangre se mantuvo a 4 ºC y Fue fjada en me
-
tanol ultraFrío dentro de las tres horas siguientes a
la extracción. Posterior a su fjación, las muestras
se almacenaron en un ultracongelador a –70 ºC al
menos durante 24 horas antes de ser teñidas para su
posterior análisis (Cervantes
et al
. 2012).
3.3 Tinción celular
Detección de micronúcleos en reticulocitos de
sangre periFérica de niños de los cuatro grupos de
estudio
El día del análisis, las muestras fueron retiradas
del ultracongelador. Se resuspendió el volumen total
y se tomó una alícuota de 1 mL. Para eliminar el fja
-
dor, se centrifugó con BBS a 4 ºC, a 600 xg durante 5
minutos a 4 ºC. El botón recuperado se resuspendió
en 100 μL de BBS y se redistribuyó en alícuotas de
25 μL en 3 tubos de polipropileno que contenían 80 μL
de RNasa (1 mg/mL). El primer tubo Fue utilizado
para detectar la auto±uorescencia, al segundo tubo se
agregaron 5 μL de anti-IgG1-²ITC, y Fue usado como
control negativo. En el tercer tubo se agregaron 5 μL
de anti-CD71-FITC para marcar reticulocitos (RET)
y 10 μL de anti-CD61-PE para marcar plaquetas y
poder excluirlas de la región de análisis (Dertinger
et al.
2003). Todos los tubos se incubaron a 4 ºC
durante 40 minutos, y por 90 minutos a temperatura
ambiente en oscuridad. Al término de la incubación se
agregaron 500 μL de BBS y se procedió a su análisis
por citometría de ±ujo. En este momento se agregaron
a todos los tubos 2 μL de yoduro de propidio Frío (2
μg/mL, Sigma) para evidenciar la presencia de MN
(Dertinger
et al.
2000).
3.3.1.2 Análisis de MN por citometría de fujo
El ensayo de MN utilizado en este trabajo se basó
en el uso de anti-CD71-FITC para marcar a los RET y
diferenciarlos de los eritrocitos (E), el uso de IP para
detectar MN en ambas poblaciones celulares y anti-
CD61-PE. Se utilizó un citómetro de ±ujo modelo
²ACSCalibur (Becton Dickinson, Immunocytometry
Systems, San José, CA) con láser de argón a 488 nm
de excitación y el paquete computacional Cell Quest
(versión 3.0.1, Becton Dickinson) para analizar los
datos. Se adquirieron 500,000 eventos por muestra.
Las señales de anti-CD71-²ITC, anti-CD61-PE e
IP fueron detectadas en los canales FL1, FL2 y FL3
respectivamente. Para el análisis de los datos se
desplegaron gráfcas de puntos, con las cuales se im
-
plementó la siguiente estrategia de regionalización:
Se seleccionó la población de análisis grafcando
“Forward Scatter” (dispersión frontal de la luz) con-
tra “Side Scatter” (dispersión lateral de la luz), para
delimitar la región de células individuales.
Posteriormente, en una gráfca de ²L3 vs. ²L1 se
identifcó la región de acuerdo al contenido de ADN
para excluir a las células nucleadas.
TIPO DE MICRONÚCLEOS EN NIÑOS CON DESNUTRICIÓN
27
Por último se delimitó la región, excluyendo a
las plaquetas (anti-CD61-PE vs. anti-CD71-FITC).
En la
fgura 1
se muestran las gráfcas de puntos
obtenidas de acuerdo a esta estrategia de regionali-
zación.
3.3.2 Determinación del tipo de micronúcleos en
reticulocitos y eritrocitos de sangre periFérica de
los cuatro grupos de estudio
Las muestras fueron procesadas igual que en el
punto anterior, una vez que se colocaron las alícuotas
de 25 mL en los 3 tubos de polipropileno el tubo 1
se incubó con BBS más Tween al 0.1 % por 5 minu-
tos, después se centrifugó a 600 xg por 5 minutos.
Al botón recuperado se le agregaron 20
μ
L de anti-
Cinetocoro para detectar la presencia de cinetocoro
(anti-K) y se incubó por una hora a temperatura
ambiente. Se centrifugó y al botón recuperado se
agregaron 50
μ
L de Cy5 y se incubó a temperatura
ambiente. Se centrifugó y se agregaron 80
μ
L de
RNasa (1 mg/mL) más 5 μ
L de anti-CD71-FITC. Al
tubo 2 (para calibrar) se le agregaron 80
μ
L de RNasa
(1 mg/mL) más 5 μ
L de anti-CD71-FITC. Al tubo 3
(control negativo) se agregaron 5
μ
L de anti-IgG1-
FITC. Todos los tubos se incubaron a 4 ºC durante
40 minutos, y por 90 minutos a temperatura ambiente
en oscuridad. Al término de la incubación se agre-
garon 500 μL de BBS y se procedió a su análisis por
citometría de Fujo. En este momento se agregaron a
todos los tubos 2 μL de IP (2 μg/mL) para evidenciar
la presencia de MN (Dertinger
et al.
2003).
3.3.2.1 Análisis del tipo de MN por citometría de
±ujo
Para determinar el tipo de MN, se utilizó anti-
CD71-FITC para marcar a los RET y diferenciarlos
10
0
10
1
10
2
FSC-Height
10
3
10
4
10
0
10
1
10
2
10
3
a)
SSC-height
10
4
10
0
10
1
10
2
Anti-CD61-PE
10
3
10
4
10
0
10
1
10
2
10
3
c)
10
4
10
0
10
1
10
2
Yoduro de propidio
10
3
10
4
10
0
10
1
10
2
10
3
b)
Anti-CD71-FITC
Anti-CD71-FITC
10
4
Células nucleadas
Eritrocitos
Plaquetas
Eritrocitos
Anti-CD71-FITC
10
0
10
1
10
2
Yoduro de propidio
10
3
10
4
10
0
10
1
10
2
10
3
d)
10
4
E
RET
E-MN
RET-MN
CD71+/IP+
CD71-/IP+
CD71+
CD71-
²ig. 1.
Se observa la secuencia de análisis para delimitar a la región de interés. a)
Selección de la población de E con base a la dispersión ±rontal (²SC-Height) y
lateral (SSC-Heigth) de la luz. b) Eliminación de células nucleadas con base a
la tinción de IP vs. anti-CD71-FITC. c) Eliminación de las plaquetas con base
a la tinción anti-CD61-PE vs. anti-CD71-²ITC. d) Se muestra la gráfca de
puntos en la que se observan las poblaciones de interés: RET (tinción positiva a
anti-CD71-FITC), RET-MN (tinción positiva a anti-CD-FITC y a IP, E (Tinción
negativa a anti- CD71-FITC y E-MN (tinción negativa a anti-CD71-FITC y
positiva a IP)
E. Cervantes Ríos
et al.
28
de los E, IP para detectar MN en ambas poblaciones
celulares y anti-cinetocoro acoplado a Cy5 para
detectar la presencia de cinetocoro, partiendo de la
premisa de que si se observa “señal” para cinetocoro,
el MN es de tipo aneugénico (MN-K+) y si no se de-
tecta “señal”, el MN es de tipo clastogénico (MN-K-).
Se utilizó el mismo citómetro de fujo descrito
previamente. Se adquirieron 500,000 células por
muestra. Las señales de anti-CD71-FITC, IP y Cy5
fueron detectadas en los canales FL1, FL2 y FL3
respectivamente. Para el análisis de los datos se
desplegaron grá±cas de puntos, con las cuales se im
-
plementó la siguiente estrategia de regionalización:
Se seleccionó la población de análisis gra±cando
“Forward Scatter” contra “Side Scatter”, para deli-
mitar la región de células individuales.
En una grá±ca de FL3 vs. FL1 se identi±có la
región de las células nucleadas, para excluirlas de la
región de análisis.
Después, con base en la tinción de IP y anti-CD71-
FITC, se identi±caron las siguientes poblaciones:
RET, reticulocitos micronucleados (RET-MN), E y
eritrocitos micronucleados (E-MN).
Por último se delimitó la región, de acuerdo a la
tinción con anti-CD71-FITC y a anti-K Cy5, para
detectar los porcentajes de las diferentes poblaciones
de eritrocitos: RET-MN que no presentan cinetocoro
(RET-MN-K-), RET-MN que presenten cinetocoro
(RET-MN-K+), E-MN que no presenten cinetocoro
(E-MN-K-) y E-MN que presenten cinetocoro (E-MN-
K+). Los porcentajes de estas poblaciones se calcula-
ron usando la hoja de cálculo EXCEL. En la
fgura 2
,
se observa la estrategia de regionalización descrita.
3.4 Análisis estadístico
Para conocer la diferencia estadística entre los
grupos de estudio se utilizó una prueba de Kruskal-
Walis, seguida de las prueba de U de Mann-Whitney
con una p ≤ 0.05 (Paquetes estadísticos: NCSS,
versión 07.1.9 y NOPANDEV).
RESULTADOS
En el
cuadro I
se resumen las características clí-
nicas de los niños incluidos en el estudio. Se muestra
el número de niños en cada grupo (n), los intervalos
y promedios de la edad, peso, estatura y dé±cit de
peso, así como el porcentaje de niños con un tipo
particular de infección.
Los datos indican que el grupo DESGI presen-
ta mayor frecuencia de RET-MN en comparación
con el grupo de niños DESMI (2.02 % ² 1.67 y
1.46 % ² 0.84 respectivamente). Sin embargo, no
existe di³erencia signi±cativa entre estos dos grupos.
Cuando se hizo la comparación entre los grupos BN
vs. BNI (0.46 % ² 0.26 y 1.19 % ² 0.68), se encon
-
tró di³erencia signi±cativa (p ≤ 0.05), lo cual indica
que la frecuencia de RET-MN de BNI muestra un
incremento asociado con la infección (
Figura 3
). De
igual ³orma, al comparar al grupo de niños BNI con
el grupo DESMI, estos últimos mostraron un incre-
mento signi±cativo (p ≤ 0.05). Con relación al grupo
DESGI el porcentaje también es signi±cativamente
mayor con respecto a los grupos BN y BNI (p ≤ 0.05).
Para complementar estos datos, se determinó el
tipo de MN para cada uno de los grupos de estudio
de acuerdo al análisis descrito previamente.
El porcentaje promedio de RET-MN-K+ y E-MN-
K+ en los niños del grupo BN ³ue de 0.02 ² 0.01 %
y de 0.55 ² 0.15 % respectivamente. El grupo BNI
mostró un porcentaje promedio de RET-MN-K+ de
0.11 ² 0.02 % y de 0.63 ² 0.09 % para E-MN-K+.
En el grupo de niños DESMI se observó que los
porcentajes promedio de RET-MN-K+ y E-MN-K+
³ueron de 0.03 ² 0.1 % y de 0.43 ² 0.06 % respectiva
-
mente, mientras que para el grupo DESGI los valores
encontrados ³ueron de 0.13 ² 01 % de RET-MN-K+
y de 0.42 ² 0.14 de E-MN-K+.
Para calcular el porcentaje de MN de tipo clasto-
génico se hizo una resta, la cual consistió en tomar
el total de eventos analizados como un 100 % (ver
estrategia de regionalización para tipo de MN). A
este 100 % se le restó el porcentaje de MN de tipo
aneugénico y el resultado fue tomado como el por-
centaje de MN de tipo clastogénico. Estos resultados
se concentran en el
cuadro II
.
Los datos indican que los MN de tipo aneugénico,
es decir, cinetocoro positivos, representan una frac-
ción muy pequeña de las dos poblaciones celulares
(
Figura 4
). También se observa que los E-MN pre-
sentan mayor frecuencia de MN de tipo aneugénico,
en comparación con los RET, en todos los grupos.
Como puede observarse, la gran mayoría de MN fue
de tipo clastogénico, los cuáles están relacionados
con la ruptura de la cadena de ADN. Al hacer una
comparación entre grupos no se encontraron diferen-
cias signi±cativas (p
> 0.05).
DISCUSIÓN
Di³erentes ³actores pueden infuir sobre el e³ecto
de los agentes genotóxicos y la formación de MN.
Entre ellos se encuentran la edad, el género, el
estilo de vida y el estado nutricional, así como la
TIPO DE MICRONÚCLEOS EN NIÑOS CON DESNUTRICIÓN
29
susceptibilidad al desarrollo de enfermedades (Iarmar-
covai
et al.
2008). En el siglo pasado, se han llevado a
cabo múltiples estudios sobre la generación de MN y
un análisis prospectivo de estos estudios muestra que
la variabilidad en la frecuencia de MN depende de los
factores antes mencionados, mientras que las caracte-
rísticas intra e interindividuales también infuyen sobre
la formación de MN (Sato
et al.
1990).
El ensayo de MN se ha establecido como un mé
-
todo conFable para analizar daño cromosómico
in
vivo
y es utilizado por muchos investigadores para
monitorear la integridad del ADN después de la ex-
posición a agentes tóxicos o bien después de someter
a organismos a una deFciente nutrición (O±er
et al.
2004). Diversos investigadores han demostrado que
los RET representan una población celular adecuada
para realizar el ensayo de MN por citometría de fujo
(MacGregor
et al.
2006, Dertinger
et al.
2007,2011,
Hotchkiss
et al.
2008, Cervantes
et al.
2012). La
evaluación del daño genotóxico usando el ensayo de
MN es una herramienta importante para estudiar la
asociación entre la nutrición y el daño al ADN (Ma
-
teuca
et al.
2006). Se considera importante incluirlo
en los estudios citogenéticos, ya que proporciona
información adicional y complementaria a la obtenida
con el análisis de aberraciones cromosómicas y de la
±recuencia de intercambio de cromátidas hermanas.
Además, la citometría de fujo, es un método alta
-
mente sensible, relativamente fácil de realizar y con
un signiFcado biológico claro.
10
0
10
1
10
2
FSC-Height
10
3
10
4
10
0
10
1
10
2
10
3
a)
SSC-height
10
4
10
0
10
1
10
2
Anti-K-Cy5
10
3
10
4
10
0
10
1
10
2
10
3
Anti-CD71-FITC
10
4
10
0
10
1
10
2
IP
10
3
10
4
10
0
10
1
10
2
10
3
c)
d)
Anti-CD71-FITC
10
4
10
0
10
1
10
2
Anti-K-CyS
10
3
10
4
10
0
10
1
10
2
10
3
b)
Anti-CD71-FITC
10
4
Células
nucleadas
R2
RET
RET-MN
E
E-MN
1)
2)
4) E-MN-K+
RET-MN-K-
RET-MN-K+
3) E-MN-K-
Fig. 2.
Las gráFcas de puntos muestran la secuencia de regionalización, así como las
poblaciones de interés. a) Se ubica a la población de E con base a la disper-
sión ±rontal (²SC-Height) y lateral (SSC-Heigth) de la luz. b) Eliminación de
células nucleadas con base a la tinción de anti-K-Cy5 vs. anti-CD71-FITC. c)
Se delimitan las poblaciones de RET, RET-MN, E y E-MN. D) Se identiFcan
las poblaciones de interés: 1) RET-MN-K-: RET positivos a la tinción con
anti-CD71-FITC e IP, pero negativos a la tinción con anti-K-Cy5 (RET con
MN de tipo clastogénico). 2) RET-MN-K+: RET positivos a la tinción con
anti-CD71-FITC e IP, así como a la tinción con anti-K-Cy5 (RET con MN de
tipo aneugénico). 3) E-MN-K-: E positivos a la tinción con anti-CD71-FITC e
IP, pero negativos a la tinción con anti-K-Cy5 (E con MN de tipo clastogénico).
4) E-MN-K+: E positivos a la tinción con anti-CD71-FITC e IP, así como a la
tinción con anti-K-Cy5 (RET con MN de tipo aneugénico
E. Cervantes Ríos
et al.
30
Los datos obtenidos mostraron que el grupo DESGI
presentó la mayor frecuencia de RET-MN, pues hubo
un incremento de 4.5 veces en comparación con el
grupo BN y de 1.8 veces en comparación con el grupo
BNI (se encontró diferencia signiFcativa p ≤ 0.05).
Esto indica que estos niños sufren daño al ADN, el
cual está in±uenciado por el estado nutricional y por
efecto de las infecciones. Los niños DESMI mostra
-
ron una frecuencia de RET-MN menor que el grupo
DESGI, pero no se encontró diferencia signiFcativa.
Cuando se compararon los grupos DESMI vs. BNI,
se observó un incremento de 1.5 veces (diferencia
signiFcativa p ≤ 0.05), este incremento indica que los
niños del grupo DESMI exhiben daño citogenético, el
cual se relaciona con el estado nutricional. Al hacer la
comparación DESMI vs. BN no se encontró diferencia
signiFcativa, por lo que se inFere que las infecciones
que presentaron los niños con desnutrición moderada
no in±uyen en la generación de MN en RET. Sin
embargo, se observó que el grupo DESMI mostró un
incremento de 3.7 veces con relación a los valores
encontrados en el grupo BN (1.63 % vs 0.44 %), se
podría inferir que la falta de diferencia signiFcativa se
relaciona con la variabilidad intra e inter grupal. Los
valores obtenidos para el grupo BNI indicaron que
había un incremento de 2.4 veces de RET-MN en com
-
paración con el grupo BN, al encontrarse diferencia
signiFcativa (p ≤ 0.05) y tomando en cuenta que ambos
grupos están conformados por niños bien nutridos, se
corrobora que la infección si ejerce un efecto deletéreo
en la estabilidad del ADN. Al comparar a los grupos
DESMI vs. DESGI se encontró que el grupo DESGI
tiene un incremento de 1.2 veces de RET-MN con
relación al grupo DESMI. Sin embargo, al no encon-
trarse diferencia signiFcativa, se inFere que el grado
de desnutrición no in±uye en la generación de MN.
Diversos estudios han establecido que el incre
-
mento en la formación de RET-MN en los niños con
desnutrición, podría estar relacionado con el hecho de
que los agentes infecciosos, en este caso de tipo bac-
teriano, desencadenan en el organismo una respuesta
inmunológica, la cual incrementa la concentración
de radicales libres (Ames
et al.
1993). Con relación
a esto, previamente se ha reportado, en organismos
con este síndrome, que los sistemas antioxidantes son
CUADRO I.
CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS DE LOS NIÑOS INCLUIDOS EN EL ESTUDIO. SE MUESTRA
EL NÚMERO DE NIÑOS EN CADA GRUPO (n), LOS INTERVALOS Y PROMEDIOS DE EDAD,
PESO, ESTATURA Y DÉFICIT DE PESO, ASÍ COMO EL PORCENTAJE DE NIÑOS CON UN
TIPO PARTICULAR DE INFECCIÓN.
A
MIXTA: EL NIÑO PRESENTA IN²ECCIÓN GASTROIN
-
TESTINAL Y RESPIRATORIA
Grupo
n
Edad (meses)
Peso (Kg)
Estatura (cm)
DéFcit de peso
( %)
Tipo de
Infección
BN
18
39.5
(6-60)
14.4
(7-21)
95.7
(51-123)
< 10
Sin infección
BNI
23
29.3
(8-60)
12.6
(7-24.5)
89
(65-123)
< 10
Respiratorias (82.6 %)
Gastrointestinales (17.3 %)
DESMI
21
18.6
(6-60)
7.8
(3-17.5)
76.2
(50-128)
28.7
(23.1-35.4)
Respiratorias (52.3 %)
Gastrointestinales (33.3 %)
Mixta
A
(14.2 %)
DESGI
14
14.9
(6-45)
5
(3-9)
64
(58-83)
48.2
(34-75)
Respiratorias (50 %)
Gastrointestinales (35.7 %)
Mixta
A
(14.2 %)
*
&
3
2.5
2
% RET-MN
1.5
1
0
0.5
BN
BNI
DESMI
DESGI
*
&
&
%
%
0.44
1.08
1.63
2.02
Fig. 3.
Porcentaje de RET-MN en niños bien nutridos (BN),
bien nutridos infectados (BNI), con desnutrición mode-
rada e infecciones (DESMI) y con desnutrición grave e
infecciones (DESGI). Los datos son presentados como
promedio
³
error estándar. Se encontró diferencia sig-
niFcativa (p ≤
0.05) entre BN vs. BNI, BNI vs. DESMI,
DESGI vs. BN, BNI.
TIPO DE MICRONÚCLEOS EN NIÑOS CON DESNUTRICIÓN
31
defcientes; esto provoca una excesiva acumulación
de especies reactivas de oxígeno (ERO), lo cual a su
vez genera daño al ADN (Ball
et al
. 1998, Ashour
et
al.
1999, Fang 2002). También, Cervantes (2012),
demostró que los niños con desnutrición moderada
y grave muestran una baja actividad de glutatión pe-
roxidasa y superóxido dismutasa. Los datos indican
que esos niños muestran una capacidad antioxidante
defciente. Sin embargo, es necesario realizar más
estudios encaminados a determinar si el estrés oxi-
dante está relacionado con la formación de MN e
inestabilidad génica.
Con relación a lo anterior, existen datos con-
sistentes de que la concentración de moléculas
antioxidantes en niños con desnutrición grave, se
encuentra disminuida, lo cual genera un estado de
estrés oxidante, que podría desembocar en el daño
al ADN por oxidación (Becker
et al.
1995, Lehhartz
et al.
1998), además se ha observado que las concen
-
traciones de glutatión en plasma y sangre total son
especialmente bajas, este hecho se relaciona con daño
a las membranas celulares, y probablemente al ADN
(Reid 2000, Golden 2002).
Con respecto a la determinación del tipo de MN,
los datos del presente estudio muestran que en los
cuatro grupos de estudio, las frecuencias de RET-MN
y de E-MN de tipo aneugénico, son muy bajas, en
consecuencia los MN de tipo clastogénico en ambas
subpoblaciones celulares representan la mayor pro-
porción de los MN Formados en los niños incluidos en
este estudio, lo cual re±eja que en ellos, la cadena de
ADN sufrió rupturas que no pudieron ser reparadas.
Con relación a lo anterior, se ha reportado que
el rompimiento de la cadena de ADN tiene como
CUADRO II.
PORCENTAJE DE MN DE TIPO ANEUGÉNICO Y CLASTOGÉ-
NICO EN RET Y E DE SANGRE PERIFÉRICA DE LOS NIÑOS
INCLUIDOS EN EL ESTUDIO. NIÑOS BIEN NUTRIDOS (BN),
BIEN NUTRIDOS INFECTADOS (BNI), CON DESNUTRICIÓN
MODERADA (DESMI) Y GRAVE (DESGI) AMBOS CON IN-
²ECCIONES. PROMEDIO ³ ERROR ESTÁNDAR DE CADA
GRUPO DE ESTUDIO
Tipo de MN ( %)
BN
BNI
DESMI
DESGI
RET-MN-K+
(Aneugénico)
0.02 ³ 0.01
0.11 ³ 0 .04
0.03 ³ 0.04
0.13 ³ 0.04
RET-MN-K-
(Clastogénico)
99.9
99.8
99.97
99.87
E-MN-K+
(Aneugénico)
0.55 ³ 0.15
0.63 ³ 0.15
0.43 ³ 0.07
0.4 ³ 0.08
E-MN-K-
(Clastogénico)
99.45
99.37
99.57
99.6
Fig. 4. Porcentaje de RET y E que presentan MN de tipo
aneugénico (RET-MN-K+ y E-MN-K+) en muestras
de sangre periFérica de niños bien nutridos (BN), bien
nutridos infectados (BNI), con desnutrición moderada
e infecciones (DESMI) y con desnutrición grave e
infecciones (DESGI). Los datos son presentados como
promedio
³
error estándar. a) Porcentaje de RET-MN-
K+ para todos los grupos b) Porcentaje de E-MN-K+ en
los cuatro grupos de estudio. No se encontró diferencia
signifcativa p
> 0.05.
a)
b)
0.2
0.15
0.05
RET-MN-K+ (%)
0.1
0
0.02
0.03
0.13
0.11
BN
BNI
DESMI
DESGI
1
0.8
0.2
E-MN-K+
(%)
0.4
0.6
0
0.55
0.42
0.63
0.43
BN
BNI
DESMI
DESGI
E. Cervantes Ríos
et al.
32
consecuencia la formación de MN de tipo clasto-
génico (Fenech
et al.
2011, Luzhna
et al.
2013).
El rompimiento de la cadena de ADN podría estar
relacionado con la presencia de algunas ERO como
el hidroxilo (•OH) que es un radical muy reactivo y
que tiene la capacidad de abstraer átomos de hidró
-
geno de la molécula de ADN, así como de pegarse
a las bases formando aductos, lo que provoca una
diversidad de daños (Medeiros 2008). Cuando las
ERO se encuentran por encima de ciertos niveles,
el balance oxidantes/antioxidantes se pierde y es
entonces cuando algunas ERO pueden atacar al
ADN provocando su ruptura (Jain 2008). Como ya
se mencionó anteriormente, se ha reportado que en
organismos que padecen desnutrición, los sistemas
antioxidantes son poco efcientes (Granot
et al.
2004,
Jain
et al.
2008).
Los niños que se analizaron en este estudio pre
-
sentaban infecciones de tipo respiratorio o gastroin-
testinal (
Cuadro I)
. Con relación a esto, estudios
epidemiológicos han revelado que la mayoría de
las infecciones gastrointestinales de tipo bacteriano,
que padecen niños de países en vías de desarrollo,
son provocadas por
V. cholera
y
E. coli
(Rodríguez
et al.
2011). También se ha demostrado que estas
enterotoxinas interferen con la síntesis de proteínas
e inhiben la reparación del ADN (Brigotti
et al.
2002,
Sestili
et al.
2005).
También debe considerarse que el incremento en
la frecuencia de RET con MN de tipo clastogénico
(RET-MN-K-) en los grupos de estudio, podría deber-
se a la defciencia de ±olato, ya que se ha reportado
que esta condición es común en niños con desnutri
-
ción y que está asociada con diversas alteraciones
(Olivares
et al.
1992, Black
et al
. 2013). Previamente
se ha demostrado que su carencia, propicia la incor
-
poración de uracilo a la cadena de ADN, lo cual ge-
nera inestabilidad y favorece el rompimiento de esta
molécula, hecho que se ve re²ejado en la ±ormación
de MN de tipo clastogénico (MacGregor
et al
. 1997).
Esto ±ue demostrado por Fenech
et al
. (1999) quienes
reportaron que la defciencia de ácido ±ólico provoca
daño genético debido a rompimientos en la cadena
del ADN. Además, estudios recientes han establecido
la relación entre los niveles de folato y la formación
de MN ya que el folato es un importante componente
del grupo de las vitaminas B que participa en el ci-
clo de la homocisteína, del cual se libera S-adenosil
metionina, que es un importante donador de grupos
metilo para las ADN-metiltranferasas, y en ausencia
de esta molécula el estado de metilación de ADN
se verá afectado (Bull
et al
. 2012, Fuso 2013). De
igual ±orma se ha observado que la suplementación
de folato favorece una evidente disminución en el
daño al ADN y consecuentemente en la ±ormación
de MN (Lazalde
et al.
2012). Se ha demostrado que
en general, los organismos desnutridos presentan
defciencia de zinc (Brewster
et al.
1997), lo que
podría estar relacionado con la mayor frecuencia de
RET-MN-K- en sangre periférica observada en este
estudio. Otra posible causa podría ser la defciencia
de vitaminas C, E y D. Previamente se ha evidenciado
que la defciencia en estas vitaminas causa oxidación
del ADN, daño cromosómico y rompimiento de doble
cadena de ADN (Chatterjee 2001, Claycombe 2001,
Halliwell 2001).
Por otro lado, es importante mencionar que el en-
tendimiento de los mecanismos de inducción de MN
en organismos desnutridos es de gran relevancia ya
que ayudará a determinar qué vías están implicadas
en la formación de estas estructuras.
Es importante recalcar que la frecuencia basal de
MN en recién nacidos y niños es relativamente baja,
pero la susceptibilidad a daño al ADN en niños puede
incrementar la formación de MN si son expuestos a
agentes genotóxicos (Holland
et al.
2011). La habi
-
lidad para distinguir entre MN de tipo aneugénico y
clastogénico, permite dilucidar los mecanismos por
los cuales se formaron estas estructuras, lo cual a su
vez permite determinar el mecanismo de acción de
una gran cantidad de agentes genotóxicos.
Si bien el estudio de MN tiene gran aplicación en
el área de la mutagénesis, existen diversos aspectos
que no son del todo entendidos. No se sabe si los MN
que son reincorporados dentro del núcleo principal
pueden restaurar el genotipo completo de la célula
y si los MN pueden contribuir a la regulación de
la expresión genética. Tampoco se sabe cuál es el
mecanismo de degradación de un MN. Más aún, es
importante entender el papel de la epigenética en
la formación de MN. En este sentido, es necesario
seguir realizando estudios encaminados a entender,
la relación entre la desnutrición y los mecanismos
implicados en la generación de MN de tipo aneugé-
nico y clastogénico.
CONCLUSIONES
Los datos del presente estudio muestran que tanto
los niños con desnutrición moderada como grave
presentan una alta frecuencia de RET-MN en compa-
ración con los otros grupos de estudio, lo cual indica
que ambos grados de desnutrición se asocian con un
mayor daño al ADN. Este hecho está relacionado con
inestabilidad génica. Por otro lado, los MN formados
TIPO DE MICRONÚCLEOS EN NIÑOS CON DESNUTRICIÓN
33
en los niños incluidos en este estudio, son en su mayo
-
ría, de tipo clastogénico, lo cual está relacionado con
rompimiento de doble cadena de ADN, esto puede
estar favorecido por diversos factores, entre ellos el
estrés oxidante.
En general, se establece que los niños con des
-
nutrición experimentan inestabilidad génica, la cual
puede estar favorecida por diversos factores, entre
ellos, la presencia de infecciones, estrés oxidante y
defciencia de micronutrientes como el Folato y el
zinc. Es necesario realizar más estudios para determi-
nar si todos esos factores se encuentran involucrados
en la generación de MN.
AGRADECIMIENTOS
Se agradece a la beca otorgada por CONACyT
para estudios de Doctorado 18557. Apoyo PRO-
MEP/103.5/13/6732.
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