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Sistema de Información Científica
Red de Revistas Científicas de América Latina y el Caribe, España y Portugal
Rev. Int. Contam. Ambie. 30 (Número especial sobre ambiente y genética) 53-65
EL GEN
PIG-A
COMO INDICADOR DE MUTACIONES SOMÁTICAS
In vivo
Mercedes Monserrat PACHECO MARTÍNEZ
1
, Elsa CERVANTES RÍOS
2
,
María Del Carmen GARCÍA RODRÍGUEZ
3
y Alda Rocío ORTIZ MUÑIZ
2*
1
Programa de Posgrado en Biología Experimental,
Laboratorio de Biología Celular y Citometría de Flujo.
Universidad Autónoma Metropolitana Unidad Iztapalapa. Av. San Rafael Atlixco 186, Vicentina, 09340 Ciudad
de México, D.F.
2
Departamento de Ciencias de la Salud. Laboratorio de Biología Celular y Citometría de Flujo. Universidad
Autónoma Metropolitana Unidad Iztapalapa. Av. San Rafael Atlixco 186, Vicentina, 09340 Ciudad de México,
D.F.
3
Laboratorio de Antimutagénesis, Anticarcinogénesis y Antiteratogénesis. Unidad de Investigación en Gené-
tica (UNIGEN). Laboratorio 2 planta alta UMIEZ, campus 2. Facultad de Estudios Superiores “Zaragoza”.
Universidad Nacional Autónoma de México. Av. Guelatao 66, Ejército de Oriente, 09230 Ciudad de México,
D.F.
* Autor de correspondencia: arom@xanum.uam.mx
(Recibido noviembre 2013; aceptado septiembre 2014)
Palabras clave: Gen
PIG-A
/
Pig-a
, mutagénesis, reticulocitos, eritrocitos, citometría de fujo
RESUMEN
La medición cuantitativa de las mutaciones es fundamental en el campo de la mutagé-
nesis ambiental. Recientemente se han descrito nuevos métodos para su valoración y
para la evaluación de mutaciones inducidas por agentes químicos
in vivo
. Uno de ellos
está basado en el análisis del fenotipo relacionado con la expresión del gen fosfatidi-
linositol glicano de clase A (
PIG-A
en humanos y
Pig-a
en roedores). Este gen está
ligado al cromosoma X y es esencial para la síntesis del ancla glicosilfosfatidilinositol
(GPI) que une proteínas especíFcas a la superFcie de la célula. Cuando ocurre una
mutación en
PIG-A
, la síntesis de GPI se bloquea, esto provoca que las proteínas no se
encuentren en la membrana celular dando origen al fenotipo GPI negativo, el cual es de
±ácil detección por medio de citometría de fujo. En el presente trabajo se describe y se
realiza un análisis del ensayo
PIG-A
: su desarrollo, ventajas y desventajas así como su
validación. Asimismo, se reFeren las características que permiten proponer al
PIG-A
como centinela en estudios de mutagénesis y las perspectivas de estos estudios. Este
método presenta gran potencial para el estudio
in vivo
de las tasas de mutaciones somá-
ticas y su cinética de inducción por exposición a mutagénos. El ensayo tiene la ventaja
de ser práctico, mínimamente invasivo, relativamente económico y reproducible. Por
lo que resulta ser una herramienta adecuada para uso rutinario que puede integrarse a
otros análisis citogenéticos para detectar alteraciones cromosómicas y génicas. Además
puede ser útil en estudios de genotoxicología ambiental y en la evaluación genotóxica
de compuestos químicos.
Key words:
PIG-A
/
Pig-a
gene, mutagenesis, reticulocytes, erythrocytes, fow cytometry.
M.M. Pacheco Martínez
et al.
54
ABSTRACT
The quantitative measuring of somatic mutations is critical for the understanding of
environmental mutagenesis. New methods for its appraisal, as well as for the evaluation
of mutations induced by chemical agents
in vivo,
have been recently described. One
of them is based upon the analysis of the phenotype related to the expression of the
phosphatidylinositol glycan class A gene (
PIG-A
in humans and
Pig-a
in rodents). This
is an X-linked gene essential for the synthesis of glycosylphosphatidylinositol anchor
(GPI) that attaches specifc proteins to the cell surFace. When a
PIG-A
mutation takes
place, GPI synthesis is blocked; hence, proteins are not found on the cell membrane
generating a negative GPI phenotype, which can be easily detected by ±ow cytometry.
This paper describes and analyses a
PIG-A
assay: its development, advantages and
disadvantages as well as its validation. Likewise, this paper refers to the characteristics
that allow us to propose
PIG-A
as a sentinel in mutagenesis studies and the perspec-
tives of such studies. This method offers great potential for the
in vivo
study of somatic
mutation rates and their induction kinetics due to mutagen exposure. This assay poses
several advantages: it is practical, minimally invasive, cost-effective and reproducible.
Moreover, it can prove to be useful to study environmental genotoxicity and to evaluate
chemical compound genotoxicity.
INTRODUCCIÓN
Los estudios en el área de la toxicología genética
han generado numerosos procedimientos
in vivo
e
in vitro
, para monitorear los efectos que diversos
agentes físicos y químicos tienen sobre la integri-
dad genética, así como los posibles riesgos que
estos elementos representan para los organismos
(Abramsson
et al.
2000, Krishna y Hayashi 2000).
Entre los procedimientos se incluyen: la medición
de proteínas asociadas al ácido desoxirribonucleico
(ADN), la localización de mutaciones puntuales
(eventos. genéticos que aFectan un gen específco),
el estudio de intercambio de cromátidas hermanas,
aberraciones cromosómicas y micronúcleos (MN),
entre otros (Abramsson
et al
. 2000).
Recientemente, se ha propuesto como prueba ruti-
naria para evaluar el potencial mutagénico de agentes
químicos la detección de mutaciones somáticas usan-
do como gen centinela el “fosfatidilinositol glicano
de clase A” (
PIG-A
en humanos y
Pig-a
en roedores).
También se sugiere que puede ser útil para el estudio
de poblaciones humanas expuestas a contaminantes
ambientales y en animales de experimentación así
como para determinar el riesgo de desarrollar cáncer
(Hernández
et al
. 2008, Peruzzi
et al
. 2010, Dobro-
volsky
et al
. 2010, Dertinger
et al
. 2011b).
Existen pruebas basadas en la detección de mu-
taciones en otros genes como el de la enzima hipo-
xantina-guanina fosforribosiltransferasa (HPRT), que
detecta células resistentes a la 6-tioguania (mutantes).
Este método presenta restricciones para el análisis de
mutagénesis
in vivo
, ya que requiere de laboriosos
procedimientos para su detección y tiene una sensi-
bilidad limitada (Cortés 1993).
Por otra parte, el uso de animales transgénicos
como el ratón ”BigBlue” y el ”MutaMouse” ha sido
aplicado y aceptado como un modelo para el estudio
de mutaciones
in vivo
. Sin embargo, debido a su alto
costo y a que no son transferibles para la detección en
humanos, su uso es limitado (DH Toxicology Unit/
Secretariat 2010)
Dentro de los estudios de genotoxicidad
in vivo
de
uso rutinario, la alternativa más reportada ha sido el
análisis de la síntesis de ADN no programada (UDS),
aunque presenta baja sensibilidad (Kirkland y Speit
2008). La electroforesis unicelular (ensayo cometa)
también ha sido considerada, sin embargo, este mé-
todo sirve para evaluar daño primario en el ADN, el
cual no proporciona información consistente con la
inducción de mutaciones, ya que no todos los tipos de
daño en el ADN son igualmente mutagénicos (He±ich
et al
. 1982, Pottenger
et al
. 2007, Blakey
et al
. 2008).
Es importante medir la mutación de genes
in vivo
con la fnalidad de evaluar la seguridad genotóxica
con una mayor confabilidad.
PIG-A
ha sido iden-
tifcado como un gen con un alto potencial para el
estudio
in vivo
de las tasas de mutaciones somáticas
y su cinética de inducción por agentes químicos
(Dobrovolsky
et al
. 2010).
GEN
PIG-A
El nombre y símbolo ofcial de este gen es: “Fos
-
fatidilinositol glicano de clase A” (
PIG-A),
pertenece
EL GEN
PIG-A
EN EL ESTUDIO DE MUTACIONES
55
a una familia de genes llamados
PIG,
se localiza en
el brazo corto del cromosoma X (Takahaski
et al
.
1993, Rosee 1997, Tomita 1999, Phonethepswath
et al
. 2008). Codifca para la subunidad catalítica de
la enzima 1-6-N-acetilglucosaminiltransferasa que
participa en la primera etapa de la biosíntesis de la
molécula de anclaje glicosilfosfatidilinositol (GPI).
En la síntesis de esta ancla participan alrededor de
20 genes diferentes (Kinoshita
et al
. 1997, Ferguson
1999), de los cuales
PIG-A
es el único que se encuen-
tra en el cromosoma X.
Se ha demostrado que la enfermedad conocida
como hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN)
es resultado de mutaciones en
PIG-A
, las cuales se
presentan en las células troncales hematopoyéticas,
produciendo células sanguíneas anormales. Se han
identificado más de un centenar de mutaciones
somáticas en
PIG-A
. El gen contiene 6 exones y 5
intrones, el exón 2 es el más grande y en él ocurren
la mayoría de las mutaciones, las cuales
en general
consisten en la inserción de una señal de parada
prematura en las instrucciones para sintetizar el GPI,
originando una proteína anormalmente pequeña y no
funcional (Brodsky 2008, Genetics Home Reference
2013).
BIOSÍNTESIS DE GPI
GPI es un glicolípido que une diversas proteínas
a la membrana de la célula, asegurando que las mis-
mas se localicen en la superfcie celular cuando sean
necesarias (Takahaski
et al.
1993, Hernández-Campo
et al
. 2008). Su función principal es permitir una
asociación estable entre las proteínas y la membra-
na celular (Phonethepswath
et al
. 2008). Tiene una
estructura altamente conservada a lo largo de la evo-
lución. Consta de una molécula de fosfatidilinositol,
un núcleo glicano formado por N-glucosamina, 3 ma-
nosas, y una molécula de fosfoetanolamina (
Fig. 1
)
(Hernández-Campo
et al.
2008).
Su biosíntesis inicia en la cara externa del retículo
endoplásmico y se completa en la cara interna del
aparato de Golgi (Stevens y Raetz 1991). El primer
paso consiste en la formación del núcleo glicano y
está catalizado por una transferasa, la cual se encarga
de añadir una molécula de N-acetilglucosamina (pro-
veniente del uridindifosfato N-acetilglucosamina:
UDP-N acetil glucosamina) a la molécula de fosfa-
tidilinositol. Cuando existe una mutación en
PIG-A
la enzima 1-6-N-acetil-glucosaminil transferasa no
se sintetiza adecuadamente y la producción de
GPI
se bloquea (Takahashi
et al
. 1993).
Una vez sintetizada la molécula de GPI en el
retículo endoplásmico, ésta se une a las proteínas
nacientes por medio de una reacción mediada por
una transamidasa, durante la cual el extremo car-
boxilo terminal de la proteína que va a ser anclada
a la membrana, reacciona con el grupo amino de la
fosfoetanolamina (de Macedo
et al
. 2003).
= Fosfato (P)
P
= Glucosamina (GM)
= Inositol (In)
GN
In
Proteina
Eritrocitos humanos
Células nucleadas
a)
b)
Proteina
E
P
P
M
M
M
GN
In
= Etanolamina (E
)=
Manosa (M)
EM
E
P
P
M
M
M
GN
In
Fig. 1.
Estructura de la molécula GPI, modifcado de Kinoshita
2008.
La estructura básica del GPI consiste de: fosfatidil inosi-
tol (In) unido a tres (a) o a dos colas de ácidos grasos (b)
insertados en la membrana citoplásmica, una molécula
de glucosamina (GN) , tres manosas (M) y un puente de
etanolamina fosforilada (E), la cual sirve de unión para
la proteína anclada. En la fgura se ilustra la diFerencia en
la composición de las colas lipídicas unidas al fosfatidili-
nositol en células nucleadas y eritrocitos de mamíferos:
Las tres cadenas lipídicas debajo del fosfatidilinositol
en eritrocitos pueden hacer más estable su asociación
con la membrana. La unión a la membrana celular se
realiza a través de la molécula de fosfatidilinositol, que
se inserta en la bicapa lipídica mediante los ácidos grasos
situados en los carbonos 1 y 2 del glicerol. El primero de
ellos se une a través de un enlace éter, mientras que el
segundo suele ser un ácido graso altamente insaturado,
como el ácido araquidónico, que se une como radical
acilo (McConville
et al
. 1993). En los mamíferos hay un
tercer ácido graso, generalmente ácido palmítico, que se
une al inositol (Walter
et al
. 1990)
M.M. Pacheco Martínez
et al.
56
Estas proteínas unidas al GPI transitan por el
aparato de Golgi para llegar a su destino fnal en la
membrana plasmática. En estudios con linfocitos y
granulocitos provenientes de pacientes con HPN,
se demostró que el primer paso de la vía de síntesis
del GPI estaba afectado. Por medio de análisis bio-
químicos y citogenéticos, se determinó que en este
paso estaban involucrados tres genes:
PIG-A
PIG-C
y
PIG-H
, más tarde se demostró que las mutaciones
en
PIG-A
son las responsables de las anormalidades
descritas en la HPN (Yamada
et al.
1995).
PROTEÍNAS ANCLADAS A GPI
Las proteínas ancladas a través del GPI a la
membrana citoplasmática tienen un papel importante
en diferentes funciones celulares (McConville
et
al
. 1993). El hecho de que el núcleo estructural de
esta molécula se haya conservado a lo largo de la
evolución, evidencia su importancia biológica. GPI
se distribuye ampliamente entre los organismos eu-
cariotas, incluyendo protozoarios, hongos, plantas,
insectos y mamíferos (Nosjean
et al
. 1997).
Las proteínas ancladas por medio del GPI no
tienen una distribución uniforme en la membrana
citoplásmica, sino que se sitúan en microdominios
ricos en esfngolípidos y colesterol, denominados
balsas lipídicas o “rafts”
(Harder y Simons 1997),
el ancla GPI confere a las proteínas una elevada
movilidad lateral sobre la superfcie celular. Éstas
pueden inducir señales intracelulares en las que
intervienen segundos mensajeros (Orlean, 1990),
los cuales pueden promover la activación e incluso
la proliferación de células hematopoyéticas (Rob-
inson, 1991).
En términos generales hoy se sabe que las balsas
lipídicas están implicadas en procesos de señaliza-
ción celular (Bromley
et al
. 2001, Head
et al
. 2014),
circulación de proteínas intracelulares (Brown y Rose
1992) y endocitosis independiente de clatrina (Da-
nielsen y van Deurs 1995, Pike 2006). Hasta la fecha
se han identifcado numerosas proteínas que se unen
a la membrana celular por medio del GPI (
Cuadro I)
.
Entre ellas está CD59 que es una glucoproteína de
membrana que pesa de 18-20 kDa. Además de parti-
cipar en las vías de señalización en linfocitos, se ha
reportado que su función consiste en proteger a las
células sanguíneas y vasculares contra la lisis media-
da por proteínas séricas del complemento; inhibiendo
la formación de poros en la membrana, lo cual evita
la lisis celular (Sugita
et al
. 1989).
Pig-a / PIG-A:
GEN CENTINELA EN
MUTAGÉNESIS
Para que un gen sea considerado centinela, debe
cumplir con las siguientes características que permi-
ten medir la tasa de mutación:
CUADRO I.
FUNCIÓN Y LOCALIZACIÓN DE ALGUNAS DE LAS PROTEÍNAS ANCLADAS A GPI (MODIFICADO DE
PAULICK Y BERTOZZI, 2008)
Función
Proteína
Localización
Enzimas
Fosfatasa alcalina
Tejidos de mamíferos
5′-nucleotidasa
Tejidos de mamíferos
Acetilcolinesterasa
Células sanguíneas mamíferos
Dipeptidasa
Riñón y pulmón de cerdo, oveja y humano
Interacción célula-célula
LFA-3
Células sanguíneas humanas
NCAM
Mamíferos
PH-20
Espermatozoides de cobayo
Regulación del complemento
CD55 (DAF)
Células sanguíneas humanas
CD59
Células sanguíneas humanas
Antígenos de mamíferos
Thy-1
Cerebro y linfocitos de mamíferos
Qa-2
Linfocitos de ratón
CD14
Monocitos humanos
Antígeno carcino-embrionario (CEA)
Células tumorales humanas
CD52
Linfocitos humanos
Antígenos de protozoarios
VSG
Trypanosoma brucei
1G7
Trypanosoma cruzi
Prociclina
Trypanosoma brucei
EL GEN
PIG-A
EN EL ESTUDIO DE MUTACIONES
57
A) Las células mutantes deben ser el resultado
de una mutación única o monoalélica. El
PIG-A
se
encuentra en el cromosoma X, por lo tanto, sólo se
requiere una mutación para la expresión del fenotipo
mutante y éste no será enmascarado por la coexisten-
cia de un alelo normal (Peruzzi
et al
. 2010).
B) Las mutantes deben ser viables, esto es, que al
cultivarlas muestren un crecimiento equiparable al
de las células que no tienen mutaciones (Araten
et al
.
2005). Aunque es difícil demostrar que las mutacio-
nes en el
PIG-A
son neutrales, es decir, que no tienen
ventajas o desventajas en su viabilidad y proliferación,
existen evidencias de que no hay una selección negativa
contra las células mutantes, y por lo tanto, en cultivo su
crecimiento no se ve afectado. En este sentido, existen
estudios que han demostrado que las células GPI (-)
tienden a ser estables en la mayoría de los pacientes
con HPN por largos periodos de tiempo, incluso años
(Araten
et al
. 2002). Por otro lado, existen estudios
in
vitro
(en humanos) en los que se ha observado que las
colonias hematopoyéticas no exhiben selección que
favorezca a las células GPI (+) (Maciejewsk
et al
.
1997). Se ha demostrado que las subpoblaciones de
células GPI (+) y GPI (-) coexisten en proporciones
aproximadamente iguales, sin que una subpoblación
crezca más que la otra (Araten
et al
. 2005).
C) Los fenotipos mutantes deben ser fácilmente
detectables (Peruzzi
et al.
2010).
Dado que el produc-
to del
PIG-A
es una subunidad de la primera enzima
necesaria para la síntesis del GPI (Kinoshita
et al
.
2008), encargado de unir proteínas a la membrana
celular; las mutaciones que causan la pérdida de la
actividad de la enzima se pueden detectar por la falta
de esas proteínas. La ausencia de ellas ocasiona el
fenotipo GPI negativo (-) el cual se puede eviden-
ciar usando anticuerpos monoclonales; dentro de las
proteínas más estudiadas se encuentran la CD24,
CD59, CD55 y la CD48. El fenotipo GPI (-) se pue-
de identifcar por medio de citometría de Fujo, este
método permite un análisis rápido de la frecuencia
de mutantes y tiene el potencial para detectar bajas
tasas de mutación. Asimismo, se pueden analizar
múltiples proteínas en la misma célula, minimizando
así los “falsos negativos” y “falsos positivos” (Araten
et al
. 2005).
EVENTOS SIGNIFICATIVOS EN EL
DESARROLLO DE LA PRUEBA
Pig-a / PIG-A
A partir del año de 1999, Araten y su grupo de
colaboradores se dieron a la tarea de implementar
la técnica para detectar el fenotipo GPI (-) usando
citometría de Fujo. Con el establecimiento de este
método se desarrollaron diversos estudios que en-
tre otras cosas, permitieron identifcar mutaciones
espontáneas, determinar valores de referencia para
medir la frecuencia de células mutantes y la tasa de
mutación. De igual forma se comenzó a evaluar el
efecto mutagénico de agentes químicos como etil-
N-nitrosourea (ENU) y dimetil-1,2-benzantraceno
(DMBA) siguiendo diferentes esquemas de admi-
nistración (Bryce
et al
. 2008). Un avance importante
consistió en la aplicación del método en diferentes
modelos celulares y animales y por otro lado se in-
crementó la confabilidad del ensayo mediante el uso
de anticuerpos para identifcar eritrocitos. Además se
logró aislar células T de animales tratados con ENU,
usando la selección por aerolisina; ásta es una molé-
cula que lisa las células GPI (+) y permite seleccionar
linfocitos T GPI (-) (Dobrovolsky
et al
. 2009a).
En el
cuadro II
se muestra un resumen de los
estudios realizados por diversos grupos de trabajo y
se hace referencia a los eventos más importantes en
el desarrollo de esta técnica.
MEDICIÓN DE LAS FRECUENCIAS DE
MUTANTES
Pig-a / PIG-A
A pesar de que este gen se expresa de forma
generalizada en las células, la selección de un tipo
celular para su análisis no fue sencilla. La experiencia
y el éxito del ensayo con células sanguíneas de los
pacientes con HPN han orientado el desarrollo de la
experimentación (DH Toxicology Unit/Secretariat
2010).
Se ha logrado determinar efectivamente la tasa
de la mutación en cultivos celulares y en modelos
in
vivo
. En el
cuadro III
se muestran las frecuencias
que han sido reportadas con diferentes protocolos.
La incidencia de mutantes
Pig-a,
se puede expresar
como el número de CD59 negativos (-)/10
–6
en eri-
trocitos maduros (E) o reticulocitos (RET). Se han
observado incrementos en la frecuencia de mutantes
en ambos tipos celulares después de una semana
de la administración del mutágeno y las respuestas
máximas se presentaron aproximadamente en la
semana 4. La frecuencia de mutación por lo general
es mayor en RET.
Los resultados de la evaluación de diferentes
agentes químicos evidenciaron que el ensayo
Pig-a
es pertinente para la identifcación de mutaciones
in vivo
, y tiene claras ventajas para ser incorporado
como un estudio de rutina; las muestras de sangre se
pueden obtener fácilmente, de manera continua y sólo
M.M. Pacheco Martínez
et al.
58
se requieren pequeñas cantidades (Bryce
et al
. 2008).
Además no es invasivo y es transferible al humano,
de modo que también es posible su aplicación en
estudios de epidemiología. (DH Toxicology Unit/
Secretariat 2010).
VALIDACIÓN DEL ENSAYO
Pig-a / PIG-A
Dado que esta prueba es de reciente implementa-
ción, se han desarrollado guías, documentos y otros
reportes encaminados a regular las condiciones en
las cuales se deben realizar los estudios, así como a
unifcar criterios para el reporte de datos, el manejo
estadístico y su interpretación (Bryce
et al.
2008,
Dertinger
et al.
2014).
Para lograr este objetivo, diversos laboratorios
están involucrados en la validación del ensayo y se
están enfocando en: (1) evaluar su reproducibilidad,
(2) estudiar agentes mutagénicos y no mutagénicos,
(3) llegar a un acuerdo para el análisis estadístico de
los resultados, (4) secuenciar el ADN para establecer
de manera frme la relación entre la defciencia en
la expresión del GPI y la mutación en el gen
Pig-
a
, (5) evaluar que el ensayo sea reproducible con
reticulocitos en diferentes especies y (6) determinar
CUADRO II.
EVENTOS SIGNIFICATIVOS EN EL
DESARROLLO DEL ENSAYO
Pig-a / PIG-A
Modelo celular
Especie
Enfoque principal
Resultado principal
Referencia
Células sanguíneas,
granulocitos
Humano
Desarrollo de la técnica para
identifcar células GPI (-) por
citometría de Fujo
Los granulocitos y células san-
guíneas GPI (-) están presentes en
personas sanas
Araten
et al
. 1999
Línea celular de
ovario
Hámster
chino
Uso del fenotipo GPI (-)
para identifcar mutaciones
espontáneas
Las mutaciones inducidas por
sustancias genotóxicas pueden ser
medidas de manera rápida y sen-
sible mediante citometría de Fujo
Ross
et al.
2005
Líneas celulares y
células sanguíneas de
pacientes HPN
Humano
Establecimiento del méto-
do para determinar valores
normales de la frecuencia de
mutantes y tasa de mutación
(μ)
Se determinaron valores de
referencia
Araten
et al.
2005
Células sanguíneas
Rata
Determinación del efec-
to mutagénico de ENU y
DMBA
Determinación de susceptibilidad
génica
Bryce
et al
. 2008
Células T de bazo
Rata
Aislamiento de células T de
animales tratados con ENU,
usando la selección por
aerolisina
Identifcación de mutantes
PIG-a
en células T CD48 (-)
Miura
et al
. 2008b
Células sanguíneas
Ratón
Aplicación de la técnica en
ratones
Aumento de la frecuencia de
células sanguíneas CD59 (-)
después de administración de
ENU o DMBA
Phonethepswath
et al.
2008
Células sanguíneas,
células T
Macaca
mulatta
Utilización de la técnica en
primates
Incremento en el número de
CD59 (-) y de células T resisten-
tes a aerolisina después de admi-
nistración de
ENU; se encuentra
correlación con los datos obteni-
dos por HPRT
Dobrovolsky
et al.
2009
Células sanguíneas
Rata
Aumento de la confabilidad
del ensayo mediante el uso
de anticuerpos específcos
dirigidos contra eritrocitos
Se determina que el metilfenidato
es un agente no mutagénico
Dobrovolsky
et al
. 2009
Células sanguíneas
Rata
Efectos de los diferentes
esquemas de administración
de mutágenos
Dosis pequeñas y repetitivas de
ENU, tienen un efecto similar a
una dosis alta de ENU
Miura
et al
. 2009
EL GEN
PIG-A
EN EL ESTUDIO DE MUTACIONES
59
si puede ser usado para estudiar mutaciones en cé-
lulas no eritroides como por ejemplo, en hepatocitos
(Dertinger
et al
. 2014).
Se realizó un estudio de colaboración interna-
cional, en 14 laboratorios para evaluar la reprodu-
cibilidad del ensayo de mutación
in vivo
basado en
el conteo de eritrocitos de rata CD59 (-). Se utilizó
el anticuerpo anti CD59, el colorante SYTO 13, y
la citometría de fujo. El objetivo Fue proporcionar
un intervalo de frecuencias del fenotipo mutante, se
usaron ratas macho expuestas a ENU a través de una
sonda nasogástrica por tres días consecutivos (días
1-3). Cada laboratorio administró 0, 20, y 40 mg de
ENU/kg/día (n=5 por grupo). Se siguió un protocolo
establecido para el procesamiento y la adquisición de
la muestra así como para la recopilación de datos.
Los resultados de este estudio demostraron que la
metodología es reproducible, ya que éstos fueron
similares entre los diferentes laboratorios (Dertinger
et al
. 2011a).
Este estudio representó el primer paso en la eva-
luación sistemática de las virtudes y limitaciones
del método (OECD, 2005). Como parte de la Etapa
III
de validación, se llevaron a cabo estudios de
genotoxicidad en ratas tratadas con benzo (a) pireno
(BaP). Los resultados obtenidos mostraron aumentos
en las frecuencias de mutantes relacionados con la
dosis y el tiempo. Las respuestas de los RET fueron
mayores que las de los E. Los resultados indican que
las células eritroides son un buen modelo de estudio
y apoyan su integración en estudios de mutación
genética (Bhalli
et al
. 2011).
El Instituto de Salud y de Ciencias Ambienta-
les (HESI, por sus siglas en inglés) y el Instituto
CUADRO III.
±RECUENCIAS BASALES E INDUCIDAS DE CÉLULAS MUTANTES OBTENIDAS CON DI±ERENTES
PROTOCOLOS DE ADMINISTRACIÓN DE MUTÁGENOS Y TINCIÓN DE LAS MUESTRAS.
Mutágeno
Dosis
Modelo
Marcadores y
anticuerpos
Frecuencia de
mutación en
testigos
Frecuencia de mutación
después de la exposición
a mutágeno
Referencia
ENU
120 mg/kg) vía
intraperitoneal
(i.p.)
Sangre periférica
de ratas macho
cepa F344
anti
CD59 FLAER
1 a 27 × 10
–6
183 × 10
–6
(semana 2)
329-413 × 10
–6
(semana 4)
Miura
et al
.
2008a
Células T de ratas
macho cepa F344
anti
CD48 FLAER
11-16 × 10
–6
194-473 × 10
–6
(semana 4)
ENU
100 mg/kg/día i.p
Sangre periférica
de hembras cepa
Sprague Dawley
anti CD59 anti
CD61 Naranja de
Tiazol
18 ± 19 × 10
–6
239 a 855 × 10
–6
(semana 4-6)
Bryce
et al
.
2008
DMBA
40 mg/kg/día
vía oral
anti CD59 anti
CD61 Naranja de
Tiazol
18 ± 19 × 10
–6
82 a 405 × 10
–6
(semana 4-6)
ENU
40 mg/kg,
por triplicado
Sangre periférica
de ratones
hembra cepa CD-1
anti CD24
14 ± 21 × 10
–6
500 ± 287 × 10
–6
(semana 5)
Phonethswath
et al.
2008
DMBA
75 mg/kg por
triplicado
14 ± 21 × 10
–6
133 × 10
–6
(semana 5)
ENU
8.9, 35.6 y
142.4 mg/kg
vía oral
Sangre
periférica de
ratas macho
Cepa F344
anti CD59
anti CD45
3.9 a 21.4 ×10
–6
57.3, 171.7 y
624.6 × 10
–6
para
8.9, 35.6 y 142.4
mg/kg,
respectivamente
Miura
et al
.
2009
ENU
40 mg/kg i.p.
Sangre periférica
de
Macaca
mulatta
anti CD59 anti
CD45
7.8 ± 4.2 × 10
–6
46.5 × 10
–6
Dobrovolsky
et al
. 2009
N-metil-n-
Nitro-
sourea
(MNU)
15 y 30 mg/kg
Sangre
periférica de
ratas macho cepa
Wistar
anti CD59
SYTO13
1.3 a 5.1 × 10
–6
215 ± 85 × 10
–6
(semana 4)
Phonethepsw
ath
et al
.
2010
M.M. Pacheco Martínez
et al.
60
Internacional de Ciencias de la Vida (ILSI, por sus
siglas en inglés), integraron un comité para valorar
la utilidad potencial del modelo de evaluación mu-
tacional
in vivo
, (Etapa IV). Este grupo de expertos
llegó a la conclusión de que el
Pig-A
es adecuado
para evaluar mutagenicidad
in vivo
, ya sea como un
estudio independiente o integrado en los estudios
de toxicología de dosis repetidas, lo que apoya aún
más la validación del modelo (Schuler
et al.
2011).
VENTAJAS Y DESVENTAJAS DEL ENSAYO
Pig-a / PIG-A
Permite evaluar productos y tomar decisiones
regulatorias, ya que mide la inducción de mutaciones
en un determinado gen en lugar de medir sólo el daño
primario en el ADN. Otros análisis de mutación de
genes
in vivo
tienen la desventaja de ser costosos
y necesitan tiempos prolongados, además de que
requieren el uso de animales transgénicos.
Las características básicas que dan solidez a este
ensayo son:
1. Se integra fácilmente en los estudios de toxicidad
estándar.
2. Sustituye el uso de costosos roedores especiali-
zados.
3. Los resultados se obtienen el mismo día y en
cuestión de horas.
4. Se puede usar en distintos tipos celulares inclu-
yendo los linfocitos.
5. Es rentable y práctico.
6. El gen se encuentra localizado en el cromosoma
X por lo que hombres y mujeres tienen sólo
una copia funcional. A diferencia de los genes
autosómicos con dos alelos, sólo se requiere un
único evento de mutación para afectar la función
del gen y producir el fenotipo característico.
Hasta el momento el ensayo se ha probado am-
pliamente en células sanguíneas y en líneas celula-
res linfoblastoides. En el análisis de resultados de
estos estudios hay que considerar las características
del sistema hematopoyético; ya que a partir de un
análisis de células sanguíneas maduras GPI (-), no
es posible saber en qué etapa ocurrió la mutación,
puesto que se puede producir en una célula troncal
hematopoyética multipotencial, o en células proge-
nitoras (Dingli
et al
. 2008, Miura
et al
. 2009). En
algunos casos, esta situación se puede inferir a partir
de la cinética del número de células mutantes: por
ejemplo, si después de una sola dosis de mutágeno
hay un marcado aumento en la frecuencia de mu-
tantes, y éste se mantiene durante varios meses, es
razonable suponer que la mutación ha tenido lugar
en una célula troncal hematopoyética (Araten
et al
.
1999). Este evento originará muchas más células
maduras mutantes, que una mutación que ha tenido
lugar en un eritrobalsto, y esto afectará el recuento
de células mutantes en la sangre periférica.
En el
cuadro IV
se muestran las fortalezas y
debilidades de los estudios efectuados con citome-
tría de fujo para integrar al
PIG-A
como prueba
CUADRO IV.
FORTALEZAS Y DEBILIDADES DEL ENSAYO
Pig-a
USANDO CITOMETRÍA DE FLUJO
Fortalezas
Debilidades
Se realiza en diferentes especies y tipos celulares.
La mayoría de los datos publicados están en E y RET de rata,
sin embargo también existen reportes en los que se usan otros
tipos celulares.
Se obtienen datos en pocas horas y no se requieren cultivos
celulares.
Se requiere un equipo relativamente caro y experiencia en su
uso.
Es sensible, detecta frecuencias bajas de mutantes basales
(<5×10
–6
en E y RET de roedores).
Los análisis en E son rápidos, sin embargo en RET se requiere
más tiempo (15 minutos)
Para el análisis con RET y E se requiere de un volumen pequeño
de sangre periférica (50 µL), lo que hace posible el muestreo
repetitivo en roedores.
Los ensayos con leucocitos de roedores requieren sacriFcar el
animal para obtener un número suFciente de células.
Los análisis con RET o E, permiten hacer estudios de exposición
crónica y subcrónica y dar seguimiento en los mismos animales,
por periodos largos de tiempo.
Los ensayos realizados con E y RET de mamíferos no permiten
la caracterización del genotipo.
La mayoría de los reactivos están disponibles en el mercado y se
están estandarizando los protocolos.
Se requiere continuar los estudios para evaluar la sensibilidad y
especiFcidad del ensayo
EL GEN
PIG-A
EN EL ESTUDIO DE MUTACIONES
61
reglamentaria en el campo de la toxicología (Dobro-
volsky
et al
. 2010).
PERSPECTIVAS DEL ENSAYO
Este método cumple el objetivo principal de las
pruebas de reglamentación de toxicidad genética, al
evaluar la mutación genética en lugar del daño en el
ADN. El estudio basado en el análisis de E y RET
por citometría de fujo es rápido, relativamente Fácil
de realizar, económico y práctico. Se ha evidenciado
que puede utilizarse para medir toxicidad crónica y
subcrónica sin alterar otros criterios de valoración,
como por ejemplo el metabolismo de fármacos.
(Dertinger
et al
. 2010). Debido a que la cinética de
manifestación de mutantes es relativamente rápida,
los análisis llevados a cabo en RET, son los más úti-
les para la mayoría de las aplicaciones reguladoras.
Un inconveniente al trabajar con eritrocitos de
mamíferos es que al carecer de núcleo ya no es posi-
ble ubicar la mutación. Por lo anterior se ha propuesto
también analizar células nucleadas (Dobrovolsky
et
al
. 2010).
Es necesario seguir trabajando a nivel molecular
para relacionar la ausencia de CD59 con los cambios
moleculares en el
PIG-A
. También es importante eva-
luar la sensibilidad y especi±cidad del ensayo, para lo
cual se propone probar mutágenos débiles y no mutá-
genos, así como optimizar el diseño de estos estudios.
EL ENSAYO
Pig-a
EN MÉXICO
En 2012, en el laboratorio de Biología Celular y
Citometría de Flujo de la Universidad Autónoma Me-
tropolitana, Unidad Iztapalapa, se empleó por primera
vez el protocolo descrito por Phonethepswath
et al.
(2010) para la evaluación de mutaciones somáticas
in
vivo
, por medio del
Pig-a
. Se utilizó sangre periférica
de ratas macho de la cepa Wistar de 14 días de edad,
que fueron expuestas al mutágeno ENU en dosis de 30
y 60 mg/kg de peso. Se efectuó la tinción diferencial de
reticulocitos y eritrocitos maduros usando SYTO 13 y
el anticuerpo (anti CD59) para identi±car el Fenotipo
CD59 (-). Las frecuencias de mutantes
Pig-a
fueron
analizadas en un millón de células (Pacheco 2012).
La frecuencia basal de RET mutantes (RET-
MUT) fue 5-10×10
–6
y de E mutantes (E-MUT) fue
de 1-4×10
–6
. Después de la administración de ENU
las Frecuencias aumentaron signi±cativamente de
acuerdo con la dosis administrada. En la semana 8 (56
días de edad) las frecuencias para RET-MUT fueron
448-469×10
–6
con la
dosis de 30 mg y 586-
650×10
–6
con la dosis de 60 mg. Para E-MUT las
frecuencias fueron de 319-353×10
–6
(dosis 30 mg)
y 500-555×10
–6
(dosis 60 mg). En la
fgura 2
, se
muestran las grá±cas de puntos de
los resultados
obtenidos.
En México el ensayo
Pig-a
se introdujo recien-
temente
como método de evaluación genotóxica.
Nuestra experiencia muestra que es una herramienta
que permite analizar el daño génico
,
en las muestras
de sangre periférica de ratas jóvenes (Pacheco 2012).
Protocolo básico para evaluación de la frecuencia
de mutaciones
Pig-a
en eritrocitos
Para la valoración de agentes químicos
in vivo
en roedores (rata cepas Wistar, Sprague Dawley y
Ficher 344 y ratones CD-1) se recomienda una n=6
en los siguientes grupos:
Grupo testigo (administrado con el vehículo).
Grupo experimental 1 (administrado con una dosis
baja del agente a evaluar).
Grupo experimental 2 (administrado con una dosis
media del agente a evaluar).
Grupo experimental 3 (administrado con una dosis
alta del agente a evaluar).
La elección de las dosis depende del tipo de agente
que se pretende evaluar; la vía de administración más
común es la oral.
Se sugiere que los tiempos de monitoreo de la
frecuencia de mutantes sean prolongados (de 6-8
semanas después de la administración del agente
químico).
La tinción de las muestras requiere de anticuerpos
conjugados con fuorocromos para identi±car a las
proteínas CD24, CD55 o CD59 y para diferenciar
entre RET y E se propone emplear SYTO 13. Para la
adquisición de las muestras los modelos de citómetro
más usados son: FacsCalibur, FacsCanto y FacsDiva.
De acuerdo con Dobrovolsky
et al
. (2010), el tiem-
po estimado para realizar el ensayo es de 3-6 horas.
Comparando el tiempo e implícitamente el costo
del
Pig-a
, con los ensayos transgénicos, estos últimos
requieren 2 o más días y si se compara con HPRT, este
método demora 2 semanas para la obtención de resul-
tados. La prueba
Pig-a
tiene la ventaja de ser rápida
al obtener resultados en un tiempo de alrededor de 6
horas. Si se cuenta con un citómetro de fujo, el costo
es relativamente accesible, ya que sólo se requiere de
anticuerpos y colorantes de ácidos nucleicos.
La experiencia colectiva y la propia han eviden-
ciado que el ensayo de mutación
in vivo
Pig-a
tiene
M.M. Pacheco Martínez
et al.
62
gran potencial para identifcar Frecuencias de mutantes
con dosis bajas y altas de agentes mutagénicos de ac-
ción directa. Sin duda alguna es una herramienta útil
que puede complementar otros estudios citogenéticos.
AGRADECIMIENTOS
Beca CONACyT para estudios de Posgrado No.
de apoyo: 351641. Apoyo del Programa para el Mejo-
ramiento del Profesorado, PROMEP/103.5/13/6732.
Apoyo del CONACyT, proyecto Ciencia Básica.
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A:
frecuencia
de RET-MUT en la semana 2, después de la administración de ENU.
B:
inducción de mutantes RET-MUT en la semana
8.
C:
frecuencia de E-MUT en la semana 2 y
D:
frecuencia de E-MUT en la semana 8. Las frecuencias se calcularon por
millón de células.
Ret-Mut
600
A
400
200
0
Testigo
ENU 30 mg
ENU 60 mg
Semana 2
No. de Ret mutantes por millón de células
Ret-Mut
1000
B
600
400
800
200
0
Testigo
ENU 30 mg
ENU 60 mg
Semana 8
No. de Ret mutantes por millón de células
E-Mut
600
C
400
200
0
Testigo
ENU 30 mg
ENU 60 mg
Semana 2
No. de E mutantes por millón de células
No. de E mutantes por millón de células
E-Mut
1000
D
600
400
800
200
0
Testigo
ENU 30 mg
ENU 60 mg
Semana 8
EL GEN
PIG-A
EN EL ESTUDIO DE MUTACIONES
63
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