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Sistema de Información Científica
Red de Revistas Científicas de América Latina y el Caribe, España y Portugal
Rev. Int. Contam. Ambie. 31 (1) 23-37, 2015
TOLERANCIA DE HONGOS FILAMENTOSOS A ENDOSULFÁN, CLORPIRIFÓS Y
CLOROTALONIL EN CONDICIONES
in vitro
Katina STAMATIU-SÁNCHEZ
1
, Alejandro ALARCÓN
2
*, Ronald FERRERA-CERRATO
2
,
Cristian NAVA-DÍAZ
3
, Julio SÁNCHEZ-ESCUDERO
4
, Jesús Samuel CRUZ-SÁNCHEZ
5
y
María del Pilar CASTILLO
6
1
Área de Entomología, Postgrado en Fitosanidad, Campus Montecillo, Colegio de Postgraduados, Carretera
México-Texcoco Km. 36.5, Montecillo, Texcoco, Estado de México, México, C.P. 56230
2
Área de Microbiología, Postgrado de Edafología, Campus Montecillo, Colegio de Postgraduados, Carretera
México-Texcoco Km. 36.5, Montecillo, Texcoco, Estado de México, México. C.P. 56230
3
Área de Fitopatología, Postgrado en Fitosanidad. Campus Montecillo. Colegio de Postgraduados. Carretera
México-Texcoco Km. 36.5, Montecillo, Texcoco, Estado de México, México, C.P. 56230
4
Área de Agroecología, Postgrado en Fitosanidad, Campus Montecillo, Colegio de Postgraduados, Carretera
México-Texcoco Km. 36.5, Montecillo, Texcoco, Estado de México, México, C.P. 56230
5
Unidad de Servicios de Apoyo en Resolución Analítica (SARA), Universidad Veracruzana, Luis Castelazo
S/N, Industrial Las Animas, Xalapa, Veracruz, México C.P. 91190
6
Swedish Institute of Agricultural and Environmental Engineering (JTI). Box 7033 | S-750 07 Uppsala, Suecia
* Autor de correspondencia: aalarconcp@gmail.com
(Recibido septiembre de 2013; aceptado septiembre 2014)
Palabras clave: plaguicidas, insecticida organoclorado, insecticida organofosforado, fungicida policlorado,
crecimiento fúngico, inhibición fúngica
RESUMEN
Los plaguicidas endosulfán (EN), clorpirifós (CRP) y clorotalonil (CTL) están cata-
logados como carcinógenos y persistentes en el ambiente, por lo que deben tomarse
medidas efcientes de biorremediación para su degradación. Los hongos
Phanerochaete
chrysosporium
(PC),
Trametes versicolor
(TV) y algunas especies de
Trichoderma
(TRI),
Mucor
,
Fusarium
y
Penicillium
pueden degradar plaguicidas. En la presente
investigación se aislaron y purifcaron siete cepas de hongos a partir de suelo agrícola,
paja molida de trigo y trozos de paja de trigo. Las siete cepas fúngicas aisladas y tres
cepas de referencia (PC, TV y TRI) se colocaron por triplicado, en cajas de Petri con un
medio mínimo mineral contaminado con dosis crecientes de EN, CRP y CTL durante
18 días. Diariamente se midió el desarrollo micelial (DM) y se calculó el porcentaje de
inhibición del desarrollo (PID). Los tres plaguicidas tuvieron un efecto adverso sobre el
DM, en el que se observó una recuperación paulatina después de 72 h ante EN y CRP,
mientras que CTL inhibió signifcativamente (P < 0.0001) el DM de la mayoría de las
cepas durante los 18 días. En presencia de EN, las cepas K14S, PC, TV y TRI se recu-
peraron totalmente a los 18 días. Ante CRP, todas las cepas mostraron recuperación del
DM desde el día 10. El fungicida (CTL) mostró los mayores PID, pero las cepas K8S,
K14S, K11TP, PC y TV mostraron recuperación. Los aislamientos K12P, K8S, K14S,
K11TP y las cepas de referencia PC, TV y TRI presentaron tolerancia a los plaguicidas
en estudio por lo que pudieran ser consideradas para la biorremediación de plaguicidas.
K. Stamatiu-Sánchez
et al.
24
Key words: pesticides, chlorinated insecticide, organophosphate insecticide, polychlorinated fungicide, fungal
growth, fungal inhibition
ABSTRACT
Endosulfan (EN), chlorpyrifos (CRP) and chlorothalonil (CTL) are carcinogenic and
toxic pesticides in the environment, by which bioremediation efFcient actions must be
directed for detoxifying contaminated systems. Fungi such as
Phanerochaete chrysospo-
rium
(PC),
Trametes versicolor
(TV) and some species of
Trichoderma
(TRI),
Mucor
,
Fusarium
and
Penicillium
are able to degrade pesticides. Seven fungal strains were
isolated from agricultural soil, wheat straw, and wheat straw pieces. The seven fungal
strains as well as three referential fungi (PC, TV and TRI) were cultivated by triplicate
in Petri dishes with minimal mineral medium contaminated with increased doses of
EN, CRP or CTL for 18 days. The mycelial growth (MG) and the percentage of growth
inhibition (PGI) were determined. The three pesticides negatively affected the MG, but
the fungal recovery was observed after 72 h for EN and CRP. At 18 days, strains K14S,
PC, TV and TRI showed total recovery when exposed to EN. In contrast, all fungal
strains showed a recovery to CRP at the 10th day. The MG for most fungal strains was
signiFcantly inhibited (P < 0.0001) due to during CTL at 18 days. The fungicide CTL
resulted in highest PGI, but strains K8S, K14S, K11TP, PC and TV were less affected.
The fungal strains K12P, K8S, K14S, and K11TP showed acceptable tolerance to the
three pesticides comparable to PC, TV and TRI. These four fungal strains are good
candidates for being used for pesticide bioremediation.
INTRODUCCIÓN
Las actividades agrícolas, el uso excesivo y las
malas prácticas del manejo de plaguicidas durante
la producción agrícola han llevado a la acumulación
y a la contaminación de todos los ambientes por
plaguicidas debido a su dispersión, lixiviación y vo-
latilización (Linde 1994, Arias-Estévez
et al
. 2008),
por lo que son un riesgo para la salud humana y otros
organismos (Bohmont 2007). El endosulfán es un in-
secticida organoclorado del grupo de los ciclodienos
catalogado como carcinógeno, es de amplio uso en el
sector agrícola, su metabolito el endosulfán sulfato,
es más tóxico y persistente que la molécula parental
(Greene y Pohanish 2005, Jayashree y Vasudevan
2007). Por otro lado, el insecticida organofosforado
clorpirifós es ampliamente usado para controlar pla-
gas de importancia agrícola, humana y veterinaria,
su persistencia es de hasta 120 días y está catalogado
como carcinógeno y disruptor endócrino (Singh
et
al
. 2006). Finalmente, el clorotalonil es un fungicida
de contacto y amplio espectro utilizado en diversos
cultivos, tiene una vida media de hasta 90 días y está
catalogado como un compuesto carcinógeno (Greene
y Pohanish 2005).
Para remediar los problemas de contaminación
por plaguicidas en condiciones
in situ
, se han de-
sarrollado técnicas de biorremediación mediante la
selección y uso de microorganismos capaces de tole-
rar y degradar contaminantes. Los hongos degrada-
dores de residuos ligninocelulósicos pueden degradar
diversos contaminantes mediante la secreción de en-
zimas (Maloney 2001). Hongos ligninolíticos como
Phanerochaete chrysosporium
y
Trametes versicolor,
entre otros, son capaces de degradar hidrocarburos
del petróleo y plaguicidas (Adam-Ali y Wainwrigth
1994, Kim
et al
. 2001, Jáuregui
et al
. 2003, Matsuba-
ra
et al
. 2006). Además, los hongos no ligninolíticos
como
Aspergillus
,
Fusarium
,
Mucor
,
Penicillium
y
Trichoderma
son tolerantes y degradadores de
plaguicidas e hidrocarburos (Mitra
et al
. 2001, Dan
et al
. 2006, Kim y Lee 2007, Sagar y Singh 2011,
Argumedo-Delira
et al
. 2012).
El conocimiento de la capacidad de los microor-
ganismos para degradar plaguicidas en campo ha
permitido implementar sistemas de biorremediación
in situ
conocidos como biocamas (BD, por sus siglas
en inglés). Estos sistemas están conformados por
mezclas de residuos vegetales, turba o composta y
suelo, y para su preparación se colocan a 60 cm de
profundidad con el Fn de minimizar la contaminación
por plaguicidas en zonas agrícolas o industriales
(Torstensson 2000, Castillo
et al
. 2008, Karanasios
et
al
. 2010, Karanasios
et al
. 2012, Omirou
et al
. 2012,
Urrutia
et al
. 2013). Para aumentar la capacidad y
la velocidad de degradación de plaguicidas en las
HONGOS FILAMENTOSOS TOLERANTES A PLAGUICIDAS
25
BD, se busca favorecer el desarrollo o la inocula-
ción (bioaumentación) de hongos ligninolíticos. Sin
embargo, el potencial de estos hongos puede ser in-
hibido por la rápida invasión y competencia de otros
microorganismos presentes en los diferentes sustratos
utilizados en las BD (Karanasios
et al
. 2012). Una
alternativa es la adición de suelo o microorganismos
capaces de degradar plaguicidas (Önneby
et al
. 2010,
Karanasios
et al
. 2012).
Este trabajo consistió en seleccionar hongos aisla-
dos de paja de trigo y de suelo agrícola con capacidad
de tolerar endosulfán, clorpirifós y clorotalonil, como
parte inicial de la búsqueda de hongos degradadores
de plaguicidas para utilizarlos en procesos de bio-
rremediación.
MATERIALES Y MÉTODOS
Plaguicidas y cepas de referencia.
Los plagui-
cidas utilizados correspondieron a formulaciones
grado técnico. El endosulfán (98 % pureza) fue do-
nado por Bayer Cropscience, México S.A. de C.V.,
el clorpirifós (98 % pureza) por Dow-AgroSciences
de México S.A. de C.V. y el clorotalonil (98.8 %
pureza) por Syngenta Agro S.A. de C.V. Las cepas
de referencia
Phanerochaete chrysosporium
cepa
CDBBh-298 (PC) y
Trametes versicolor
(TV) son
hongos ligninolíticos donados por la Dra. Refugio
Rodríguez del Centro de Investigación y de Estudios
Avanzados del Instituto Politécnico Nacional. La
cepa de
Trichoderma koningii
(Tri23) proviene del
cepario microbiano del Área de Microbiología del
Colegio de Postgraduados y aunque no es un hongo
ligninolítico, es tolerante al petróleo crudo y a los
hidrocarburos poliaromáticos (HPA) (Argumedo-
Delira
et al
. 2012).
Aislamiento y selección de hongos flamentosos.
Las siete cepas de hongos flamentosos consideradas
en el presente trabajo fueron aisladas de suelo agrí-
cola, paja molida de trigo y trozos de paja de trigo
provenientes del municipio de Silao, en Guanajuato,
México (Stamatiu-Sánchez 2013). El crecimiento
fúngico fue reactivado con el método de extensión
superfcial (Ramírez-Gama
et al
. 1998) en un medio
de papa dextrosa agar (PDA, Merck
®
). Las cepas
fueron seleccionadas mediante ensayos preliminares
(Stamatiu-Sánchez 2013) con base en su crecimiento
en un medio de cultivo enriquecido con endosulfán
< 1000 mg/kg, lo que sobrepasa los niveles de este
plaguicida encontrados en suelo (Gonçalves
et al.
2006, ATSDR 2014). La identifcación molecular
se llevó a cabo en el Laboratorio de Identifcación
Fitopatológica del Colegio de Postgraduados. Los
aislamientos fueron determinados como
Fusarium
sp. (cepa K2P),
Fusarium
sp. (cepa K12P),
Fusarium
oxysporum
(cepa K1S),
Penicillium janthinellum
(cepa K8S),
Mucor circinelloides
(cepa K14S),
Fusarium verticilloides
(cepa K3TP) y
Alternaria
alternata
(cepa K11TP).
Pruebas de tolerancia a endosulfán, clorpirifós
y clorotalonil.
Las dosis probadas para endosulfán
fueron 1000, 2000 y 3000 mg/L, para clorpirifós 100,
250, 500, 1000 y 2000 mg/L y para clorotalonil 25,
50, 100 y 200 mg/L. Cada plaguicida fue diluido por
separado con acetona grado reactivo (Fermont
®
) y
se aplicaron de acuerdo con sus dosis, como única
fuente de carbono sobre medio mínimo sólido (MMS)
en cajas de Petri. La composición del MMS fue la si-
guiente (g/L): 0.5 (NH
4
)
2
SO
4
, 0.5 KH
2
PO
4
, 0.2 KCl,
0.2 MgSO
4
·7H
2
O, 0.1 CaCl
2
y 20 agar-agar. En cada
ensayo con cada plaguicida se incluyó un testigo
absoluto (TA) y un testigo con acetona (Ac), sin
contaminante.
La contaminación del MMS se realizó en condi-
ciones asépticas, distribuyendo 50 µL de la dilución
del plaguicida correspondiente sobre la superfcie de
agar con ayuda de una espátula de Drigalski. Para
cada cepa mencionada los plaguicidas se probaron
con sus respectivas dosis por triplicado, incluyendo
un testigo absoluto (TA) y un testigo con acetona
(Ac). Las cajas de Petri para el testigo Ac fueron
tratadas con 50 µL de acetona (3 µL/mL de medio
de cultivo) sin plaguicida.
La siembra de las cepas se realizó colocando un
sacabocados de la colonia fúngica con dos a seis días
de edad en el centro de la caja contaminada. Cada 24
h se estimó el desarrollo del micelio (DM) al medir
el diámetro (mm) de la colonia durante los primeros
ocho días. Después, la medición se llevó a cabo cada
48 h hasta los 18 días. Las cajas de Petri se mantu-
vieron en incubadora (New Brunswick Scientifc
Inc. Edison) a 26 ± 1 ºC durante todo el bioensayo.
El porcentaje de inhibición del desarrollo micelial
(PID) a los tres, ocho y 18 días, se calculó mediante
la siguiente fórmula:
-
=
TA
Ttrat
DM
x100
DM
100
PID
,
Donde: DM
Trat
= Desarrollo micelial en el trata-
miento con plaguicida, DM
TA
= Desarrollo micelial
en el testigo absoluto.
K. Stamatiu-Sánchez
et al.
26
Análisis estadístico.
Cada plaguicida fue ana-
lizado de manera individual, para lo cual el diseño
experimental fue completamente al azar a través de
un factorial 10 × 4 (diez cepas de hongos y cuatro
dosis) para el endosulfán, 10 × 7 (diez cepas de hon-
gos y siete dosis) para el clorpirifós y 10 × 6 (diez
cepas de hongos y seis dosis) para el clorotalonil.
Los datos obtenidos se sometieron a un análisis de
varianza (ANOVA, por sus siglas en inglés) y a una
prueba de comparación de medias (Tukey α = 0.05)
mediante el programa Sistema de Análisis Estadístico
(SAS 2002).
RESULTADOS
Tolerancia a endosulfán (EN).
La
figura 1
muestra el comportamiento del DM de las cepas.
100
80
60
40
20
0
K2P
K12P
K8S
100
80
60
40
20
0
K14S
0
K11TP
PC
100
80
60
40
20
0
123456 78
10
Tiempo de incubación (días)
Desarrollo micelial (mm)
12 14 16 18
TV
123456 78
10 12 14 16 18
123456 78
10 12 14 16 18
123456 78
10 12 14 16 18
123456 78
10 12 14 16 18
123456 78
10 12 14 16 18
123456 78
10 12 14 16 18
123456 78
10 12 14 16 18
TRI
TA
1000
3000 mg/L
2000
Ac
Fig. 1.
Dinámica de crecimiento de ocho cepas fúngicas,
Fusarium
sp. (K2P),
Fusarium
sp. (K12P),
Penicillium janthinelum
(K8S),
Mucor circinelloides
(K14S),
Alternaria alternata
(K11P),
Phanerochaete chrysosporium
(PC),
Trametes versicolor
(TV)
y
Trichoderma koningii
(TRI), expuestas a un medio mínimo sólido contaminado con tres dosis de endosulfán (mg/L).
Simbología: TA= Testigo absoluto, Ac= Testigo acetona. Medias ±error estándar, n=3
HONGOS FILAMENTOSOS TOLERANTES A PLAGUICIDAS
27
En ausencia del insecticida (TA y Ac) las cepas PC,
TRI y K14S cubrieron la caja de Petri totalmente a
los 4, 6 y 7 días, respectivamente. En presencia del
insecticida el DM se vio afectado levemente, recu-
perándose por completo a los 6 (PC), 10 (TRI) y 16
(K14S) días. Las cepas TV y K8S cubrieron la caja
de Petri en su totalidad a los 16 (TV) y 18 (K8S) días
en los testigos. Sin embargo, ante EN a 1000, 2000 y
3000 mg/L, la cepa TV se recuperó totalmente a los
12 días. Por su parte, la cepa K8S no presentó una
recuperación total, aunque no mostró diferencias
signifcativas entre las tres dosis del contaminante y
los testigos (
Fig. 1
).
Las cepas K2P, K12P y K11TP (
Fig. 1
), al igual
que K1S y K3TP (datos no presentados) mostraron
el crecimiento más lento y no hubo diferencias
signifcativas entre los testigos TA y Ac. En con
-
traste, la presencia de EN aFectó signifcativamente
(P < 0.0001) el DM en comparación con los tes
-
tigos, con excepción de la cepa K3TP (datos no
presentados). Lo anterior indica que el EN tuvo
un efecto adverso en el desarrollo de estas cepas,
sin embargo, hubo buena recuperación a los 18
días y no se obtuvieron diFerencias signifcativas
entre las dosis del insecticida (
Fig. 1
). La mayoría
de las cepas mostraron una ligera inhibición en el
DM con el solvente (Ac), aunque se recuperaron
entre los 3 y 10 días (
Fig. 1
).
Con respecto a los porcentajes de inhibición de
desarrollo (PID), por efecto del EN, todas las cepas
fúngicas mostraron inhibición durante los primeros
tres días. Las cepas PC, K11TP y K8S fueron las me-
nos inhibidas por el insecticida en comparación con
sus respectivos testigos. En contraste, las cepas con
mayor inhibición fueron TV, K14S y K1S (
Fig. 2a
).
A los 8 días, los PID para las cepas PC y TRI fueron
de cero por ciento en todos los tratamientos de EN,
con excepción de TRI ante 2000 mg/L (
Fig. 2b
)
cuyo PID fue de 6.8 %. En contraste, las cepas K12P,
K1S, K8S, K3TP y K11TP tuvieron porcentajes de
inhibición entre 15 y 55 %, mientras que la cepa
K2P tuvo los PID más altos, con valores de hasta
hasta 60 % (
Fig. 2b
). A los 18 días, las cepas TRI y
K14S mostraron recuperación total al presentar cero
por ciento de inhibición en todos los tratamientos,
en tanto que las cepas K1S y K3TP presentaron
inhibición mayor al 45 % (
Fig. 2c
). Los PID ne-
gativos que mostró TV y particularmente la cepa
K11TP, indicaron mejor DM en los tratamientos con
EN respecto al TA, con excepción de K11TP ante
1000 mg/L (
Fig. 2c
). Las cepas K12P, K8S, K3TP y
K11TP presentaron mayor DM en el testigo acetona
en comparación con el TA (
Fig. 2a-c
).
Tolerancia a clorpirifós (CRP).
El DM de las
cepas PC, TRI y K14S se inhibió inicialmente por la
presencia de CRP. Sin embargo, se recuperaron en
su totalidad a los 7, 10 y 12 días, respectivamente.
En ausencia del plaguicida estas cepas alcanzaron el
desarrollo máximo a los 4, 5 y 6 días, respectivamente
(
Fig. 3
). La cepa TV mostró menor DM ante las cinco
dosis de CRP en comparación con los testigos, pero
tuvo una recuperación total a los 12 días (
Fig. 3
). Las
cepas K11TP y K8S cubrieron la superfcie de agar
a los 10 (K11TP) y 14 (K8S) días. En ausencia del
insecticida, ambas cepas mostraron disminución del
DM en presencia de CRP. No obstante, se recuperaron
totalmente a los 14 (K11TP) y 16 (K8S) días (
Fig. 3
).
Por su parte, las cepas K2P y K12P (
Fig. 3
), al igual
que K1S y K3TP (datos no mostrados), superaron el
DM en comparación con sus testigos entre los días 3
y 8 cuando se expusieron ante las diferentes dosis de
CRP, con excepción de K2P y K12P ante 2000 mg/L.
El CRP inhibió el desarrollo en todas las cepas en
los primeros tres días, con excepción de la cepa K12P
cuyos PID fueron negativos con Ac a 250, 500 y
1000 mg/L; la mayoría de las cepas mostraron ligera
inhibición en el DM ante Ac (
Fig. 4a
). Las cepas
PC, TRI, K14S y TV tuvieron los PID más altos con
respecto a sus testigos y las cepas menos inhibidas
fueron K1S, K3TP y K2P (
Fig. 4a
). A los ocho días la
cepa TRI presentó cero por ciento de inhibición en to-
dos los tratamientos, mientras que PC y K14S mostra-
ron 3.2 y 26 % de inhibición ante CRP a 2000 mg/L,
respectivamente (
Fig. 4b
). Las cepas TV, K11TP, K8S
y K2P continuaron inhibidas hasta en un 40 % respec-
to a sus testigos. En contraste, las cepas K12P, K1S y
K3TP mostraron valores de PID negativos, indicando
mayor DM en los tratamientos con CRP respecto al
TA (
Fig. 4b
). En el día 18, todas las cepas presen-
taron cero por ciento de inhibición por efecto del
CRP, excepto la cepa K2P ante 2000 mg/L
(
Fig. 4c
).
Las cepas K12P, K1S y K3TP continuaron mostran-
do mayor desarrollo en los tratamientos respecto al
testigo (
Fig. 4c
).
Tolerancia a clorotalonil (CTL).
Las cepas K8S
y PC se vieron afectadas por el fungicida. Sin embar-
go, mostraron recuperación a partir del día 10 (
Fig. 5
).
En el día 18, en la concentración de 25 mg/L, la cepa
PC alcanzó 83 mm de diámetro, mientras que la co-
lonia de K8S alcanzó 79 mm y en ambos casos no
hubo diFerencias signifcativas entre esta dosis y los
testigos (
Fig. 5
). El CTL afectó el DM de las cepas
K14S, K11TP y TV pero se recuperaron a los 18 días,
en este caso los diámetros de las colonias ±uctuaron
entre 53 y 83 mm. Además, el DM con las distintas
K. Stamatiu-Sánchez
et al.
28
dosis de CTL no fue signiFcativamente diferente con
respecto a TA y Ac (
Fig. 5
).
Las colonias de K2P, K12P (
Fig. 5
), K1S y K3TP
(datos no presentados) sólo alcanzaron 40 mm de
diámetro a los 18 días, pero el DM de estas cepas
fue signiFcativamente diferente (Tukey α = 0.05)
respecto al TA y Ac (> 70 mm;
Fig. 5
). La cepa más
afectada por el CTL fue TRI, cuyo DM fue menor a 8
mm en el quinto día y de apenas 32 mm a los 18 días,
mientras que los testigos TA y Ac alcanzaron los 83
mm a los 4 y 5 días, respectivamente (
Fig. 5
).
En cuanto a los PID, las cepas más afectadas por
CTL a los tres días fueron TRI y PC (> 90 %), segui-
das por la cepa K14S (81 %) mientras que para el res-
to de las cepas (K2P, K12P, K1S, K8S, K3TP, K11TP
y TV) los valores de PID fueron de hasta 75.7 %
(
Fig. 6a
). En el octavo día la cepa TRI presentó PID
mayores a 85 %, siendo la cepa menos inhibida (58 %)
100
a
Ac
1000
2000
3000 mg/L
80
60
40
20
–20
–40
–60
K2P
K12P
K1S
K8S
K14S
K3TP
K11T
PP
CT
V
TRI
0
100
b
80
60
40
20
–20
–40
–60
K2P
Inhibición (%)
K12P
K1S
K8S
K14S
K3TP
K11T
PP
CT
V
TRI
0
100
c
80
60
40
20
–20
–40
–60
K2P
K12P
K1S
K8S
Cepas de hongos filamentosos
K14S
K3TP
K11T
PP
CT
V
TRI
0
Fig. 2.
Porcentajes de inhibición del desarrollo (PID) de diez hongos Flamentosos expuestos a
tres dosis de endosulfán (mg/L): a) tres días de exposición, b) ocho días de exposición
y c) 18 días de exposición. Valores negativos de PID indican mayor desarrollo micelial
en el tratamiento correspondiente respecto al testigo absoluto (TA). Simbología: K2P=
Fusarium
sp., K12P=
Fusarium
sp., K8S=
Penicillium janthinelum
, K14S=
Mucor circi-
nelloides
, K11P=
Alternaria alternata
, PC=
Phanerochaete chrysosporium
, TV=
Trametes
versicolor
, TRI=
Trichoderma koningii
, Ac= Testigo acetona. Medias ± error estándar,
n = 3
HONGOS FILAMENTOSOS TOLERANTES A PLAGUICIDAS
29
en la dosis más alta de CTL, mientras que la cepa K14S
mostró 39 % de inhibición ante 25 mg/L (
Fig. 6b
).
Al día 18, la cepa TRI continuó siendo la cepa más
afectada (PID > 60 %), en tanto que las cepas K2P,
K12P, K1S y K3TP tuvieron valores de PID mayo-
res a 42 % (
Fig. 6c
). Las cepas K8S, K14S, K11TP,
PC y TV se recuperaron totalmente al mostrar cero
por ciento de inhibición ante 25 mg/L, además las
cepas K14S, K11TP y TV no presentaron diferencias
signifcativas entre las dosis 50, 100 y 200 mg/L
respecto al testigo Ac, lo que indica tolerancia al
CTL. Las cepas se vieron afectadas con Ac al inicio,
aunque en porcentajes bajos (
Fig. 6a
) con recupera-
ción de la mayoría de las cepas desde los ocho días
100
TA
Ac
10
02
50
50
01
000
2000 mg/L
80
60
40
20
0
123456 78
10 12 14 16 18
123456 78
10 12 14 16 18
K2P
K12P
123456 78
10 12 14 16 18
100
80
60
40
20
0
123456 78
10 12 14 16 18
K8S
K14S
123456 78
10 12 14 16 18
123456 78
10 12 14 16 18
K11TP
PC
100
80
60
40
20
0
123456 78
10 12 14
Tiempo de incubación (días)
Desarrollo micelilal (mm)
16 18
123456 78
10 12 14 16 18
TV
TRI
Fig. 3.
Dinámica de crecimiento de ocho cepas fúngicas,
Fusarium
sp. (K2P),
Fusarium
sp. (K12P),
Penicillium janthinelum
(K8S),
Mucor circinelloides
(K14S),
Alternaria alternata
(K11P),
Phanerochaete chrysosporium
(PC),
Trametes versicolor
(TV)
y
Trichoderma koningii
(TRI), expuestas a un medio mínimo sólido contaminado con cinco dosis de clorpirifós (mg/L).
Simbología: TA= Testigo Absoluto, Ac= Testigo Acetona. Medias ± error estándar, n = 3
K. Stamatiu-Sánchez
et al.
30
(
Fig. 6b
) y recuperación total de todas las cepas a
los 18 días (
Fig. 6c
).
DISCUSIÓN
El disolvente Ac provocó inhibición en el DM en
todas las cepas a los primeros tres días. Sin embargo,
se recuperaron al fnal de los bioensayos (18 días) y
en muchos casos el DM del testigo Ac superó al DM
de sus correspondientes TA. El efecto tóxico que
tuvo el disolvente en el presente trabajo (3 µL/mL
de medio de cultivo) coincide con lo reportado por
Vazquez-Nuñez
et al.
(2009) y Dutta
et al.
(2010).
Estos autores, al adicionar acetona en un suelo, redu-
jeron la actividad microbiana (medida en biomasa y
emisión de CO
2
) durante los primeros siete días, en
comparación con el testigo sin acetona y, transcurri-
do el periodo de inhibición, los microorganismos se
recuperaron.
100
a)
Ac
100
250
500
1000
2000
mg/L
80
60
40
20
–40
–60
K2P
K12P
K1S
K8S
K14S
K3TP
K11T
PP
CT
V
TRI
0
100
b)
c)
80
60
40
Inhibición (%)
20
–20
–40
–60
K2P
K12P
K1S
K8S
K14S
K3TP
K11TP
Cepas de hongos filamentosos
PC
TV
TRI
0
100
80
60
40
20
–20
–40
–60
K2P
K12P
K1S
K8S
K14S
K3TP
K11T
PP
CT
V
TRI
0
Fig. 4.
Porcentajes de inhibición del desarrollo (PID) de diez hongos flamentosos expuestos a cinco
dosis de clorpirifós (mg/L): a) tres días de exposición, b) ocho días de exposición y c) 18
días de exposición. Valores negativos de PID indican mayor desarrollo micelial en el trata-
miento correspondiente respecto al testigo absoluto (TA). Simbología: K2P=
Fusarium
sp.,
K12P=
Fusarium
sp., K8S=
Penicillium janthinelum
, K14S=
Mucor circinelloides
,
K11P=
Alternaria alternata
, PC=
Phanerochaete chrysosporium
, TV=
Trametes versicolor
,
TRI=
Trichoderma koningii
, Ac= Testigo acetona. Medias ± error estándar, n = 3
HONGOS FILAMENTOSOS TOLERANTES A PLAGUICIDAS
31
El efecto tóxico de los solventes orgánicos como
la acetona sobre los microorganismos en el suelo y
el agua es conocido (Stratton 1989, Satsuma
et al
.
2001), pero este efecto es temporal y siempre hay
una recuperación (Jenkinson y Powlson 1976). Al-
gunos microorganismos pueden usar los solventes
como fuente de carbono (Siller
et al
. 1996) e incluso
la acetona puede facilitar la biodisponibilidad de
nutrientes en el medio (Yeomans y Bremner 1989).
La respuesta de los hongos ante la acetona fue me-
dida por Field
et al
. (1992), quienes encontraron que
altas concentraciones del solvente (100 y 200 mL/L)
inhiben completamente el desarrollo de hongos como
P. chrysosporium
,
Trametes
sp. y
Bjerkandera
sp.
Sin embargo, a concentraciones de 10 mL/L no hubo
inhibición e incluso la cepa
Bjerkandera
sp. mostró
100
80
60
40
20
0
123456 78
10 12 14 16 18
K2P
TA
100
25
50
Ac
200 mg/L
123456 78
10 12 14 16 18
K12P
123456 78
10 12 14 16 18
K8S
100
80
60
40
20
0
123456 78
10 12 14 16 18
K14S
Desarrollo Micelial (mm)
123456 78
10 12 14
Tiempo de incubación (días)
16 18
K11TP
TRI
TV
123456 78
10 12 14 16 18
100
80
60
40
20
0
123456 78
10 12 14 16 18
123456 78
10 12 14 16 18
PC
Fig. 5.
Dinámica de crecimiento de ocho cepas fúngicas,
Fusarium
sp. (K2P),
Fusarium
sp. (K12P),
Penicillium janthinelum
(K8S),
Mucor circinelloides
(K14S),
Alternaria alternata
(K11P),
Phanerochaete chrysosporium
(PC),
Trametes versicolor
(TV)
y
Trichoderma koningii
(TRI), expuestas a un medio mínimo sólido contaminado con cuatro dosis de clorotalonil (mg/L).
Simbología: TA= Testigo Absoluto, Ac= Testigo Acetona. Medias ± error estándar, n = 3
K. Stamatiu-Sánchez
et al.
32
mayor producción de CO
2
con respecto al testigo,
aunque esta cepa no utilizó a la acetona como fuente
de carbono. Lo anterior coincide con lo observado
en esta investigación ya que la cantidad aplicada
de acetona al medio de cultivo equivale a 3 µL/mL
de medio de cultivo, misma que no produjo efectos
tóxicos permanentes en las cepas del bioensayo. Los
hongos fueron inicialmente susceptibles al efecto
tóxico de la acetona, pero después del periodo de
adaptación (5 a 12 días) lograron tolerarla y usarla
como fuente de carbono, superando el desarrollo
del TA. Sin embargo, es necesario realizar estudios
específcos del eFecto y estímulo del solvente sobre
los hongos.
El EN disminuyó el DM en todas las cepas durante
los primeros tres días con recuperación gradual. Este
efecto inhibidor ha sido reportado por Mukherjee y
Mittal (2005) al encontrar que
Aspergillus terreus
y
Cladosporium oxysporum
expuestos a EN incre-
mentaron la disipación del insecticida a partir del
Fig. 6.
Porcentajes de inhibición del desarrollo (PID) de hongos aislados de paja molida de trigo,
trozos de paja de trigo, suelo agrícola y tres cepas de referencia, expuestas a cuatro dosis de
clorotalonil (mg/L): a) tres días de exposición, b) ocho días de exposición y c) 18 días de
exposición. Valores negativos de PID indican mayor desarrollo micelial en el tratamiento
correspondiente respecto al TA. Simbología: K2P=
Fusarium
sp., K12P=
Fusarium
sp.,
K8S=
Penicillium janthinelum
, K14S=
Mucor circinelloides
, K11P=
Alternaria alternata
,
PC=
Phanerochaete chrysosporium
, TV=
Trametes versicolor
, TRI=
Trichoderma koningii
,
Ac= Testigo acetona. Medias ± error estándar, n = 3
100
a)
b)
c)
Ac
25
50
100
200 mg/L
80
60
40
20
–20
–40
–60
K2P
K12P
K1S
K8S
K14S
K3TP
K11T
PP
CT
V
TRI
0
100
80
60
40
20
–20
–40
–60
K2P
Inhibición (%)
K12P
K1S
K8S
K14S
K3TP
K11T
PP
CT
V
TRI
0
100
c
80
60
40
20
–20
–40
–60
K2P
K12P
K1S
K8S
Cepas de hongos filamentosos
K14S
K3TP
K11T
PP
CT
V
TRI
0
HONGOS FILAMENTOSOS TOLERANTES A PLAGUICIDAS
33
tercer día. Hussain
et al.
(2007) encontraron poca
degradación de EN durante los primeros tres días y
observaron un notorio incremento en la degradación
al sexto día de incubación con
A. terreus
,
A. terricola
y
Chaetosartorius stromatoides
. Bhalerao y Puranik
(2007) indican que
A. niger
mostró inhibición de su
crecimiento ante EN y después de la etapa de adap-
tación el hongo creció rápidamente, superando la
biomasa obtenida en el testigo desde el segundo día
de la contaminación. En la presente investigación, las
cepas K14S, TRI, K8S, K11TP y K3TP presentaron
mejor DM ante la dosis más alta de EN (3000 mg/L)
en comparación con 1000 y 2000 mg/L entre los
primeros tres y cuatro días (
Fig. 1
).
El insecticida CRP mostró un efecto adverso sobre
el DM de todas las cepas a los tres días, pero con una
recuperación total a los 18 días. La inhibición inicial
de clorpirifós sobre el desarrollo fúngico, coincide
con lo reportado por Fang
et al.
(2008) quienes en-
contraron que el CRP (100 mg/L) redujo la biomasa
de
Verticillium
sp. durante los primeros cinco días y
posteriormente se incrementó rápidamente. Un com-
portamiento similar fue descrito por Liu
et al.
(2002)
con
Trichoderma
ante CRP (50 mg/L) durante siete
días. De manera particular, las dos cepas de
Fusarium
(K2P y K12P) mostraron mayor DM en comparación
con sus testigos entre los días 3 y 8 cuando se ex-
pusieron a las diferentes dosis de CRP (
Fig. 3
). Lo
anterior denota su tolerancia y la posible estimulación
del crecimiento por parte de este insecticida, misma
que podría estar relacionada con su capacidad de
degradación de plaguicidas organoclorados como el
lindano (Guillén-Jiménez
et al
. 2012).
Al comparar los efectos inhibidores del EN y del
CRP en el crecimiento de las cepas fúngicas, el
del CRP fue mayor a los tres días (
Fig. 4
). Sin embar-
go, la mayoría de las cepas mostraron reducción en sus
PID desde los 10 días, recuperándose totalmente a los
18 días. Mientras que ante EN, un número mayor de
cepas continuaron inhibidas hasta los 18 días (
Fig. 2
).
Este retraso en la recuperación del DM pudo deberse
a que el EN (organoclorado) es químicamente más
estable, acumulable y persistente (Ware 1994), con
una presión de vapor baja (1.7 × 10
–7
mm Hg a 20 ºC;
Green y Pohanish 2005), lo que lo hace una molécula
de poca volatilidad. En contraste, la presión de vapor
del CRP es media (1.87 × 10
–5
mm Hg a 25 ºC) y sus
propiedades como organofosforado lo hacen menos
persistente y menos tóxico (Ware 1994, Green y Po-
hanish 2005). Con base en lo anterior, la residualidad
y la complejidad de la estructura química del EN pudo
provocar que la recuperación de los hongos ocurriera
en mayor tiempo.
El CTL resultó más tóxico para los hongos al
obtenerse altos PID (> 60 %) hasta los 18 días. De
forma similar Singh
et al.
(2002) observaron que este
fungicida (10 mg/kg) tuvo un fuerte efecto inhibidor
sobre los microorganismos del suelo durante 90
días, en comparación con el CRP (10 mg/kg), cuyos
efectos no fueron mayores a 30 días. La prolongada
inhibición del desarrollo en la mayoría de las cepas
(excepto las cepas K14S, K11TP, PC, TV) ante el
CTL observada hasta los 18 días, se puede explicar
por su acción fungicida, que afecta principalmente
a las enzimas implicadas en la respiración y en la
biosíntesis de proteínas (Tillman
et al
. 1973). Por
lo anterior, es probable que las cepas fúngicas ex-
puestas a CTL no hayan podido recuperarse durante
el bioensayo (18 días) como lo hicieron ante el EN
y el CRP. Sin embargo, varias cepas se recuperaron
totalmente ante la concentración más baja de CTL
(25 mg/L). Una respuesta similar es reportada por
Guillén
et al.
(2009) quienes encontraron que los
preservadores de madera con propiedades antifún-
gicas inhiben el desarrollo de tres cepas de hongos
incluyendo a
T. versicolor
, el cual fue tolerante a
dosis bajas, comportamiento similar al observado en
esta investigación con el CTL (25 mg/L). Por su parte,
el crecimiento de
P. chrysosporium
fue afectado por
la aplicación de benomil ante dosis tan altas como
225 µg/g (Adam-Ali y Wainwrigth 1994). Lo anterior
explica la inhibición del crecimiento de este hongo a
concentraciones altas de CTL, con lo que se resalta
su susceptibilidad a la aplicación de fungicidas. En
el presente estudio las cepas K8S, K14S, K11TP, PC
y TV fueron tolerantes a la dosis más baja de CTL
(25 mg/L).
Algunas cepas expuestas a CRP (K12P, K1S y
K3TP) o a EN (K11TP) superaron el DM de sus
respectivos testigos después de un periodo de inhi-
bición (3 a 16 días). Dutta
et al
. (2010) encontraron
un estímulo en la respiración basal y en la biomasa
microbiana al aplicar CRP en comparación con el
testigo. Das y Mukherjee (2000) y Eisenhauer
et al.
(2009) obtuvieron un incremento en la población de
microorganismos en el suelo después de la aplicación
de plaguicidas organofosforados y organoclorados.
En cuanto a los hongos, Field
et al.
(1992) observaron
que
Bjerkandera
sp. mostró mayor respiración en
presencia de benzopireno, antraceno y antraquinona.
Por su parte, Bhalerao y Puranik (2007) encontraron
mayor biomasa fúngica de
A. niger
en presencia de
EN, debido probablemente a su disponibilidad como
fuente de carbono y sulfuro en el medio. Siddique
et
al.
(2003) reportan que
Fusarium ventricosum
fue
capaz de utilizar EN como única fuente de carbono.
K. Stamatiu-Sánchez
et al.
34
Es probable que en la presente investigación las
cepas fúngicas que superaron el DM con respecto
a sus testigos, además de tolerar, pudieron haber
utilizado a los insecticidas (EN y CRP) como fuente
de energía para su desarrollo, una vez superado el
periodo de inhibición. Sin embargo, se requiere de
mayor estudio al respecto.
Los hongos de referencia
P. chrysosporium
y
T.
versicolor
mostraron tolerancia a las diferentes con-
centraciones de EN y CRP y ante CTL a 25 mg/L.
Además, la cepa de referencia
T. koningii
también
exhibió tolerancia a los insecticidas. La capacidad
de estas especies fúngicas como degradadoras de
endosulfán, pentaclorofenol, isoproturón y HPA ha
sido demostrada en otras investigaciones (Dhawale
et al.
1992, Rüttimann-Johnson y Lamar 1997, Kim
et al
. 2001, Wirén-Lehr
et al
. 2001). La cepa K12P
(
Fusarium
sp.) presentó buena tolerancia al EN y
excelente recuperación ante el CRP, sin embargo,
se vio inhibida por el CTL. Las respuestas de este
género fúngico a los plaguicidas han sido poco estu-
diadas, aunque se tienen reportes sobre su tolerancia,
degradación y acumulación de compuestos tóxicos
como trifuralina, atrazina, gliFosato, lindano y HPA
(Jeffery y Burguess 1990, Yu
et al.
1998, Verdin
et
al.
2005, Sagar y Sing 2011).
La presente investigación reporta solamente la
tolerancia de cinco especies de hongos ±lamentosos
aislados de sustratos que potencialmente pueden ser
utilizados en sistemas de biorremediación como lo
son las biocamas. Se muestra evidencia de que estos
hongos pueden tolerar concentraciones extremada-
mente altas de los tres plaguicidas. En el caso de
las dos cepas
Fusarium
(K2P y K12P), la tolerancia
observada ante el EN y el CRP puede relacionarse
con la capacidad potencial de degradar plaguicidas
organoclorados, como el lindano, a través de una
carboxilación aeróbica descrita para
F. verticillioides
(Guillén-Jiménez
et al
. 2012). Mientras que para el
caso del CRP, la cepa
Fusarium
WZ-I tiene enzimas
que pueden contribuir en la degradación de este pla-
guicida (Xie
et al
. 2010). En el caso de la respuesta
observada de
Fusarium
ante el CTL, se in±ere que
este género es altamente tolerante a este fungicida, ya
que Fravel
et al
. (2010) describen efectos inhibidores
del crecimiento miceliar a concentraciones de CTL
de 10 mg/L. No obstante, la información sobre las
respuestas ±siológicas o bioquímicas de los miem
-
bros de este género de hongos ante la presencia de
plaguicidas requiere de un mayor estudio. Las cepas
Mucor circinelloides
(K14S) y
Penicillium janthine-
llum
(K8S) mostraron excelente tolerancia al EN y el
CRP y buena recuperación con CTL. Estos hongos
tienen capacidad de tolerar y de degradar plaguicidas
organoclorados como la atrazina, o bien creosota y
HPA (Kaufman y Blake 1970, Atagana 2004, Silva-
Jiménez y Zazueta-Sandoval 2005, Dan
et al.
2006,
Kim y Lee 2007, Kataoka
et al
. 2010). Sin embargo
existe poca información sobre su tolerancia y degra-
dación de EN, CRP y CTL. Con respecto al género
Alternaria
, la información es prácticamente nula, por
lo que la presente investigación contribuye a la gene-
ración de información básica de este organismo en lo
que respecta a su tolerancia a estos tres plaguicidas.
CONCLUSIONES
Las cepas fúngicas evaluadas mostraron diferen-
tes grados de tolerancia a EN, CRP y CTL. Estos pla-
guicidas causaron mayor inhibición del DM durante
los primeros tres días, pero las cepas mostraron una
recuperación gradual. El fungicida CTL provocó la
mayor inhibición, en contraste, las cepas expuestas a
CRP se recuperaron totalmente a los 18 días. Asimis-
mo, a los 18 días la cepa TRI y
Mucor circinelloides
(cepa K14S) mostraron recuperación total ante EN
en todas sus concentraciones. El crecimiento de
Fusarium oxysporum
(cepa K1S) y
Fusarium verti-
cilloides
(cepa K3TP) fue inhibido en un 45 %. En
el caso del CRP, todas las cepas presentaron cero por
ciento de inhibición al día 18, excepto
Fusarium
sp.
(K2P) a 2000 mg/L
(
Fig. 4c
), mientras que las cepas
Fusarium
sp. (K12P),
Fusarium oxysporum
(K1S)
y
Fusarium verticilloides
(K3TP) mostraron mayor
desarrollo con respecto al TA. En presencia de CTL,
la cepa TRI mostró PID mayores al 60 %, en tanto que
en las cepas K2P, K12P, K1S y K3TP los valores de
PID fueron mayores a 42 %. Las especies
Penicillium
janthinellum
(K8S),
Mucor circinelloides
(K14S),
Alternaria alternata
(K11TP) y las cepas de referen-
cia PC y TV, se recuperaron totalmente del CTL al
mostrar cero por ciento de inhibición a los 25 mg/L.
En resumen, las cepas K14S (
Mucor circinelloides
),
K8S (
Penicillium janthinellum
), K11TP (
Alternaria
alternata
) y K12P (
Fusarium
sp.), exhibieron una
tolerancia hacia EN (1000, 2000 y 3000 mg/L), CRP
(100, 250, 500, 100 y 2000 mg/L) y CTL (25 mg/L),
por lo que tienen potencial para ser evaluadas sobre
su capacidad de biodegradación de estos plaguicidas.
AGRADECIMIENTOS
Esta investigación Fue ±nanciada por el proyecto
SEP-CONACyT 79456. Además, KSS agradece al
HONGOS FILAMENTOSOS TOLERANTES A PLAGUICIDAS
35
CONACyT su apoyo durante su programa de doc-
torado.
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