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Red de Revistas Científicas de América Latina y el Caribe, España y Portugal
Rev. Int. Contam. Ambie. 31 (3) 219-226, 2015
FORMULACIÓN DE
Metarhizium anisopliae
(METSCHNIKOFF) SOROKIN CON POLÍMEROS
BIODEGRADABLES Y SU VIRULENCIA CONTRA
Heliothis virescens
(FABRICIUS)
Mónica ACUÑA JIMÉNEZ
1
, Cipriano GARCÍA GUTIÉRREZ
1
*, Ninfa María ROSAS GARCÍA
2
,
Melina LÓPEZ MEYER
1
y Juan Carlos SAÍNZ HERNÁNDEZ
1
1
Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional, Unidad Sinaloa, Instituto
Politécnico Nacional, Juan de Dios Bátiz Paredes No. 250, Guasave, Sinaloa, México, C.P. 81101
2
Centro de Biotecnología Genómica, Instituto Politécnico Nacional, Bulevard del Maestro S/N esq. Elías Piña,
Colonia Narciso Mendoza, Ciudad Reynosa, Tamaulipas, México, C.P. 88710
* Autor para correspondencia: cgarciag@ipn.mx, garciaciprian@hotmail.com
(Recibido enero 2014; aceptado: febrero 2015)
Palabras clave: hongos entomopatógenos, microencapsulación, secado por aspersión, polímeros biodegradables
RESUMEN
Propágulos de
Metarhizium anisopliae
(Metchnikoff) Sorokin obtenidos por fermen-
tación sólida en granos de arroz se usaron para producir microcápsulas mediante la
técnica de secado por aspersión. Como matriz se probaron gelatina bovina, maíz
nixtamalizado, almidón de maíz, así como un fagoestimulante y un protector de ra-
yos UV. Se elaboraron ocho formulaciones variando la composición y ajustando las
temperaturas de entrada y de salida del secador a 120 ºC/70 ºC respectivamente y la
velocidad del fujo a 3.34 mL/min. Previamente se determinó la preFerencia alimenticia
de
Heliothis virescens
(Fabricius) a dos fagoestimulantes (garbanzo y aceite de maíz).
Para seleccionar la formulación con la mayor capacidad de adherencia se realizó una
prueba de adherencia sobre portaobjetos después de cinco lavados con agua (64 mL/min
durante 24 s). Se evaluó la virulencia de estas Formulaciones mediante bioensayos con
larvas del primer estadio de
H. virescens
. La mortalidad fue evaluada después de siete
días. La mejor formulación (F6) mostró la mayor adherencia a portaobjetos (85.55 ±
1.79 %), la mejor preFerencia por las larvas (6.6 ± 1.24 %) y estuvo compuesta por
gelatina bovina (26 g), aceite de maíz (20 mL), colorante rojo (4 g) y
M. anisopliae
1.49 × 109 esporas/g. El proceso de secado logró la encapsulación del hongo en gránu
-
los con un tamaño de partícula < 20 μm, con humedad de 8.74 ± 3.6 % y 5.4 ± 0.6 %
de germinación de esporas a las 24 h, con una virulencia de 10.31 % sobre larvas del
primer estadio de
H. virescens
. Los resultados de virulencia fueron bajos, por lo que
se sugiere reducir la temperatura de entrada del secador (entre 60 ºC y 70 ºC) para
aumentar la sobrevivencia de esporas y la mortalidad de larvas.
Key words:
entomopathogenic fungi, microencapsulation, spray drying, biodegradable polymers
ABSTRACT
Propagules of
Metarhizium anisopliae
(Metchnikoff) Sorokin were obtained from solid
fermentation of rice grains to produce microcapsules by the spray drying technique.
Bovine gelatin, nixtamalized corn, and corn starch were used as matrix, in addition to
M. Acuña Jiménez
et al.
220
a feeding stimulant and a UV protector. Eight microencapsulated formulations were
obtained adjusting the spray drying conditions to 120 ºC and 70 ºC of inlet and outlet
temperatures, respectively, and to a fow rate oF 3.34 mL/min. Previously, Feeding
preference tests with
Heliothis virescens
(Fabricius) were conducted with two feeding
stimulants (chickpea and vegetable oil). To select the formulation with the highest ad-
herence capacity, adhesion trials were perFormed with ±ve water washes (64 mL/min
during 24 s) on glass slides. The virulence oF these Formulations was assessed through
a bioassay using ±rst instar
H. virescens
larvae. Mortality was recorded after seven
days. The selected formulation (F6) showed the highest adherence to slide (85.55 ±
1.79 %), highest larvae Feeding preFerence (6.6 ² 1.24 %), and contained bovine gelatin
(26 g), corn oil (20 mL), red dye (4 g) and
M. anisopliae
(1x109 spores/g). The results
showed that the drying process of the fungus produced encapsulating granules with
particle size < 20 μm, moisture content oF 8.74 ² 3.6 %, spore germination values oF 5.4
² 0.6 % (aFter 24 h), and Fungi virulence oF 10.31 % tested on ±rst instar
H. virescens
larvae. Since virulence was low, decreasing dryer´s inlet temperature (between 60 ºC
and 70 ºC) may increase the spore survival as well as the effectivity of the formulation
on larval mortality.
INTRODUCCIÓN
En 2013 se sembraron en Sinaloa, México 15 362 ha
de tomate (
Lycopersicon esculentum
Mill.) en las
cuales se obtuvo una producción de 983 288 ton
(SIAP 2013). En cada ciclo agrícola este cultivo se
ve afectado por diversas plagas y enfermedades, entre
las cuales se encuentra el gusano del fruto
Heliothis
virescens
(Fabricius). Existen diversos métodos de
control para esta plaga, sin embargo los más utili-
zados son los insecticidas químicos, por lo que se
requiere de nuevas alternativas más amigables con el
ambiente, como los bioinsecticidas a base de hongos
entomopatógenos (HE).
El hongo
Metarhizium anisopliae
(Metschnikoff)
Sorokin es uno de los principales entomopatógenos
empleado como bioinsecticida. Este hongo tiene,un
amplio rango de insectos hospederos de diferentes
órdenes, entre los que se incluyen plagas de lepi-
dópteros de importancia agrícola (Faria y Wraight
2007). El ciclo biológico de este HE comprende
una fase infectiva celular en el interior del insecto
y otra sapro±ta cuando el hongo completa su ciclo
al aprovechar los nutrientes del cadáver del insecto
(Khachatourians y Qazi 2008). Los insectos muertos
por este hongo son inicialmente cubiertos de forma
total por micelio de color blanco, el cual se torna
verde cuando el hongo esporula (Wraight
et al
. 2007).
En cuanto a los mecanismos de acción de los HE
presentan una ventaja sobre las bacterias y los virus
debido a que éstos deben ser ingeridos por el insecto
para actuar. En el caso de los HE pueden ingresar
por contacto a través de un proceso de infección en
la cutícula del insecto.
Debido al interés en estos hongos para el control
de plagas de los cultivos hortofrutícolas se continúa
en la búsqueda de estrategias para mejorar el proceso
de producción a ±n de ser empleados en la elabora
-
ción de bioinsecticidas. Algunos ejemplos son los
trabajos realizados por Pham
et al
. (2010) quienes
produjeron
B. bassiana
por fermentación en sólidos
a través del arroz en bolsas de polietileno (14 días
a 25 ºC) en las que colocaron un inóculo de 10
7
esporas/g de arroz. La producción obtenida en este
caso Fue de 4.05 g de esporas/100 g de arroz. Otra
investigación reciente es la realizada por Taylor
et
al
. (2013) quienes produjeron
B. bassiana
en arroz
con una producción de 10
8
a 10
9
esporas/g de arroz.
La e±cacia de los HE usados en campo se ve
afectada por factores abióticos como la radiación
solar, la temperatura y la humedad (Rangel
et al
.
2005) por lo que se requiere adicionar adyuvantes
que permitan proteger al ingrediente activo (IA) para
incrementar su persistencia y residualidad. En las
nuevas tecnologías que involucran a los agentes de
control biológico se incluye el diseño y la elabora-
ción de bioinsecticidas de hongos, bacterias y virus
a través de formulaciones microencapsuladas por el
proceso de secado por aspersión (SA). En el caso de
los hongos el IA son esporas y micelio, los cuales
se pueden encapsular en una matriz de adyuvantes
y fagoestimulantes para mejorar su efectividad en
controlar las poblaciones del insecto blanco (Behle
et al
. 1997).
La técnica de secado por aspersión ha sido inves-
tigada para su uso con HE. Horaczeck y Viernstein
(2004) compararon la técnica de secado por asper
-
sión con otros dos métodos (lio±lización y lecho
FORMULACIÓN BIODEGRADABLE CONTRA
Heliothis virescens
221
fuidizado) para secar esporas de
B. brongniarti
y
M. Anisopliae
. Dichos autores evaluaron el efecto
que el proceso tiene en la actividad y persistencia
de los esporas de 14 a 20 días de desarrollo. Para el
secado por aspersión, utilizaron un equipo de labo-
ratorio B-191 marca Buchi con un fujo de 3 mL y
una duración de la corrida de 8 min.
Con el equipo
mencionado se probaron diferentes temperaturas
de entrada (60, 80 y 100 ºC) y de salida (40
± 2,
53 ±
2 y 41
± 2) y como agentes microencapsulantes
se utilizaron la polivinilpirrolidona (PVP) y leche
descremada. Después del proceso de microencapsu-
lación, los autores demostraron que
M. anisopliae
fue
más resistente al estrés por calor que
B. brongniarti
.
Además reportaron que la temperatura de salida fue
clave para minimizar la pérdida de viabilidad de las
esporas, aunque en ese equipo no pudo ser controlada,
ya que está en función de la temperatura de entrada,
del fujo de alimentación y de la corriente de aire.
En otros trabajos se han probado diferentes
agentes microencapsulantes. De Luna
et al.
(2011)
encontraron como mejor agente a la gelatina bovina
sobre la pectina y almidón de maíz. Por su parte Jin
y Custis (2011) microencapsularon al hongo
Tri-
choderma harzianum
(Rifai) con una solución de
sacarosa al 2 %, a temperaturas óptimas de entrada
y de salida (60/31 ºC), las microcápsulas formadas
bajo estas condiciones tuvieron un tamaño de partí-
cula 10 a 25 micras.
Los polímeros como almidón de maíz, el maíz
nixtamalizado y la gelatina bovina son capaces de
conferir al IA, la capacidad de adherirse al follaje
de la planta, protegiéndola de la lluvia y del viento,
además de formar una matriz protectora (McGuire
et al.
1994, Rosas y De Luna 2006) característica
deseable en una formulación para el gusano del fruto
de tomate. En el caso de bioinsecticidas a base de
HE aún cuando no es necesario que sean ingeridos
por el insecto, puede resultar conveniente adicionar
Fagoestimulantes especí±cos para atraer a la plaga a
la formulación y con esto propiciar la infección del
insecto por contacto con el hongo.
Considerando lo anterior, este trabajo tiene como
objetivo elaborar un microencapsulado a base de
M.
anisopliae
y polímeros biodegradables con virulencia
para el gusano del fruto del tomate
H. virescens
.
MATERIALES Y MÉTODOS
Origen de la cepa de
Metarhizium anisopliae
Se utilizaron cepas nativas de
M. anisopliae
de la colección del Laboratorio de Bioinsecticidas
(CIIDIR-Sinaloa) las cuales se obtuvieron a partir
de muestras de suelo y se aislaron con la técnica
de insecto trampa
Galleria mellonella
(Zimmer-
mann 1986;
Cuadro I
). Dichas cepas se encuentran
identi±cadas morFológicamente en las claves de
Humber (1998) y molecularmente al ampli±car la
región ITS1/ITS2 con una homología del 98 y 99 %
consultada en la base de datos del Centro Nacional
para la Información Biotecnológica.
Evaluación de la patogenicidad de
Metarhizium
anisopliae
Con el ±n de seleccionar una cepa con patogeni
-
cidad sobre el insecto se prepararon suspensiones a
una concentración de 1 × 10
8
esporas/mL ajustando
la concentración con ayuda de la cámara de Neu-
bauer. Se sumergieron larvas del quinto estadio del
gusano del Fruto de 14 días de desarrollo durante
1 min. Posteriormente se colocaron de manera
individual en un recipiente de plástico de 30 mL
con una dieta arti±cial para la cría del gusano del
fruto siguiendo la metodología de Greene
et al
.
(1976) con algunas modi±caciones (
Cuadro II
).
Para determinar la patogenicidad de las esporas se
CUADRO I.
ORIGEN DE LAS CEPAS NATIVAS DE
M.
anisopliae
Cepa
Ecosistema
ReFerencia geográ±ca
N
W
M20
Agroecosistema
25º 46.098’ 108º 15.732’
M21
Agroecosistema
25º 46.098’ 108º 15.732’
M22
Selva baja caducifolia
25º 29.324’
108º 27.870’
Números de acceso del GenBank: M20 KR998522
(CIDSM01), M21 KR998523 (CIDSM02) y M22 KR998524
(CIDSM03).
CUADRO II.
DIETA ARTIFICIAL PARA CRÍA DE LARVAS
DE
H. virescens
A (MODIFICADA DE GREENE
et al.
1976)
Ingrediente
Cantidad/L
Harina de maíz nixtamalizado
120 g
Germen de trigo
55 g
Levadura de cerveza
35 g
Ester metílico de ácido 4- hidroxibenzóico
(Metilparabeno sódico)
2.2 g
Vitaminas
15 mL
Ácido ascórbico
3.5 g
Ácido sórbico
1.1 g
Agar bacteriológico
15 g
Agua destilada
700 mL
M. Acuña Jiménez
et al.
222
usaron 10 larvas por triplicado. El testigo negativo
fue una solución de Tween 80 al 0.1 %. A los 7 días
se determinó el porcentaje de insectos muertos.
Los datos de mortalidad fueron corregidos con la
fórmula de Abbott (1925).
Producción de esporas por fermentación en sólido
Se utilizaron granos de arroz comercial tratado con
0.3 mg/mL
de antibiótico (2 pastillas de cloranfenicol/L
de agua). Para inocular al hongo se colocaron
previamente 300 g de arroz con 200 mL de agua destilada
en bolsas de plástico de 2 kg esterilizadas por 15 min
a una temperatura de 121 ºC. Posteriormente se
enfriaron por 2 h a temperatura ambiente. Con una
micropipeta se añadió la suspensión de esporas a
una concentración de 2.32 × 10
8
esporas/100 g de
arroz y se dejaron incubar por 20 días a 25 ± 2 ºC.
Se removió el arroz cada cuatro días para aumentar
la superfcie de contacto entre esporas y sustrato e
incrementar el desarrollo del hongo. Después se
determinó la concentración y el porcentaje de ger-
minación de las esporas. Para separar el hongo del
arroz y obtener el IA se uso 1 L de Tween 80 al 0.1 %
por cada 200 g de arroz, la mezcla se pasó por una
gasa esterilizada para separar el arroz y obtener el
hongo. La concentración de esporas fue determinada
por conteo directo en una cámara de Neubauer. Para
obtener dicha concentración de esporas se coloca-
ron 10 µL en la cámara, el conteo de esporas/mm
2
se llevó a cabo en el cuadrante central, se tomaron
cinco puntos (cuatro esquinas y centro) y se aplicó
la siguiente fórmula: Número de esporas/mL =
(esporas por mm
2
) (factor de dilución) (10 000).
Prueba de preferencia alimenticia
Con el propósito de elegir el fagoestimulante
más adecuado para hacer atractiva la formulación
para el insecto se utilizó el método de dos alterna-
tivas Bartelt
et al
. (1990) modifcado. Se evaluó el
extracto de garbanzo y el aceite vegetal de maíz.
Para preparar el extracto de garbanzo se remojaron
500 g de grano previamente lavado en 1.3 L de agua
destilada durante 16 h, posteriormente se homoge-
neizó la mezcla en una licuadora marca Osterizer.
En una caja de Petri se colocó un rectángulo de 2
g con cada dieta artifcial en polos opuestos para
oFrecerla al insecto de prueba. La dieta artifcial con
-
sistió en 21 mL para el caso del aceite vegetal o 21 g
para el caso del extracto de garbanzo. Se realizaron
15 repeticiones, cada una de las cuales consistió en una
caja de Petri con 10 larvas de
H. virescens
de dos días
de desarrollo y las dos alternativa de dieta. Las cajas de
Petri se sellaron con Paraflm
®
y se incubaron a 28 ºC
por 16 h. Finalmente se congelaron a –30 ºC por 8 h para
inmovilizar a las larvas. El número de larvas presen-
tes en cada rectángulo fue registrado después de 16 h
a fn de determinar la preFerencia alimenticia de las
larvas entre cada fagoestimulante. Los datos obte-
nidos fueron sometidos a una prueba t de Student
(P < 0.05) mediante el paquete estadístico SAS v 9.0.
Microencapsulación
Para elaborar las formulaciones se utilizaron los
polímeros almidón de maíz, maíz nixtamalizado, gela-
tina bovina y aceite de maíz como matriz encapsulante
en ocho combinaciones con la composición de los
ingredientes que aparecen en el
cuadro III
.
Secado por aspersión
. Cada uno de los formula-
dos se procesó en forma de suspensión líquida con un
volumen de 800 mL y una concentración de esporas
de 1 × 10
11
esporas/mL. El ingrediente activo se
obtuvo homogeneizando los granos de arroz con 1 L
de solución de Tween 80 al 0.1 % y posteriormente
fltrando con ayuda de una gasa estéril. Para obtener
el polvo microencapsulado se usó un secador por
aspersión Mini Spray Dryer B-290 Buchi. Las con-
diciones de operación fueron: temperatura de entrada
de 120 ºC y de salida de 70 ºC, una velocidad de
±ujo de 3.34 mL/min, ±ujo de aire de aspersión de
157 mL/s y una presión del aspersor de 6.2 kg/cm
2
.
Con estas condiciones se obtuvo un polvo seco con
la presencia del hongo y una capacidad de adheren-
cia a superfcies. El contenido de humedad de las
muestras del formulado obtenido se analizó con el
método de secado en estufa NMX-F-83-1986. Por
otro lado para observar la morfología y el tamaño
de las microcápsulas se empleó un microscopio
electrónico de barrido Dual Beam marca Fei, modelo
Quanta 3D FEG.
Capacidad de adherencia de las formulaciones a
portaobjetos
La determinación de esta propiedad se realizó con
la fnalidad de seleccionar la Fórmula que proporcionó
mejor adherencia con la metodología de McGuire y
Shasha (1992). Se utilizaron cinco portaobjetos lim-
pios con peso conocido por cada muestra previamente
humedecidos con 100 µL de agua destilada a los
que se les agregó 20 mg del formulado. Después se
inclinaron y se dejaron secar a temperatura ambiente.
Los portaobjetos se colocaron 2 cm por debajo de
una bureta que liberó 25 mL de agua destilada a una
velocidad de 64 mL/min, se movieron hacia adelante
y hacia atrás manualmente hasta vaciar la bureta
(24 s). Los portaobjetos se secaron a temperatura
ambiente, el procedimiento de lavado y de secado
FORMULACIÓN BIODEGRADABLE CONTRA
Heliothis virescens
223
se repitió cinco veces. La pérdida de gránulos en el
portaobjetos se determinó por la diferencia de peso
en cada formulado.
El diseño experimental empleado para elegir
la formulación que presentó mejor adherencia fue
un diseño estadístico aleatorio en arreglo factorial.
Los factores fueron los tres polímeros con 2 niveles
(con y sin el polímero), lo que dio como resultado
ocho tratamientos. El formulado 6 (F6) fue el que se
utilizó para las siguientes pruebas debido a que tuvo
la mejor adherencia al portaobjetos (85.55 ± 1.79 %
por 2 min;
Cuadro III
).
Concentración de esporas
Se disolvió 0.1 g del microencapsulado F6 en 10 mL
de Tween 80 al 0.1 %. Se realizó una dilución 10
–2
para contar las esporas germinadas en la cámara de
Neubauer. Para resaltar las esporas se agregó azul de
lactofenol. Las observaciones se realizaron con un
microscopio marca Leica
®
en el objetivo de 40X, las
esporas se consideraron viables si el tubo germinativo
era dos veces el diámetro de las mismas, después de
24 h de crecimiento en papa, dextrosa, agar (PDA)
(Mata 2008, Lopes
et al.
2013).
Porcentaje de germinación
El porcentaje de germinación de las esporas se
determinó por medio de microcultivos. En una caja de
Petri con glicerina se colocó un portaobjetos con un
cuadro de 1 cm
2
de PDA acidifcada con ácido láctico.
Se prepararon diluciones en serie de la suspensión de
esporas (10
–1
a 10
–5
). Para obtener la dilución 10
–1
se tomó 1 mL de la suspensión de esporas al que
se le colocaron 9 mL de agua destilada estéril con
una solución de Tween 80 al 0.1 %, la dilución se
puso en un vórtex por 1 min. Este procedimiento se
repitió hasta obtener las diluciones necesarias. Sobre
pequeños cuadros de PDA se colocaron 50 μL de la
dilución 10
–5
y se colocó encima un cubreobjetos.
Se incubaron las cajas de Petri a 28 ºC durante 24 h.
Se adicionó azul de lactofenol y se contó el número
de esporas germinadas con la metodología descrita
previamente.
Evaluación de la actividad bioinsecticida de la
formulación microencapsulada
Se elaboraron dos suspensiones a una concentra-
ción de 1 × 10
8
esporas/mL: una de esporas de
M. ani-
sopliae
cepa M20 provenientes de una caja de Petri
con PDA y otra de la formulación microencapsulada.
Se usaron larvas del gusano del fruto de dos días de
desarrollo provenientes del Centro de Biotecnología
Genómica del
Instituto Politécnico Nacional (CBG-
Reynosa). Las larvas se colocaron en un recipiente
de plástico de 30 mL y se les agregó cada una de las
suspensiones, se dejaron en contacto durante 1 min
y luego se colocaron de manera individual en un
recipiente de plástico de 30 mL con dieta artifcial
para continuar su desarrollo. Para cada tratamiento
se utilizaron 25 larvas por triplicado, lo que dio un
total de 75 insectos. Para el testigo negativo se usó
una solución de Tween 80 al 0.1 %. Posteriormente
los recipientes se almacenaron a 25 ºC. Se evaluó el
total de larvas muertas y el proceso de infección del
hongo durante siete días. Los datos de mortalidad
fueron corregidos por la fórmula de Abbott (1925).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Es este trabajo la producción de esporas aéreas
y micelio fue de 10
9
esporas/g de arroz a los 20
días, lo que se considera una cantidad aceptable. Al
respecto Taylor
et al
. (2013) produjeron entre 10
8
y
10
9
esporas/g de arroz
de
B. bassiana
, mientras que
Jenkins (1995) logró producir 10
10
esporas/g de sus-
trato de
M. anisopliae
a través de una fermentación
bifásica. En la prueba de patogenicidad las tres cepas
(M20, M21 y M22) causaron el 100 % de mortalidad
de larvas en el quinto estadio del gusano del fruto en
14 días, lo que demostró la patogenicidad del hongo
sobre este insecto.
CUADRO III.
COMPOSICIÓN DE FORMULACIONES DE BIOINSECTICIDAS A BASE DE
M. anisopliae
Y POLÍ-
MEROS NATURALES
F1
F2
F3
F4
F5
F6*
F7
F8
Almidón de maíz
8.67 g
13 g
13 g
26 g
-
-
-
-
Maiz nixtamalizado
8.67 g
-
13 g
-
13 g
-
26 g
-
Gelatina bovina
8.67 g
13 g
-
-
13 g
26 g
-
-
Fagoestimulante
20 mL
20 mL
20 mL
20 mL
20 mL
20 mL
20 mL
20 mL
Protector de luz UV
4 g
4 g
4 g
4 g
4 g
4 g
4 g
4 g
Ingrediente activo
10
11
10
11
10
11
10
11
10
11
10
11
10
11
10
11
* Formulado con mejor porcentaje de adherencia (85.55 ± 1.79 %)
M. Acuña Jiménez
et al.
224
Prueba de preferencia alimenticia
Los fagoestimulantes son aditivos necesarios en
algunas formulaciones de bioinsecticidas debido
a que tienen la fnalidad de hacer más atractivo el
producto al insecto blanco. En este trabajo el mejor
de los fagoestimulantes fue el aceite de maíz debido
a que obtuvo una mayor aceptación de los insectos
de prueba (6.6 ± 1.24 larvas) en contraste con el
preparado de garbanzo (2.7 ± 1.24 larvas), por lo
que se le adicionó aceite de maíz a la formulación
(
Cuadro IV
).
De Luna
et al.
(2011) encontraron que los fago-
estimulantes más adecuados para
Spodoptera exigua
(Huber) fueron la espiga de maíz y el repollo, entre
cinco fagoestimulantes probados (espiga de maíz,
mazorca de maíz fresca, alfalfa, hojas de sorgo y
repollo), lo que muestra la capacidad del insecto para
seleccionar un fagoestimulante en particular.
En el caso
H. virescens
aún cuando el insecto es
políFago, prefrió los componentes del aceite vegetal
(ácidos grasos insaturados). Este insecto no sólo es
plaga del cultivo de tomate sino también del garbanzo
(del cual se alimenta tanto del follaje como del fruto
tierno). En cuanto al cultivo de garbanzo, la plaga
prefere al Fruto cuando este se encuentra en la vaina,
pero ya no es preferido cuando está fuera de ella,
como grano. Por otro lado, el aceite vegetal resultó
ser más económico y fácil de conseguir en el mercado
que el garbanzo, por lo que es más recomendable para
la elaboración de este tipo de microencapsulados.
Capacidad de adherencia de las formulaciones a
portaobjetos
Los polímeros biodegradables proporcionan a los
microencapsulados la capacidad de adherencia al
follaje de la planta cuando es necesario. De esa ma-
nera dan resistencia al bioinsecticida ante situaciones
extremas como el lavado por la lluvia o el arrastre
por el viento. La formulación que proporcionó mejor
adherencia a portaobjetos fue la F6, que contenía
M. anisopliae
en una concentración de 1.49 ×10
9
esporas/mL, 26 g de gelatina bovina, 20 mL aceite de
maíz y 4 g de colorante rojo (
Fig. 1
). Según Winder
et al.
(2003) la microencapsulación es una buena
estrategia para realizar formulaciones efectivas. Los
autores utilizaron alginato de sodio, gelatina y agar,
con lo que lograron formar microcápsulas con hongos
y virus entomopatógenos de 100 µm de tamaño. Lo
que demuestra que las microcápsulas interferen con
la germinación de las esporas al producir una mayor
resistencia para salir de la microcápsula. El microen-
capsulado de este estudio logró liberar el IA después
de 20 días de haber sido elaborado. El IA pudo crecer
en PDA aún con la resistencia que le proporcionan
los aditivos empleados lo que indica, además, una
posible ventaja de la formulación para su liberación
continua en futuras pruebas de invernadero y campo.
En esta investigación la gelatina bovina confrió
mayor adherencia a la superfcie del portaobjetos
(85.55 ± 1.79 %), lo que da al microencapsulado ma-
yor capacidad para adherirse a las superfcies donde
se asperje y mayor resistencia a los efectos del lavado
por lluvia, factor que puede limitar su actividad en
invernadero y en campo.
Microencapsulación
Se obtuvo un microencapsulado de color rojo,
de tamaño menor a 20 µ
m con 1.49 × 10
9
esporas/g
y una humedad de 8.74
± 3.6 %. El porcentaje de
CUADRO IV.
PREFERENCIA ALIMENTICIA DE LARVAS
DE
H. virescens
F. A DOS FAGOESTIMULAN-
TES
Fagoestimulante
Media del número de larvas ± DE
Aceite de maíz
6.6 ± 1.24
ª
Granos de garbanzo
2.7 ± 1.24
b
Cada valor representa la media de tres réplicas. Las letras a y b
en la columna indican diFerencias estadísticas signifcativas entre
tratamientos (p < 0.05). DE = Desviación estándar
F1
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
b
b
a
c
dd
dd
F2
Adherencia (%)
F3
F4
Formulaciones microencapsuladas
F5
F6
F7
F8
Fig. 1.
Porcentajes de adherencia a portaobjetos de las matri-
ces microencapsulantes. * F6 = Formulado con mayor
porcentaje de adherencia (85.55 ± 1.79 %), ²3, ²4, ²7
y F8 = Formulaciones que no mostraron adherencia a
portaobjetos después de 5 lavados (64 mL/min durante
24 s). Cada valor en las barras representa la media de tres
réplicas, las líneas verticales simbolizan la desviación es-
tándar. Letras distintas indican diFerencias signifcativas
(p < 0.05)
FORMULACIÓN BIODEGRADABLE CONTRA
Heliothis virescens
225
germinación de esporas al inicio, antes del secado, fue
de 88.7 ± 0.6 % en la suspensión líquida y al fnal del
secado bajó
a 5.4
± 0.6 %. Esto último concuerda con
investigaciones realizadas en secado por aspersión
con este tipo de equipos, donde los porcentajes de
germinación bajan signifcativamente. A
ún cuando
el secado por aspersión ocasiona la disminución en
la viabilidad de las esporas de los hongos entomo-
patógenos, este método podría tener potencial para
formar las microcápsulas debido a su bajo costo.
Horaczeck y Viernstein (2004) demostraron que
M. anisopliae
fue más resistente al estrés por calor
que
B. brongniarti
, ya que el primero puede tolerar
50 ºC durante 2 min sin pérdida de viabilidad. La
combinación de temperaturas que reportaron como
más adecuada
de entrada y salida Fue de 60 y 40 ºC,
a pesar de que dicha combinación hace que se pierda
el 65 % de la viabilidad inicial germinación (24 h de
incubación en PDA). La pérdida máxima de viabili-
dad para
M. anisopliae
se registró a los 100 ºC en que
la germinación desciende al 3.8 % con un porcentaje
de humedad en las microcápsulas de 5.7 %, mientras
que para
B. brongniatii
en estas condiciones hubo un
0 % de germinación.
En nuestro proceso se obtuvo un porcentaje de
germinación de esporas bajo (5.4 ± 0.6 %), lo que
confrma los valores registrados en otros trabajos para
este hongo. Una vez determinados los parámetros en
el secado (temperaturas de entrada de 120 ºC y de
salida de 70 ºC) se logró obtener un gránulo seco,
lo que podría servir de base para pruebas con tem-
peraturas de entrada más bajas (60 ºC y 70 ºC) con
la fnalidad de aumentar la viabilidad de esporas y
mejorar el nivel de la actividad insecticida.
Evaluación de la actividad bioinsecticida
El resultado de este bioensayo con la for-
mulación microencapsulada usando larvas del
primer estadio del gusano del fruto tuvo una
mortalidad acumulada de 10.31 ± 2.3 % a los 7
días del contacto con el hongo que, comparada
con la del testigo (2.67 ± 2.3 %) demuestra una
baja actividad insecticida del microencapsula-
do (
Fig. 2
). Esto concuerda con los valores de
viabilidad de esporas que inicialmente fue del
88.7 % y bajó al 5 % después del proceso de secado.
No obstante, al segundo día después de haber estado
en contacto con la formulación las larvas mostraron
los síntomas típicos de infección por hongos: inac-
tividad, cese de alimentación y protuberancias en el
dorso, mientras que en el testigo se observaron larvas
sanas con desarrollo normal, lo que evidenció la ca-
pacidad de infección del hongo, más no su virulencia.
CONCLUSIONES
Se obtuvo un formulado microencapsulado a base
de
M. anisopliae
de color rojo con un tamaño de
partícula menor a 20 µ
m, con 1.49 × 10
9
esporas/g
y una humedad de 8.74
± 3.6 %.
En el microencapsulado el aceite vegetal fue el
fagoestimulante preferido sobre el garbanzo por los
insectos de prueba. Por otro lado, la gelatina bovina
fue el componente que proporcionó la mayor adhe-
rencia del compuesto a la superfcie de prueba del
portaobjetos.
La actividad insecticida del microencapsulado
obtenido fue baja debido a que la viabilidad de las es-
poras se redujo en un 94.4 % por lo que se consideró
no satisfactoria. Se recomienda probar temperaturas
más bajas en el proceso de secado e incrementar la
concentración del IA con el fn de aumentar la esta
-
bilidad y la viabilidad de esporas durante el proceso
de elaboración de la fórmula.
AGRADECIMIENTOS
Al CONACyT, CIIDIR-IPN Unidad Sinaloa,
CBG Reynosa, PIFI. Al técnico investigador Jesús
Manuel Villegas Mendoza del CBG, por su ayuda en
los bioensayos de laboratorio. A la Dra. Mayahuel
Ortega del CNMN por su apoyo en la obtención de
imágenes por microscopia MEB.
Este trabajo se realizó con el apoyo económico
del proyecto: SIP-IPN 20140490 Diseño y evaluación
de bioinsecticidas micro- y nano-encapsulados para
el control de plagas del tomate.
Fig. 2.
Porcentajes de mortalidad de
H. virescens
F.
expuestos a
esporas microencapsuladas de
M. anisopliae
. Cada barra
representa la media de tres réplicas, las líneas vertica-
les simbolizan la desviación estándar. Letras distintas
indican diFerencias signifcacivas entre tratamientos
(p < 0.05)
0
2
4
6
8
10
12
14
Control
b
a
Formulación
microencapsulada
Mortalidad (%)
M. Acuña Jiménez
et al.
226
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