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Sistema de Información Científica
Red de Revistas Científicas de América Latina y el Caribe, España y Portugal
Rev. Int. Contam. Ambie. 32 (3) 339-351, 2016
DOI: 10.20937/RICA.2016.32.03.08
AISLAMIENTO Y EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA LIGNINOLÍTICA DE
MACROMICETOS DEL ESTADO DE VERACRUZ, MÉXICO
Wilberth CHAN CUPUL
1
*, Gabriela Patricia HEREDIA ABARCA
2
y
Refugio RODRÍGUEZ VÁZQUEZ
3
1
Laboratorio de Fitopatología y Control Biológico, Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias, Univer-
sidad de Colima, kilómetro 40 Autopista Colima-Manzanillo, Tecomán, Colima, México, C.P. 28100
2
Laboratorio de Micromicetos, Instituto de Ecología A. C. Carretera Antigua a Coatepec 351, El Haya, Xalapa,
Veracruz, México, C.P. 91070
3
Laboratorio de Xenobióticos, Centro de Investigación y de Estudios Avanzados, Instituto Politécnico Nacional.
Avenida IPN 2508, San Pedro Zacatenco, Ciudad de México, México, C.P. 07360
* Autor para correspondencia: wchan@ucol.mx
(Recibido mayo 2015; aceptado noviembre 2015)
Palabras clave:
biotecnología ambiental, lacasa, manganeso peroxidasa, micobiota nativa, fermentación líquida
y sólida
RESUMEN
La diversidad fúngica del estado de Veracruz, México, es una importante fuente para la
obtención de enzimas con valor biotecnológico. El objetivo de este estudio fue aislar y
evaluar cualitativa (placas de agar) y cuantitativamente (en fermentación líquida
y sólida) la actividad enzimática ligninolítica de macromicetos nativos. De un total
de 70 aislamientos, 41 presentaron actividad lacasa en la evaluación cualitativa. Por
destacar en el ensayo cualitativo se seleccionaron las cepas
Trametes maxima
SM9,
Pycnoporus sanguineus
ACT1 y
Daedalea elegans
PM7 para la evaluación cuantita-
tiva de la actividad lacasa y manganeso peroxidasa (MnP) en los medios de cultivo
líquido: Bose, Koroljova y Sivakumar, así como en los residuos agroindustriales: paja
de trigo, bagazo de caña y aserrín de pino. En el medio Sivakumar se detectó la mayor
actividad lacasa y MnP.
Trametes maxima
SM9 presentó los valores más altos para
lacasa (9121.8 U/mg de proteína) y MnP (477.9 U/mg de proteína), en segundo término
estuvo
P. sanguineus
ACT1 (lacasa = 5422.2 U/mg de proteína y MnP = 41.0 U/mg
de proteína) y
Daedalea elegans
PM7 (lacasa = 1784.2 U/mg de proteína y MnP =
40.0 U/mg de proteína). En fermentación sólida
P. sanguineus
ACT1 obtuvo la mayor
actividad lacasa en paja de trigo (1409.0 U/mg de peso seco) y bagazo de caña (1404.8
U/mg de peso seco). Mientras que la actividad MnP fue mejor sobre bagazo de caña
tanto para
P. sanguineus
ACT1 y
T. maxima
SM9 con 619.0 y 519.6 U/mg de peso
seco, respectivamente. Las cepas
Trametes maxima
SM9 y
P. sanguineus
ACT1 son
consideradas como buenas candidatas para la producción de lacasa y MnP.
Key words:
environmental biotechnology, laccase, manganese peroxidase, native mycobiota, submerged and
solid state fermentation
W. Chan Cupul
et al.
340
ABSTRACT
Fungal diversity in the state of Veracruz, Mexico, is a source of enzymes with bio-
technological value. The objective of this study was to isolate and evaluate quali-
tatively (in Petri dishes) and quantitatively (in liquid and solid fermentation) the
ligninolytic enzyme activities of native macromycetes. Seventy isolates were made,
and 41 showed laccase activity in the qualitative assessment. The best strains from
the qualitative assessment were
Trametes maxima
SM9,
Pycnoporus sanguineus
ACT1 and
Daedalea elegans
PM7. These strains were chosen to evaluate the laccase
and manganese peroxidase (MnP) activities in Bose, Koroljova and Sivakumar liq-
uid culture media and for agroindustrial waste in wheat straw, sugar cane bagasse
and pine sawdust. The highest laccase and MnP activities were obtained in Sivakumar
culture medium.
Trametes maxima
showed the highest values for laccase (9121.8 U/
mg of protein) and MnP (477.9 U/mg of protein) activities, followed by
P. sanguineus
ACT1 (laccase = 5422.2 U/mg of protein and MnP = 41.0 U/mg of protein) and
D.
elegans
PM7 (laccase = 1784.2 U/mg of protein and MnP = 40.0 U/mg of protein).
In regards to the solid state fermentation,
P. sanguineus
ACT1 produced the highest
laccase activity on wheat straw (1409.0 U/mg dry weight) and sugar cane bagasse
(1404.8 U/mg dry weigh). Meanwhile, MnP activities were higher in sugar cane ba-
gasse for
P. sanguineus
ACT1 and
T. maxima
SM9 with 619.0 and 519.6 U/mg dry
weight, respectively.
Trametes maxima
SM9 and
P. sanguineus
ACT1 are considered
good candidates for laccase and MnP production.
INTRODUCCIÓN
Los macromicetos lignícolas en su mayoría
pertenecen al grupo de los basidiomicetos y son
los organismos más efcientes en la degradación de
la lignina, polímero natural de estructura compleja
(Ruiz-Dueñas
et al
. 2014). Únicamente los hongos
ligninolíticos y especialmente, los macromicetos
lignícolas son capaces de mineralizar la lignina en
conjunto con los otros componentes de la madera
(Harris-Valle
et al
. 2014). En la degradación de
estos compuestos están involucradas algunas en-
zimas fúngicas extracelulares tales como la lacasa
(EC 1.10.3.2), manganeso peroxidasa (MnP, EC
1.11.1.14) y lignina peroxidasa (LiP, EC 1.11.1.13),
las cuales poseen múltiples aplicaciones biotecno-
lógicas en la industria papelera, textil, alimentaria,
farmacéutica y ambiental (Osma
et al
. 2014).
Estudios recientes mencionan que la prospec-
ción enzimática en la micobiota nativa es una
herramienta biotecnológica para enfrentar proble-
mas ambientales como la contaminación del agua
(Hernández-Luna
et al
. 2008, Tapia-Tussell
et al
.
2011 y Cruz-Ramírez
et al
. 2012). Se ha demostrado
que la micobiota nativa posee la habilidad para de-
colorar agua contaminada con azul ácido 74, verde
reactivo 19, rojo reactivo 195 (Tapia-Tussell
et al
.
2011), antraquinona, cristal violeta y colorantes tipo
azo (Hernández-Luna
et al
. 2008). Además, se ha
comprobado que las enzimas ligninolíticas poseen la
habilidad para transformar o degradar plaguicidas de
diferente grupo estructural tales como las triazinas
(Chan-Cupul
et al
. 2014), organoclorados (Marco-
Urrea y Reddy 2012), organofosforados (Huifang
et al
. 2013), entre otros. Por lo tanto, el número
de investigaciones dirigidas hacia la búsqueda y
estudio de nuevas especies y cepas de macrohongos
lignícolas con alta capacidad para producir enzimas
ligninolíticas se ha incrementado considerablemente
en las últimas décadas (Fernández-Fernández
et al
.
2013).
En México, la diversidad fúngica se calcula entre
las 140 000 y 200 000 especies, de las cuales menos
del 10 % han sido estudiadas (Guzmán 1995). En
cuanto a macromicetos se han descrito aproximada-
mente 4 000 especies (Guzmán 1998). Respecto a la
magnitud de la riqueza de las especies fúngicas por
entidad federativa aún se está lejos de contar con un
conocimiento representativo. Sin embargo, el esta-
do de Veracruz posee el mayor número de especies
descritas, habiéndose registrado 1517 (Guzmán
et al
.
2003, Aguirre-Acosta
et al
. 2014). Pese a que México
es uno de los países con mayor diversidad fúngica,
se han realizados pocos estudios de prospección en-
zimática en macrohongos lignícolas para encontrar
especies productoras de enzimas de importancia
biotecnológica. Entre los estudios realizados destacan
los trabajos de Hernández-Luna
et al
. (2008), Tapia-
Tussell
et al
. (2011), Cruz-Ramírez
et al
. (2012) y
Chan-Cupul (2014) desarrollados con especímenes
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE MACROMICETOS LIGNÍCOLAS
341
colectados en los estados de Nuevo León, Yucatán,
Hidalgo y Veracruz, respectivamente.
La prospección de la riqueza fúngica nativa en la
búsqueda de cepas con potencial para la producción
de enzimas de importancia biotecnológica, es una
actividad prioritaria ante la constante pérdida de
la biodiversidad de los ecosistemas locales. Por lo
tanto, el presente estudio tuvo como objetivos aislar
y seleccionar macromicetos nativos del estado de
Veracruz con
potencial para la producción de en-
zimas ligninolíticas. Asimismo, para las cepas con
mayor potencial enzimático, se pretendió evaluar
su actividad lacasa y manganeso peroxidasa (MnP)
en tres medios de cultivo líquido y valorar así la
producción de ambas enzimas bajo condiciones de
fermentación sólida (paja de trigo, bagazo de caña
y aserrín de pino).
MATERIALES Y MÉTODOS
Colecta, aislamiento e identifcación de macromi
-
cetos lignícolas
Los carpóforos fueron colectados de diversos
sitios en nueve municipios del estado de Veracruz,
México en los meses de septiembre de 2011 a abril
de 2012 (
Cuadro I
). El aislamiento del micelio se
realizó a través de la desinfección de fragmentos
(0.5-1.0 cm
2
) de los carpóforos con hipoclorito de
sodio (5 %), alcohol etílico (70 %) y agua destilada.
Los fragmentos desinfectados fueron depositados
sobre placas con agar papa dextrosa (APD) suple-
mentado con cloranfenicol (Lab. Sophia, México) y
benomyl (Biesterfeld Co. USA) a una concentración
de 3 ppm, para evitar el crecimiento de bacterias y
hongos microscópicos (Chaparro
et al
. 2009). Las
placas inoculadas se incubaron a 25 ºC durante 8
días (d), el micelio emergente se transfrió a cajas de
Petri con APD para la obtención de cultivos puros.
Las cepas aisladas se conservaron a 4 ºC en APD. La
identifcación de los carpóForos (
Fig. 1
) que dieron
origen al micelio Fueron identifcados con base en
sus características morfológicas por medio de claves
taxonómicas especializadas (Gilbertson y Ryvarden
1987, Ryvarden 1991, Núñez y Ryvarden 2001,
Guzmán 2008).
Determinación cualitativa de la actividad enzimá
-
tica ligninolítica
Para seleccionar las cepas enzimáticamente activas,
se realizaron ensayos de coloración del ácido 2,2’-azi-
no-bis[3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico] (ABTS) en
el medio de cultivo descrito por Rubilar-Araneda
(2007), el cual contiene (g/L): glucosa (10), KH
2
PO
4
(2), MgSO
4
7H
2
O (0.5), CaCl
2
2H
2
O (0.1), tartrato de
amonio (0.2), ABTS (0.2) y agar (22) a un pH de 5.5.
CUADRO I.
MUNICIPIOS Y LOCALIDADES INCLUIDOS EN LA COLECTA DE MACROMICETOS LIGNÍCO-
LAS EN EL ESTADO DE VERACRUZ, MÉXICO
Municipio
Localidades
Clave
Ubicación
Actopan
Actopan
ACT
19º30¨21.16” N, 96º 36¨31.23” O
Centro de Investigaciones Costeras la Mancha
CLM
19º35¨36.96” N, 96º22´51.79” O
Acajete
Mesa de hierba
MH
19º32¨43.11” N, 96º 59¨43.11” O
Coatepec
Coatepec
COA
19º28¨15.71” N, 96º 57¨31.12” O
Paso de la loma
PM
19º30¨18.99” N, 96º 57¨19.62” O
Palo blanco
PB
19º32¨15.71” N, 97º 00¨23.38” O
Huatusco
Las cañadas
CÑDA
19º09¨52.86” N, 96º 58¨48.84” O
San Andrés Tuxtlas
Adolfo Ruiz Cortines
SAT
18º32¨58.90” N, 95º 09¨37.75” O
Santa Marta
SM
18º19¨10.83” N, 94º 49¨55.69” O
Playa escondida
PE
18º35¨32.68” N, 95º 03¨01.65” O
Tlalnelhuayocan
Vega del Pixquiac
VP
19º32¨21.23” N, 97º 00¨47.29” O
Veracruz
Humedal Veracruzano
HV
19º08¨35.70” N, 96º09´05.57” O
Xalapa
Santuario de bosque de niebla
SBN
19º30¨48.53” N, 96º 56¨33.10” O
Jardín Botánico Francisco Javier Clavijero
JB
19º30¨44.40” N, 96º56¨32.55” O
Parque vivero
PV
19º30¨51.07” N, 96º 56¨38.53” O
Xico
Cascadas de Texolo
TXL
19º24¨06.55” N, 96º 59¨38.76” O
W. Chan Cupul
et al.
342
El medio de cultivo se esterilizó en autoclave a 120 ºC
durante 15 min, el ABTS se añadió al enfriarse dicho
medio de cultivo a 40-45 ºC y se distribuyó en cajas
de Petri de 90 mm de Ø. Posteriormente, se extrajo
un disco de los hongos aislados en APD y se colocó
en el centro de la caja Petri, las placas se incubaron
25 ºC durante 8 d. La actividad enzimática (lacasa)
se consideró positiva ante la presencia de un halo de
oxidación de color verde-oscuro a verde-esmeralda
(Rubilar-Araneda 2007). Cada 24 h se cuantifcó el
diámetro de la colonia del hongo y el diámetro del
halo de oxidación del ABTS mediante una escuadra
milimétrica. Con ambos valores, se calculó el índice
de potencia (IP) dividiendo el diámetro del halo de
oxidación entre el diámetro de crecimiento del micelio,
para cada cepa se inocularon cuatro placas.
Actividad enzimática ligninolítica en fermenta
-
ción líquida
Se seleccionaron tres cepas aisladas con el mayor
IP para cuantifcar la producción de lacasa y man
-
ganeso peroxidasa (MnP) en tres diferentes medios
de cultivo líquido, los cuales fueron seleccionados
por ser reportados en literatura científca como me
-
dios para la producción de enzimas ligninolíticas
(
Cuadro II
). Los medios de cultivo se esterilizaron
y se ajustaron a un pH de 4.5. Para la inoculación se
depositaron cuatro discos de micelio agar (5 mm de
Ø) en un matraz Erlenmeyer de 250 mL de capaci-
dad con 120 mL del medio de cultivo. Los matraces
inoculados fueron incubados en agitación orbital a
120 rpm, 25 ± 1 ºC y en ausencia de luz durante 12
d. Diariamente se extrajeron asépticamente alícuotas
de 3 mL del extracto de cultivo para la cuantifcación
de la actividad de las enzimas lacasa y MnP, además
del contenido de proteína. Previo a la cuantifcación
enzimática, el extracto de cultivo fue centrifugado a
7500 rpm durante 10 min para liberar el sobrenadante
de los restos celulares. Para cada cepa se emplearon
tres réplicas por medio de cultivo.
Actividad enzimática ligninolítica en fermenta
-
ción sólida
Para conocer el potencial de las tres cepas con
mayor IP para la producción de enzimas en sustratos
orgánicos de bajo costo respecto a los cultivos en
medios líquidos, se evaluó la producción de lacasa
y MnP en tres sustratos agroindustriales disponibles
para el estado de Veracruz, los cuales fueron: paja de
trigo, bagazo de caña y aserrín de pino. Para ello, se
preparó el inóculo que consistió en la reproducción
masiva del micelio en semillas de sorgo (
Sorghum
vulgare
Pers.). Las semillas se tamizaron para elimi-
nar residuos y se hidrataron en agua por 24 h hasta
obtener aproximadamente un 75 % de humedad. En
bolsas de polipapel se depositaron 120 g de semillas
de sorgo hidratadas y se esterilizaron a 125 ºC por 15
min. Una vez que las semillas se enfriaron a tempe-
ratura ambiente, se abrieron las bolsas asépticamente
y se les depositaron 10 discos de micelio agar (5 mm
de Ø) de las cepas a estudiar. Las bolsas se incubaron
a 25 ± 1 ºC por 8 d. La bolsa con semillas de sorgo
colonizadas se consideró como inóculo (Mata
et al
.
2011).
Para el crecimiento de los hongos en los residuos
agroindustriales se homogeneizó cada sustrato a un
tamaño de partícula de 0.5 cm a través del trozado y
A
B
CD
Fig. 1.
Carpóforos colectados en campo. A)
Cymatoderma
elegans
SBN4, B)
Pleurotus
sp. SBN8, C)
Ganoderma
sp. PB1 y D)
Trametes
sp. SBN2
CUADRO II.
COMPOSICIÓN NUTRIMENTAL (g/L)
DE LOS MEDIOS DE CULTIVO LÍQUIDO
EVALUADOS PARA LA PRODUCCIÓN DE
ENZIMAS LIGNINOLÍTICAS.
Componente
Bose
et al
. (2007)
Koroljova
et al
. (1998)
Sivakumar
et al
. (2010)
Glucosa
20
10.0
20.0
Extracto de
levadura
5.0
-
2.5
Peptona
2.0
3.0
-
KH
2
PO
4
1.5
0.6
1.0
K
2
HPO
4
-
0.4
-
(NH
4
)
2
SO
4
1.0
-
0.05
MgSO
4
0.5
0.5
0.5
CaCl
2
0.37
-
0.01
FeSO
4
-
0.0005
0.01
MnSO
4
-
0.05
0.001
ZnSO
4
0.3
0.001
0.001
CuSO
4
-
-
0.002
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE MACROMICETOS LIGNÍCOLAS
343
tamizado. Se pesaron cinco g de cada residuo agro-
industrial, llevándolos al 100 % de su capacidad de
retención de humedad y se depositaron en matraces
Erlenmeyer de 250 mL de capacidad. Los matraces se
esterilizaron a 125 ºC durante 20 min, posteriormente
se les adicionó el inóculo preparado previamente al
5 % (0.5 g). Los matraces inoculados fueron incubados
estáticamente a 25 ± 1 ºC en ausencia de luz durante
30 d. Se emplearon tres réplicas para cada residuo
agroindustrial por cepa evaluada. Cada 72 h se co-
lectó asépticamente 0.5 g de residuo agroindustrial
para la cuantifcación de la actividad lacasa, MnP y
contenido de proteína. Para ello, se realizó un extracto
enzimático que consistió en depositar 0.5 g de residuo
agroindustrial colonizado en un tubo falcón con 5 mL
de amortiguador acetato de sodio pH 4.5. Los tubos se
agitaron horizontalmente durante 20 min, posterior-
mente, fueron centrifugados a 5000 rpm durante 10
min para sedimentar las partículas sólidas. El sobre-
nadante se empleó para la cuantifcación enzimática.
Evaluación de la actividad enzimática
Las actividades lacasa, MnP y contenido de pro-
teína se cuantifcaron espectroFotométricamente. Para
la actividad lacasa fue por la oxidación del ABTS
(Sunil
et al
. 2011) a temperatura ambiente (27-25 ºC)
en una reacción que contiene 5.0 mM de ABTS (100 μL),
100 mM de amortiguador acetato de sodio (800 μL,
pH 4.5) y extracto enzimático (100 μL); el cambio
en la absorbancia se midió durante 5 min a 420
nm (ε = 36000 mM/cm). Una unidad de actividad
lacasa (U) se defnió como la cantidad de enzima
requerida para oxidar 1 μmol de ABTS/mL/min
y se expresó como actividad específca (U/mg de
proteína o U/mg de peso seco) y volumétrica (U/L)
tanto en la fermentación líquida como en la sólida.
La actividad MnP se determinó por el método de
Glenn y Gold (1983). La mezcla de reacción contenía
lactato de sodio 25 mM (50 μL), MnSO
4
2 mM (50 μL),
albúmina de huevo al 0.1 % (50 μL), rojo Fenol al
2 % (50 μL), amorgituador succinato-lactato (pH 4.5)
20 mM (50 μL) y extracto enzimático (700 μL). La
reacción se inició al adicionar 50 μL de H
2
O
2
(2 mM)
y se detuvo a los cinco min con 50 μL de NaOH (2 N).
La absorbancia fue leída contra un testigo sin MnSO
4
en la reacción. El coefciente de extinción molar del
rojo fenol bajo las condiciones de reacción fue de 4460
mM/cm. Una actividad MnP (U) se defnió como la
cantidad de enzima requerida para transFormar 1 μmol
de rojo fenol/mL/min y se expresó como actividad
específca (U/mg de proteína o U/mg de peso seco)
y volumétrica (U/L) tanto en la fermentación líquida
como en la sólida.
El contenido de proteína total en fermentación
líquida se cuantifcó a través del método de BradFord
en el que se emplea una curva patrón con valores co-
nocidos (0, 0.0062, 0.0125, 0.025, 0.05, 0.1 y 0.2 mg/
mL) y albúmina de suero bovino como estándar. La
curva patrón Fue de Y = 0.1615 C − 0.0125 (Y = ab
-
sorbancia, C = concentración de proteína en mg/mL,
R
2
= 0.998).
Análisis de datos
Una vez probados los supuestos de normalidad y
homocedasticidad, se realizaron análisis de varianza
de una ruta y la comparación de medias para deter-
minar los valores signifcativamente diFerentes entre
los valores máximos de la actividad lacasa y MnP por
cada cepa, medio de cultivo y residuo agroindustrial
empleado con el paquete Statgraphics Plus 5.1.
RESULTADOS
Colecta, aislamiento y actividad enzimática cua
-
litativa
A partir de 105 ejemplares colectados, se ob-
tuvieron 70 aislamientos (datos no mostrados)
de macromicetos lignícolas nativos del estado de
Veracruz, 41 de ellos presentaron actividad lacasa
(
Fig. 2
). Las cepas fueron ubicadas en los géneros
Pleurotus
,
Pycnoporus
,
Trametes
,
Stereum
,
Trichap-
tum
,
Ganoderma
,
Schizophyllum
,
Lenzites
,
Xilaria
,
Daedalea
,
Cymatoderma
,
Dictyopanus
,
Polyporus
,
Lentinellus
,
Hexagonia
,
Phellinus
y
Pogonomyces
.
El hongo
Cymatoderma elegans
SBN4 presentó el
mayor IP con un valor de 33.4, seguido por
Pleurotus
sp. SBN8,
Pycnoporus sanguineus
ACT1,
Pleuro-
tus djamor
COA1,
P. sanguineus
SBN3,
Trametes
maxima
SM9 y
Trametes
sp. SBN2, con 19.6, 16.0,
A
B
Fig. 2.
Valoración cualitativa de la actividad lacasa. A) Cepa
con actividad lacasa y B) Cepa sin actividad lacasa. El
círculo rojo corresponde al halo de oxidación del ABTS y
el círculo amarillo corresponde al crecimiento diametral
del micelio del hongo
W. Chan Cupul
et al.
344
15.2, 13.8, 13.0 y 12.9, respectivamente (
Fig. 3
). Sin
embargo, a pesar de que
C. elegans
SBN4 presentó
el IP más alto, no fue seleccionado para los estudios
subsecuentes debido a que produjo una escasa acti-
vidad lacasa en la evaluación cuantitativa (datos no
mostrados). Por lo tanto, únicamente fueron selec-
cionados los aislamientos
Pycnoporus sanguineus
ACT1 (IP = 16.0),
Trametes maxima
SM9 (IP = 13.0)
y
Daedalea elegans
PM7 (IP = 4.9), los cuales pre-
sentaron una sufciente y confable actividad lacasa
en una prueba cuantitativa. La determinación del
IP empleando el halo de coloración del ABTS y el
diámetro de la colonia resultó una herramienta fácil,
rápida y económica para seleccionar los aislamientos
que poseen la actividad lacasa. El valor del IP es
un resultado arbitrario y no determina el potencial
de un aislamiento para la producción de lacasa en
fermentación sólida o líquida.
Actividad enzimática ligninolítica en fermenta
-
ción líquida
En este ensayo la cepa
T. maxima
SM9 mostró la
mayor actividad lacasa a los 7 d en el medio de cultivo
Sivakumar con 9121.8 U/mg de proteína (32867.9 U/L,
Fig. 4E
). Este valor Fue signifcativamente mayor
(
F
= 25.3,
P
= 0.001) a las máximas actividades
encontradas en el mismo medio de cultivo con
D. ele-
gans
PM7 (
Fig. 4A
) y
P. sanguineus
ACT1 (
Fig. 4C
),
al presentar una actividad lacasa de 1784.2 U/mg
proteína (4349.4 U/L, a los 7 d) y 5422.2 U/mg
proteína (16 256.5 U/L, a los 8 d), respectivamente.
En cuanto a la actividad MnP ocurrió algo similar
a la actividad lacasa. En el medio de cultivo Sivaku-
mar con la cepa
T. maxima
SM9 se obtuvo la mayor
actividad de la enzima con 477.9 U/mg de proteína
(1700.8 U/L) a los 7 d de cultivo (
Fig. 4F
). Este valor
Fue signifcativamente mayor (
F
= 37.2,
P
= 0.0004)
a las máximas actividades obtenidas en el mismo
medio de cultivo con
D. elegans
PM7 (
Fig. 4B
)
y
P. sanguineus
ACT1 (
Fig. 4D
), al mostrar una
actividad MnP de 40.0 U/mg de proteína (83.8 U/L,
a los 8 d) y 41.0 U/mg de proteína (146.0 U/L, a los
5 d), respectivamente.
En los medios de cultivo Bose y Koroljova se
detectaron bajas actividades lacasa y MnP para los
tres aislamientos evaluados. En el medio de cultivo
Bose la mayor actividad lacasa fue de 6.7 (22.0 U/L,
a los 8 d), 3.1 (7.9 U/L, a los 3 d) y 12.9 (28.6 U/L, a
20
Índice de potencia (IP)
30
40
10
0
Cymatoderma elegans (SBN4)
Pleurotus sp. (SBN8)
P. saguineus (ACT1)
P. sanguineus (ACT1)
Trametes maxima (SM9)
Trametes sp. (SBN2)
Stereum hirsutum (PM6)
Dictyopanus pusillius (PM2)
Trichaptum biformis (MH1)
Hymenochaete rheicolor (SAT2)
Phellinus gilvus (PV1)
Trichaptum sp. (SBN8)
Echinochaete sp. (SBN7)
Stereopsis burtianum (SAT3)
Aislamientos (cepas)
Polyporus sp. (SAT1)
Trametes versicolor (PB3)
Trametes sp. (PB2)
Xilaria sp. (VP3)
P. sanguineus (PM4)
Ganoderma sp. (PB1)
Lentinellus sp. (MH3)
Trametes villosa (VP2)
Trichaptum biformis (PV2)
Trametes sp. (SBN9)
Daedalea elegans (PM7)
Lenzites sp. (VP1)
Trichaptum sp. (MH2)
Hexagonia sp. (PB4)
Phellinus rimosus (PE3)
Trichaptum sp. (CÑDA1)
Ganoderma sp. (JB1)
Stereum ostrea (PV4)
Stereum sp. (CÑDA2)
Trametes sp. (SAT4)
Schizophyllum commune (PE1)
Trametes villosa (PM9)
Trichaptum sp. (TXL1)
Stereum sp. (PE6)
Trametes sp. (CLM1)
Pogonomyces hydnoides (HV1)
Pleurotus djamor (COA1)
Fig. 3.
Índice de potencia de la actividad cualitativa de lacasa en macromicetos lignícolas nativos del estado de Veracruz,
México (media ± error estándar, n = 4).
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE MACROMICETOS LIGNÍCOLAS
345
los 12 d) U/mg de proteína para
D. elegans
PM7,
P.
sanguineus
ACT1 y
T. maxima
SM9, respectivamente
(
Fig. 4A
,
C
y
E
). Mientras que para la actividad MnP,
la mayor fue de 5.5 (16.2 U/L, a los 6 d), 2.7 (7.0
U/L, a los 3 d) y 1.3 (3.3 U/L, a los 8 d) U/mg de
proteína para
D. elegans
PM7,
P. sanguineus
ACT1
y
T. maxima
SM9, respectivamente (
Fig. 4B
,
D
y
F
).
En cuanto a la actividad lacasa en el medio de cultivo
Koroljova, las máximas fueron de 13.6 (29.4 U/L,
a los 10 d), 673.0 (1379.9 U/L, a los 4 d) y 604.5
(1899.7 U/L, a los 9 d) U/mg de proteína en
D. ele-
gans
PM7,
P. sanguineus
ACT1 y
T. maxima
SM9,
respectivamente (
Fig. 4A
,
C
y
E
). Por su parte, las
máximas actividades de la MnP en el medio Korol-
jova para
D. elegans
PM7,
P. sanguineus
ACT1 y
T.
maxima
SM9 fueron de 1.8 (3.6 U/L, a los 4 d), 22.8
(43.7 U/L, a los 4 d) y 37.6 (73.0 U/L, a los 6 d) U/
mg de proteína, respectivamente (
Fig. 4B
,
D
y
F
).
2000
A)
1500
1000
Actividad lacasa (U/mg proteína)
500
0
012345
Días de cultivo
67
8
Bose
91
01
112
Sivakumar
Koroljova
8000
C)
6000
4000
Actividad lacasa (U/mg proteína)
2000
0
012345
Días de cultivo
67 89
10
11
12
60
B)
45
30
Actividad MnP (U/mg proteína)
15
0
012345
Días de cultivo
67 89
10
11
12
60
D)
45
30
Actividad MnP (U/mg proteína)
15
0
012345
Días de cultivo
67 89
10
11
12
12000
E)
9000
6000
Actividad lacasa (U/mg proteína)
3000
0
012345
Días de cultivo
67 89
10
11
12
600
F)
450
300
Actividad MnP (U/mg proteína)
150
0
012345
Días de cultivo
67 89
10
11
12
Fig. 4.
Actividad lacasa y manganeso peroxidasa (MnP) de
Daedalea elegans
PM7 (A y B),
Pycnoporus sanguineus
ACT1 (C y D)
y
Trametes maxima
SM9 (E y F) en tres medios de cultivo en fermentación líquida: Bose (
), Koroljova (▼) y Sivakumar
(
). Media ± error estándar (n = 3).
W. Chan Cupul
et al.
346
Actividad enzimática ligninolítica en fermenta
-
ción sólida
Se evaluó la actividad lacasa y MnP de los aisla-
mientos
D. elegans
PM7,
P. sanguineus
ACT1 y
T.
maxima
SM9 sobre paja de trigo, bagazo de caña y
aserrín de pino. En este ensayo la máxima actividad
lacasa se obtuvo con el hongo
P. sanguineus
ACT1
cultivado sobre paja de trigo (a los 15 d) y sobre baga-
zo de caña (a los 6 d) con 1409.0 U/mg de peso seco
(118.2 U/L) y 1404.8 U/mg de peso seco (76.7 U/L),
respectivamente (
Fig. 5C
). Ambos valores fueron
estadísticamente mayores (
F
= 12.9,
P
= 0.002) a la
máxima actividad lacasa de
D. elegans
PM7 (a los
21 d) obtenida sobre paja de trigo con 133.9 U/mg de
peso seco (27.2 U/L;
Fig. 5A
). Sin embargo, la máxi-
ma actividad lacasa de
T. maxima
SM9 obtenida en
bagazo de caña (874.4 U/mg de peso seco = 62.1 U/L)
a los 3 d de cultivo (
Fig. 5E
) fue estadísticamente
Fig. 5.
Actividad lacasa y manganeso peroxidasa (MnP) de
Daedalea elegans
PM7 (A y B),
Pycnoporus sanguineus
ACT1 (C y D) y
Trametes maxima
SM9
(E y F) en fermentación sólida en tres residuos agroindustriales: paja de trigo (
), bagazo de caña (▼)
y aserrín de pino (
). Media ± error estándar (n = 3).
200
A)
150
100
Actividad lacasa
(U/mg de peso seco)
50
0
0369
12
Días de cultivo
15
18
21
24
27
30
Aserrín de pino
Paja de trigo
Bagazo de caña
2000
C)
1500
1000
Actividad lacasa
(U/mg de peso seco)
500
0
0369
12
Días de cultivo
15
18
21
24
27
30
300
B)
200
Actividad MnP
(U/mg de peso seco)
100
0
0369
12
Días de cultivo
15
18
21
24
27
30
800
D)
400
600
Actividad MnP
(U/mg de peso seco)
200
0
0369
12
Días de cultivo
15
18
21
24
27
30
800
F)
400
600
Actividad MnP
(U/mg de peso seco)
200
0
0369
12
Días de cultivo
15
18
21
24
27
30
2000
E)
1500
1000
Actividad lacasa
(U/mg de peso seco)
500
0
0369
12
Días de cultivo
15
18
21
24
27
30
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE MACROMICETOS LIGNÍCOLAS
347
igual (
F
= 2.54,
P
= 0.159) a las máximas actividades
obtenidas por
P. sanguineus
ACT1 cultivado sobre
paja de trigo (1409.0 U/mg de peso seco = 118.2 U/L)
y bagazo de caña (1404.8 U/mg de peso seco = 76.7 U/L;
Fig. 5C
). Aún sobre aserrín de pino,
P. sanguineus
ACT1 (990.4 U/mg de peso seco = 100.1 U/L, a los
6 d,
Fig. 5C
) obtuvo signifcativamente (
F
= 32.9,
P
= 0.006) una mayor actividad lacasa en compara-
ción con
T. maxima
SM9 (587.9 U/mg de peso seco
= 60.2 U/L, a los 6 d,
Fig. 5E
) y
D. elegans
PM7
(11.8 U/mg de peso seco = 2.1 U/L, a los 9 d) esta-
blecidos sobre el mismo sustrato (
Fig. 5A
).
En cuanto a la actividad MnP, el bagazo de caña
resultó mejor sustrato para la producción de la enzi-
ma para los hongos
P. sanguineus
ACT1 (a los 12 d)
y
T. maxima
SM9 (a los 27 d) con 619.0 (33.8 U/L)
y 519.6 (36.9 U/L) U/mg de peso seco (
Fig. 5D
y
F
),
respectivamente. Ambos valores Fueron signifcativa
-
mente mayores (
F
= 16.3,
P
= 0.003) a la máxima acti-
vidad MnP de
D. elegans
PM7 (
Fig. 5B
) producida en
el mismo sustrato (65.6 U/mg de peso seco = 18.2 U/L)
a los 12 d. En cuanto a la paja de trigo, resultó ser
signifcativamente (
F
= 76.26,
P
= 0.0001) un mejor
sustrato para la producción de MnP en
P. sangui-
neus
ACT1 (397.0 U/mg de peso seco = 33.3 U/L,
a los 12 d,
Fig. 5D
), aunque no con
T. maxima
SM9
(175.8 U/mg de peso seco = 30.6 U/L, a los 18 d,
Fig. 5F
)
y
D. elegans
PM7 (115.4 U/mg de peso seco = 23.4 U/L,
a los 6 d,
Fig.
4B
). Mientras que para el aserrín
de pino, al comparar las máximas actividades, no
se encontró diFerencia signifcativa (
F
= 1.27,
P
=
0.34) para la producción de MnP en los tres hongos
evaluados, las actividades MnP fueron de 243.5
(13.6 U/L), 317.4 (32.0 U/L) y 250.8 (25.6 U/L)
U/mg de peso seco para
D. elegans
PM7 (a los 9 d,
Fig. 5B
),
P. sanguineus
ACT1 (a los 12 d
, Fig. 5D
) y
T. maxima
SM9 (a los 21 d,
Fig. 5F
), respectivamente.
DISCUSIÓN
En el presente estudio se cuantifcó la actividad
enzimática ligninolítica de macromicetos nativos del
estado de Veracruz. Hasta la fecha son limitados los
estudios enfocados en la búsqueda de especies fúngi-
cas con alto potencial para la producción de enzimas
ligninolíticas (Tapia-Tussell
et al
. 2011). Una herra-
mienta fácil y económica para conocer la habilidad de
una cepa para producir enzimas ligninolíticas como
la lacasa, es la determinación cualitativa a través del
halo de oxidación del ABTS (Rubilar-Araneda 2007,
Sunil
et al
. 2011). Con este halo se calculó el índice
de potencia (IP), defnido como la relación del halo
de oxidación y el crecimiento del micelio, este IP
ha sido empleado en estudios similares (Márquez-
Ortega 2004, Cruz-Ramírez
et al
. 2012, Antonio-
Revuelta 2013). Sin embargo, el IP es un valor que
sobreestima la actividad enzimática de una cepa, al no
dar un valor preciso de su actividad. En este trabajo
se observó que la cepa con mayor IP (
Cymatoderma
elegans
SBN4) no fue precisamente la que produjo
más actividad lacasa en fermentación líquida o sólida,
de hecho no fue seleccionada para tales estudios al
presentar la mínima actividad lacasa en el cultivo
líquido. La oxidación del ABTS y la formación del
halo de oxidación, puede haber sido ocasionada por
otras peroxidasas fúngicas (aril-alcohol oxidasa,
glucosa oxidasa) o por radicales libres (H
2
O
2
u OH
).
La actividad lacasa y MnP en fermentación líquida
se vio favorecida en el medio de cultivo Sivakumar
en las tres especies evaluadas. El medio de cultivo
Sivakumar posee la misma fuente y cantidad de
carbono (glucosa) que el medio Bose. Sin embargo,
posee menos cantidad de nitrógeno ((NH
4
)
2
SO
4
y
extracto de levadura), CaCl
2
, MgSO
4
y KH
2
PO
4
. Es
posible que la baja concentración de estos elemen-
tos en el medio de cultivo Sivakumar favoreciera
la producción de ambas enzimas. Las enzimas lig-
ninolíticas son producidas durante el metabolismo
secundario bajo condiciones limitadas de nitrógeno
(Kaal
et al
. 1995). Asimismo, en macromicetos lig-
nícolas Jegatheesan
et al
. (2012) y Chan-Cupul
et
al
. (2014) han reportado que concentraciones bajas
de CaCl
2
favorecen la actividad lacasa (0.1 mg/L) y
MnP (0.01 mg/L), respectivamente. La función del
CaCl
2
en el medio de cultivo es mantener la estructura
y estabilidad de ambas enzimas. Del mismo modo,
Stoilova
et al
. (2010) sugieren que concentraciones
bajas de MgSO
4
contribuyen a mantener la estabi-
lidad de la lacasa durante periodos prolongados de
incubación. Sin embargo, las altas concentraciones
de sales ((NH
4
)
2
SO
4
, CaCl
2
, MgSO
4
y KH
2
PO
4
) en el
medio de cultivo incrementan su potencial osmótico
y en consecuencia, se puede reducir el crecimiento
del micelio (Beever y Laracy 1986).
Aunado a lo anterior, el medio de cultivo Sivakumar,
a diferencia del medio Bose, posee CuSO
4
(0.001 g/L)
y
MnSO
4
(0.002 g/L) en bajas concentraciones, ambos
elementos son conocidos como inductores de lacasa
(Fonseca
et al
. 2010) y MnP (Kamitsuji
et al
. 2005),
respectivamente. El medio de cultivo Koroljova po-
see 50 % menos contenido de carbono (glucosa) en
comparación con los medios Bose y Sivakumar. El
contenido de carbono y el tipo de fuente son factores
que in±uyen en la producción de enzimas ligninolíticas
(Elisashvili
et al
. 2011). Por lo tanto, podría ser que el
W. Chan Cupul
et al.
348
bajo contenido de carbono en el medio Koroljova sea
la razón de haber encontrado menos actividad lacasa
y MnP en comparación con el medio Sivakumar. Ade-
más, el medio Koroljova carece de CuSO
4
,
compuesto
inductor de lacasas (Shutova
et al
. 2008).
Los valores obtenidos indican que la cepa de
T.
maxima
SM9 presenta una alta producción de lacasa,
al menos en el medio de cultivo Sivakumar. La maxi-
ma actividad lacasa alcanzada por
T. maxima
SM9
se obtuvo a los 7 d de cultivo (9121.8 U/mg de pro-
teína = 32867.9 U/L), valor mucho mayor que otras
reportadas para la misma especie por Songulashvili
et al
. (2007) y Elisashvili
et al
. (2011) con 13 500.0
y 8600.0 U/L, respectivamente. Es bien conocido
que el género
Trametes
es productor de lacasas, entre
las especies reportadas están
Trametes versicolor
(1200 U/L, Rodríguez-Couto
et al.
2002),
Trametes
ochracea
(3900.0 U/L, Elisashvili
et al
. 2011) y
Trametes trogii
(14 200.0 U/L, Zouari
et al
. 2006).
Sin embargo, los valores reportados son menores
a los obtenidos con
T. maxima
SM9. Asimismo,
T.
maxima
SM9 resultó excelente productor de MnP
en el medio de cultivo Sivakumar con 477.9 U/mg
proteína (=1700.8 U/L), valor superior al reportado
para una cepa de
T. maxima
(610 U/L) por Elisashvili
et al
. (2011). Inclusive, otras especies de
Trametes
presentan menor actividad MnP, por ejemplo:
Tra-
metes zonata
(360 U/L, Songulashvili
et al
. 2007),
Trametes unicolor
(590 U/L, Elisashvili
et al
. 2011)
y
Trametes versicolor
(150 U/L, Lorenzo
et al
. 2002).
Adicionalmente,
P. sanguineus
ACT1 destacó por
su buena producción de lacasa y MnP. Al igual que
con
T. maxima
SM9, el medio de cultivo Sivakumar
permitió la mayor producción de dicha enzima por
P. sanguineus
ACT1. Las máximas actividades para
lacasa y MnP fueron de 5422.2 U/mg de proteína
(16 256.5 U/L) y 41.5 U/mg de proteína (146.0 U/L),
respectivamente. La actividad lacasa obtenida por
P.
sanguineus
ACT1 es ligeramente menor a la actividad
reportada por Ramírez-Cavazos
et al
. (2014) con una
cepa nativa del noreste de México, la cual presentó
20 000 U/L en un medio enriquecido con jugo de
tomate y glucosa/bactopeptona. La actividad MnP de
P. sanguineus
ha sido menos estudiada en compara-
ción con la de la lacasa. Al respecto, Watanabe
et al
.
(2012) reportaron una baja actividad de MnP (0.08
ABS/min) con una cepa de
P. sanguineus
cultivada en
efuentes de la industria Farmacéutica. Sin embargo,
los valores reportados por Watanabe
et al
. (2012) no
se pueden comparar con los de este estudio debido a
que fueron presentados con una unidad de medición
(ABS/min) diferente a la empleada en este trabajo
(U/L y U/mg de proteína).
La actividad enzimática ligninolítica (lacasa y
MnP) en macromicetos lignícolas depende de la
composición del medio de cultivo empleado para su
producción y es regulada por diversos nutrientes tales
como la glucosa, nitrógeno y iones metálicos (Cu
2+
,
Mn
2+
, Mg
2+
, Fe
2+
) (Elisashvili
et al
. 2011). Además,
la producción de lacasa y MnP se ve afectada por
numerosos factores involucrados en el cultivo tales
como la composición y la fuente de nutrientes (C y N),
el pH, la temperatura, la agitación y la presencia de
inductores como etanol, alcohol veratrílico, compues-
tos análogos de la lignina, etcétera (Rodríguez-Couto
et al
. 2002).
La fermentación sólida para la producción de
enzimas resulta más económica que la fermentación
líquida en medios de cultivo con ausencia de induc-
tores enzimáticos (Demir
et al
. 2011). Por lo tanto,
si se desea producir enzimas con menor impacto am-
biental y a menor costo, la fermentación sólida es una
alternativa a considerar. Los resultados del presente
estudio indican que la paja de trigo permitió la mayor
actividad lacasa en
D. elegans
PM7 (133.8 U/mg
de peso seco a los 21 d) y
P. sanguineus
ACT1
(1408.9 U/mg de proteína a los 15 d), mientras que
en el bagazo de caña,
T. maxima
SM9 produjo su
máxima actividad lacasa (874.4 U/mg de peso seco
a los 3 d). En cuanto a la actividad MnP, las cepas
P.
sanguineus
ACT1 (619.0 U/mg de peso seco a los
12 d) y
T. maxima
SM9 (519.5 U/mg de peso seco a
los 27 d), presentaron la mayor actividad MnP sobre
bagazo de caña. Para
D. elegans
PM7, en el aserrín
de pino fue que se produjo la mayor actividad MnP
(243.4 U/mg de peso seco a los 9 d). En fermentación
sólida
P. sanguineus
ACT1 fue el hongo con mayor
actividad lacasa y MnP, dejando en segundo término
a
T. maxima
SM9 y
D. elegans
PM7. En la fermenta-
ción líquida fue
T. maxima
SM9 el hongo con mayor
actividad lacasa, dejando en segundo término a
P.
sanguineus
ACT1
y
D. elegans
PM7.
La composición química de los sustratos agroin-
dustriales di±ere entre sí. De acuerdo con el trabajo
de López-Miranda
et al
. (2009) y Prinsen (2010), la
paja de trigo (16.85 %) y el bagazo de caña (23.09 %)
poseen menos lignina en comparación con el aserrín de
pino (26.5 %), y puede ser que el menor contenido de
lignina en la paja de trigo y el bagazo de caña facilite
la accesibilidad a la celulosa, fuente de carbono para
el crecimiento fúngico y síntesis enzimática. Esto
da como resultado que la paja de trigo sea el mejor
sustrato para la producción de lacasa, al menos en
D.
elegans
PM7 y
P. sanguineus
ACT1. Por otra parte, el
bagazo de caña resultó mejor sustrato para la produc-
ción de MnP, al menos en
P. sanguineus
ACT1 y en
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE MACROMICETOS LIGNÍCOLAS
349
T. maxima
SM9. Mientras que
D. elegans
PM7 prefrió
el aserrín de pino.
Sin embargo, no se debe descartar
que la síntesis de enzimas ligninolíticas es una carac-
terística especies-cepa dependiente y que, además,
la fuentes y composiciones nutrimentales tanto de
cultivos líquidos y sustratos agroindustriales son un
factor más a considerar en la producción de enzimas.
Este trabajo es una plataforma para continuar es-
tudiando la micobiota nativa del estado de Veracruz,
si se desea conservar el germoplasma fúngico a través
de ceparios ante la constante pérdida de diversidad.
Además de ser una antesala necesaria para los estu-
dios sobre micorremediación en ambientes acuáticos
y edáfcos contaminados en el estado de Veracruz.
CONCLUSIONES
Por la amplia diversidad fúngica que prolife-
ra en el estado en Veracruz es factible encontrar
ejemplares de basidiomicetos lignícolas con poten-
cial para la producción de enzimas ligninolíticas.
Cuando se tiene un gran número de cepas fúngicas,
la determinación del IP empleando la detección
cualitativa de lacasas a través del halo de oxida-
ción del ABTS, es una herramienta fácil, rápida
y económica para seleccionar cepas productoras
de lacasa. Sin embargo, es necesario realizar una
evaluación cuantitativa en fermentación líquida
para determinar si la cepa realmente produce la
enzima. En fermentación líquida la cepa
T. maxima
SM9 destacó por su alta producción de lacasa y
MnP. En el medio de cultivo Sivakumar las especies
probadas tuvieron la mayor producción de lacasa y
MnP. En fermentación sólida,
P. sanguineus
ACT1
destacó por su alta actividad lacasa tanto en paja de
trigo como en bagazo de caña. Mientras que para la
actividad MnP, las especies indicadas para producir
la enzima son
T. maxima
SM9 y
P. sanguineus
ACT1
y el sustrato ideal para ello es el bagazo de caña.
REFERENCIAS
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