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Red de Revistas Científicas de América Latina y el Caribe, España y Portugal
D.R.
© TIP Revista Especializada en Ciencias Químico-Biológicas, 18(2):144-151, 2015
DOI: 10.1016/j.recqb.2015.09.006
I
NFERTILIDAD
MASCULINA
Y
FRAGMENTACIÓN
DEL
ADN
ESPERMÁTICO
:
U
N
PROBLEMA
ACTUAL
Gabriela Alejandra Quintero–Vásquez
1a
,
Rosa María Bermúdez-Cruz
2b
y Julieta Castillo-Cadena
1c
1
Centro de Investigación en Ciencias Médicas, Universidad Autónoma del
Estado de México, C.P. 50130, Toluca, México.
2
Departamento de Genética
y Biología Molecular
CINVESTAV-IPN, C.P. 07360, México, D.F.
E-mails:
a
gabot_2000@hotmail.com,
b
roberm@cinvestav.mx,
c
jcastillo_cadena@hotmail.com
Nota: Artículo recibido el 10 de diciembre de 2013 y aceptado
el 11 de septiembre de 2015.
ARTÍCULO
DE
REVISIÓN
R
ESUMEN
El ADN del espermatozoide aporta la mitad del material genético a la descendencia, en la actualidad los
parámetros obtenidos a través de un seminograma no dan una información completa sobre el potencial
fecundante del semen y la capacidad de dar lugar a un embrión sano y un embarazo evolutivo. Es por
ésto que ha aumentado el interés en desarrollar técnicas encaminadas a evaluar la fragmentación del
ADN espermático, ya que en cualquier etapa del proceso de la espermatogénesis se puede producir un
daño, siendo éste un fenómeno multifactorial y no del todo delimitado. Actualmente la infertilidad es un
problema global que va en aumento y se ha demostrado que la calidad del ADN del espermatozoide
puede afectar la fecundación; es por ello que la evaluación de la integridad del ADN, además del
estudio de los parámetros seminales, puede aportar información adicional acerca de la calidad del
espermatozoide, y ser de gran ayuda para identifcar las causas
de la infertilidad masculina y así orientar
de mejor manera a las parejas.
Palabras Clave:
ADN espermático, calidad del espermatozoide, fragmentación del ADN, infertilidad, semen.
Male infertility and spermatic DNA fragmentation: A current problem
A
BSTRACT
Spermatic DNA contributes one half of the genetic material to offspring. Currently, the parameters obtained
through a seminogram do not provide complete information on the potential fertilization of the semen
and the ability to produce a healthy embryo and an on-going pregnancy. This is the reason why the
interest in developing techniques to assess sperm DNA fragmentation has been increased, as damage
during spermatogenesis can occur at any stage of the process, this being a multifactorial phenomenon
and not entirely delimited yet. Nowadays the infertility is an increasing global problem, and it has been
shown that the quality of the DNA in the sperm can affect fertilization; this is why the evaluation of sperm
DNA integrity, in addition to the study of the sperm parameters may provide additional information on
the quality of the spermatozoa, resulting in great help to identify the causes of male infertility and thus
can be used to better guide couples with infertility issues.
Key Words:
spermatic DNA, sperm quality, DNA fragmentation, infertility, semen.
Quintero-Vásquez, G.A.
et al.
: Infertilidad masculina y fragmentación del ADN espermático
145
diciembre, 2015
a infertilidad es un problema global que va en aumento,
afecta tanto a hombres como mujeres y se presenta
cuando una pareja con vida sexual regular y sin
uso de métodos anticonceptivos intenta por un año
I
NTRODUCCIÓN
L
embargo, este análisis es subjetivo, ya que existe una variación
importante de la prueba por su falta de estandarización
15
.
Es evidente que el número, la concentración, la movilidad y la
normalidad morfológica espermática son factores importantes
que determinan el éxito de un embarazo, sin embargo, en muchos
casos no permiten detectar la presencia de alteraciones sutiles
en el espermatozoide que afectan la integridad del genoma
masculino
16
. Se estima que aproximadamente un 15% de los
varones con problemas de infertilidad, presentan parámetros
dentro de los rangos normales en el estudio del semen
17-19
, sin
embargo son casos que podrían deberse entre otras causas, a
defectos en la membrana del espermatozoide, a la fragmentación
del ADN espermático y a factores ambientales o genéticos,
parámetros que no son detectables en el seminograma y que
por lo tanto, se tiene que recurrir a técnicas especializadas
para su análisis
20
. El ADN del espermatozoide aporta la mitad
del material genético a la descendencia y se requiere que sea
sano para la fertilización, el desarrollo del embrión, el correcto
desarrollo fetal y posnatal, de lo contrario un ADN anormal
altera cualquiera de éstos procesos
21
.
ADN
ESPERMÁTICO
La espermatogénesis es el mecanismo encargado de la producción,
crecimiento, maduración y liberación del empaquetamiento
del ADN de las células germinales masculinas de espermatogonias
diploides a espermatozoides maduros haploides, este proceso
quedar embarazada sin éxito o por la imposibilidad de llevar un
embarazo a término
1,2
. Se estima que aproximadamente del 15
al 20% de todas las parejas experimentan infertilidad en algún
momento de su vida reproductiva y aproximadamente la mitad
de los casos son de origen masculino
3
.
Los factores que pueden afectar la capacidad reproductiva
del varón son: problemas en los espermatozoides, trastornos
hormonales, anomalías genéticas, enfermedades e infecciones
del sistema reproductor masculino y factores externos como
ciertos medicamentos, así como el tabaquismo, el estrés y el
consumo de alcohol y otras drogas
4-10
.
En cuanto a los factores relacionados con problemas en los
espermatozoides, el análisis del semen o también llamado
seminograma o espermatobioscopía directa, es la prueba clínica
más importante para diagnosticar la infertilidad masculina
11,12
.
La Organización Mundial de la Salud (OMS) estableció los
parámetros básicos que se deben tomar en cuenta para realizar
este estudio, el cual incluye tanto un análisis macroscópico que
comprende: la licuefacción, apariencia, viscosidad, volumen y
pH como un examen microscópico que consta de la movilidad,
morfología, vitalidad y concentración espermática
13,14
. Sin
Figura 1. La espermatogénesis se lleva a cabo en los b) túbulos seminíferos ubicados en los a) testículos. c) Células de
Sertoli 1) En la fase de proliferación, las espermatogonias se dividen mitóticamente y 2) originan espermatocitos primarios.
3) Durante la meiosis I, el espermatocito primario se divide originando dos espermatocitos secundarios, reduciendo el
número cromosómico de diploide a haploide. 4) Durante la meiosis II, el espermatocito secundario se divide originando dos
e s p e r m á t i d e s 5 ) y f n a l m e n t e l a s e s p e r m á t i d e s m e d i a n t e u n p ro ce s o d e d i F e re n ci a ci ó n ce l u l a r d a n l u g a r a l o s e s p e r m a t oz o i d e s .
TIP Rev.Esp.Cienc.Quím.Biol.
146
Vol. 18, No. 2
se lleva a cabo en los túbulos seminíferos localizados en los
testículos. Inicia en la pubertad y tiene una duración aproximada
de 62 a 75 días en la especie humana. Consta de tres fases
o etapas: la fase proliferativa, donde las espermatogonias,
experimentan una serie de divisiones mitóticas y se diferencian
en espermatocitos primarios; la fase meiótica, en la cual ocurre la
meiosis y la recombinación genética, produciendo la formación
de espermátides haploides y la fase llamada espermiogénesis,
implicada en el rearreglo de la estructura del citoesqueleto,
terminando con las células germinales especializadas llamadas
espermatozoides
22-24
(Figura 1).
Durante el proceso de la espermatogénesis las histonas
somáticas son hiperacetiladas y reemplazadas por las
proteínas de transición nuclear (TP1 y TP2) éstas a su vez son
reemplazadas por otras proteínas, conocidas como protaminas
(P1 y P2)
25-27
.
Las protaminas son las proteínas más abundantes
en el espermatozoide maduro y empaquetan el genoma paterno
dentro del núcleo espermático. Estas proteínas son ricas en
arginina y residuos de cisteína; la gran cantidad de arginina
provee una fuerte carga positiva facilitando su unión al ADN
y garantizando el reemplazo de las histonas y las proteínas
de transición nuclear. Los múltiples residuos de cisteína
son oxidados para formar puentes disulfuros (S-S) entre las
protaminas y estabilizar la cromatina durante los estadios fnales
de la maduración espermática
28,29
.
Tanto la P1 como la P2 son necesarias para la condensación
adecuada de la cromatina. La alta carga positiva de las protaminas
permite la neutralización de la carga negativa del ADN, lo que
genera mayor compactación en el núcleo espermático.
Esto hace
que el ADN del esperma esté seis veces más condensado que
el de los cromosomas mitóticos y así el material genético esté
protegido durante su travesía a lo largo de los aparatos genitales
masculino y femenino. Un defecto en la síntesis de protaminas y
en la formación de puentes disulfuro afecta el empaquetamiento
de la cromatina, lo que aumenta la vulnerabilidad de los
espermatozoides a la fragmentación del ADN
30-32
.
D
AÑO
AL
ADN
ESPERMÁTICO
En cualquier etapa del proceso de la espermatogénesis se
puede producir un daño en el ADN espermático, éste es un
fenómeno multifactorial y no del todo dilucidado que puede
afectar tanto al ADN mitocondrial como al nuclear. Se conocen
algunos factores que pueden producir daño irreversible en el
ADN del gameto masculino, éstos pueden ocurrir durante
la producción o el transporte de las células espermáticas e
incluyen: la generación de radicales libres de oxígeno o estrés
oxidativo (incluidos el radical hidroxil y óxido nítrico durante
el transporte espermático a través de los túbulos seminíferos
y el epidídimo), el empaquetamiento anormal de la cromatina
(errores en la sustitución de histonas por protaminas en el
proceso de espermiogénesis), defciencias en la recombinación,
Figura 2. Daño al ADN espermático. El daño al ADN en los espermatozoides puede ocurrir durante la producción o el transporte
de las células espermáticas e incluye: 1) apoptosis durante el proceso de espermatogénesis; 2) fragmentación postesticular
del ADN inducida principalmente por radicales de oxígeno (incluidos el radical hidroxil y óxido nítrico) durante el transporte
espermático a través de los túbulos seminíferos y el epidídimo 3) fragmentación en las cadenas de ADN producidas durante
la remodelación de la cromatina espermática y durante el proceso de espermiogénesis; 4) daño al ADN inducido por tóxicos
ambientales y factores externos.
Quintero-Vásquez, G.A.
et al.
: Infertilidad masculina y fragmentación del ADN espermático
147
diciembre, 2015
apoptosis en el proceso de espermatogénesis tras la salida del
espermatozoide a los túbulos y causas externas que pueden
provocar o potenciar los efectos anteriores dentro de los que
se consideran determinadas condiciones ambientales como la
contaminación, el tabaquismo, la temperatura testicular elevada
o patológicas como la criptorquidia, varicocele, procesos
infamatorios o inFección del tracto genital, cáncer, episodios
febriles y estrés, entre otras
33-39
(Figura 2). Estas alteraciones
en el material genético del espermatozoide pueden incluir
anomalías en la condensación de la cromatina y en la integridad
de la molécula del ADN cuando presenta rupturas tanto de doble
como de simple cadena y también anomalías cromosómicas,
demostradas por una correlación entre las alteraciones en la
organización del material genómico del ADN y su potencial de
fertilización; enfatizando el hecho de que la estabilidad del ADN
espermático es un criterio a tener en cuenta para considerar si
un espermatozoide podría ser fértil o no
40-42
.
En los últimos años se ha considerado como causa probable de
infertilidad el daño al ADN espermático y de ahí ha aumentado
el interés en desarrollar técnicas encaminadas a evaluar la
fragmentación. Existen diferentes estrategias para estudiar la
fragmentación del ADN espermático. Por un lado se encuentran
las metodologías encaminadas a detectar las rupturas, tanto
de cadena sencilla como de cadena doble que se registran de
forma natural o fortuita en la molécula del ADN, como es la
metodología del Túnel o Ensayo
in situ nick translation
(NT) que
incorpora moléculas marcadas con fuorocromos en los extremos
rotos del ADN. Por otro lado, tenemos las estrategias de estudio
de la fragmentación que se basan en medir la capacidad de la
cromatina y en particular del ADN para desnaturalizarse frente a
determinados tratamientos. En este grupo se encuentran: Ensayo
de la estructura de la cromatina espermática (SCSA), dispersión
de la cromatina espermática (SCD) y ensayo cometa
43-46
.
T
ÉCNICAS
UTILIZADAS
PARA
EVALUAR
EL
ADN
ESPERMÁTICO
Ensayo de Túnel
El ensayo de TÚNEL (
Terminal dUTP Nick-End Labeling),
permite visualizar la incorporación de nucleótidos marcados en
los extremos del ADN que quedan libres a causa de las rupturas
de éste, bien sean de cadena simple o doble. La reacción se
cataliza mediante la acción de una tranferasa terminal. Esta
enzima incorpora desoxiuridina, modi±cada con biotina o
digoxigenina, en el extremo 3'-OH de la cadena afectada. El
nucleótido incorporado está directamente marcado con un
fuorocromo. Esta técnica ha tenido muy buena aceptación dado
que es versátil, está comercialmente disponible y los resultados
pueden ser interpretados fácilmente. La señal es mayor cuanto
mayor
sea el grado de fragmentación del ADN.
Esta técnica
Fue desarrollada para identi±car una
población apoptótica de
espermatozoides en el eyaculado, sin embargo
la fragmentación
del ADN medida mediante el TÚNEL no está siempre
asociada
con un fenómeno apoptótico, ya que podría deberse a una
maduración espermática defectuosa por un empaquetamiento
incorrecto de la cromatina
47-49
.
E
NSAYO
IN
SITU
NICK
TRANSLATION
El análisis de
in situ
nick translation (ISNT) cuanti±ca
la
incorporación dUTP (desoxiuridín trifosfato) biotinilado en las
rupturas del ADN de cadena sencilla en una reacción catalizada
por la polimerasa I. El ensayo NT detecta a los espermatozoides
que contienen valores apreciables de daño endógeno en su ADN,
estos resultados indican la presencia de anomalías originadas
durante la remodelación de la cromatina del espermatozoide. El
estudio de la integridad nuclear espermática mediante el análisis
NT evidencia una buena correlación con la movilidad y la
morfología espermática, y en menor medida con la concentración
de espermatozoides en el semen
50,51
.
Ensayo cometa
El ensayo cometa o electroforesis en gel de células individuales
es un método sensible, rápido y relativamente de bajo costo,
para cuanti±car daño en el ADN de células individuales. En
esta técnica las células son colocadas en gel de agarosa en un
portaobjeto y sometidas a lisis mediante un agente reductor de
grupos sul±drilo de las protaminas que permite que el ADN
fragmentado pueda migrar en un proceso de electroforesis
durante un corto tiempo. Para visualizar el ADN que se separó
de la célula, éste es teñido con sustancias fuorescentes
como
DAPI (4,6 diamidino-2-phenylindole), Ioduro de Propidio o
SYBR-GREEN (Synergy Brand). Las células con mayor daño
del ADN muestran una migración aumentada desde el núcleo
hacia el ánodo, generando una imagen similar a la cola de un
cometa. La presencia de daño en el ADN se cuanti±ca midiendo
la longitud de la cola, que a su vez pueden utilizarse también otros
parámetros de medida, como el “momento de la cola”, que es
el producto de la longitud de la cola por su intensidad (fracción
total del ADN de la cola). La importancia de este ensayo radica
en la posibilidad de poder detectar fragmentación de simple o
doble cadena del ADN espermático en una sola célula
46,52,53
.
Ensayo de la estructura cromatínica del
espermatozoide (SCSA)
Es una técnica que desnaturaliza la molécula de ADN mediante
una solución ácida o mediante un tratamiento con calor y
una vez desnaturalizada
se tiñe con naranja de acridina. Este
fuorocromo se
intercala entre las dos cadenas de ADN y al ser
excitado
emite una longitud de onda de 530 nm y se visualiza
de color verde, mientras que al intercalarse en
el ADN de
cadena sencilla (ADN desnaturalizado)
emite una longitud de
onda de 640 nm de color rojo.
Las células se separan y leen por
citometría de fujo. El
ADN fragmentado es más susceptible a
ser desnaturalizado
y por tanto se visualiza en color rojo
54-57
.
Dispersión de la cromatina espermática (SCD)
Esta técnica consiste en producir una descondensación
diferencial de la cromatina en aquellos espermatozoides
que
TIP Rev.Esp.Cienc.Quím.Biol.
148
Vol. 18, No. 2
Tabla I. Ventajas e inconvenientes de las metodologías utilizadas para evaluar la fragmentación del ADN de los espermatozoides, relación de fragmentación
espermática de otros autores en distintas técnicas de reproducción y la relación con el seminograma.
Método
Ventajas
Desventajas
(% SDF)
Relación en el seminograma
TÚNEL
Cumple con parámetros
de control de calidad.
Equipos sofsticados y
costosos (Citometría de
Fujo y microscopía de
Fuorescencia)
Capacitación técnica
No se ha establecido punto de
corte entre fértiles e infértiles
Daris
et al.
67
(2010) ICSI (FR 65.6% con SDF
≤20%, 54.9% con SD± < 20%) n=20
Frydman
et al.
68
(2008) IVF (FR 69.9% con
35%, 71.7% con SD± ≥35%), CP (62.5% con
SD± <35%; 37.5% con SD± ≥35%), IR (42.4%
con SD±<35%; 24.5% con SD±≥35%), PL
(10% con SD±<35%; 36.8% con SD±≥35%),
n=117
Se ha demostrado una correlación
entre el porcentaje de espermatozoides
con ADN fragmentado, la motilidad,
la concentración y los parámetros
morfológicos relacionados con formas
anormales.
ISNT
Reacción de marcaje
directo
SCSA
Punto de corte establecido
(30% para diferenciar
entre pacientes fértiles e
infértiles)
Equipo sofsticado y costoso
(Citometría de Fujo).
Capacitación técnica
Kennedy
et al.
69
(2011) IV±/ICSI (NV (r=0.42,
P=0.01); (NE r=0.47, p=0.01), n=233; (PL
p<0.001)
Lin
et al.
70
(2008) IV± (±R 82 % con SD±<
9%; 84.87% con SD± = 9% - 27%; 84.74%
con SD± <27%); ER (55.2% con SD± 9%;
58.67% con SD± = 9% - 27%; 55.03% con
SD±>27%) n=137
El índice de fragmentación del ADN,
presenta una débil correlación con los
criterios clásicos de calidad espermática.
COMETA
Bajo costo
Equipo sofsticado y costoso
(Citometría de Fujo)
Capacitación técnica.
Requiere observador con
experiencia.
Simon
et al
.
71
(2011) IVF FR (r
2
= 0.243,
P=0.050 en semen; r
2
= 0.276, P=0.050 en
semen seleccionado); calidad del embrión (r
2
=
-0415, P=0.002 en semen; r
2
= -0.373, P=0.007
en semen seleccionado) n=75
Lewis
et al.
72
(2004) ICSI No hubo relación
signifcativa entre SD± y ±R, n=77
Se ha observado una correlación entre
el porcentaje de espermatozoides
con ADN fragmentado y los criterios
clásicos de calidad espermática.
SCD
Análisis simple de
resultados.
Bajo costo
Lento de ejecución.
Payne
et al.
73
(2005) D±I= 27%. El D±I se
correlacionó negativamente con la densidad
de espermatozoides (r = -0,23; p <0,03) y la
motilidad (r = -0,55; p <0,00) n=100
Se determinó un incremento en el daño
al ADN espermático en pacientes con
oligoastenoteratozoospermia.
TÚNEL: Terminal dUTP Nick-End Labeling. ISNT =
In situ
Nick Translation. SCSA:
Estructura cromatínica del espermatozoide
SCD:
Dispersión de la cromatina espermática
CP, embarazo clínico; ER, pérdida del embrión; FR, tasa de fertilización; ICSI, inyección intracitoplasmática de espermatozoides; IVF, fertilización
in vitro
; NV, nacidos vivos;
SDF, fragmentación de ADN espermático; DFI, índice de fragmentación del ADN.
Quintero-Vásquez, G.A.
et al.
: Infertilidad masculina y fragmentación del ADN espermático
149
diciembre, 2015
tienen su ADN fragmentado respecto
de aquellos que no lo tienen.
Este efecto se consigue mediante un tratamiento ácido seguido
de una desproteinización,
de forma que los espermatozoides
con
fragmentación no generan
un halo de dispersión de la
cromatina. Por el contrario,
los que no están fragmentados
dan lugar a grandes
halos de dispersión. Se valora el tamaño
de los halos de dispersión mediante microscopía de campo
claro o de fuorescencia. Es posible reconocer la presencia
de fragmentación del ADN de la siguiente forma: cabezas de
espermatozoides con halos grandes o medianos signiFcan que
no hay daño en el ADN espermático, mientras que aquellos con
halos pequeños o sin ellos sugieren un daño en el ADN
44,58-60
.
V
ALOR
PREDICTIVO
DE
LAS
PRUEBAS
PARA
EVALUAR
LA
FRAGMENTACIÓN
DEL
ADN
ESPERMÁTICO
El valor predictivo de las pruebas de fragmentación del ADN
espermático en una pareja con infertilidad depende de una
serie de factores, entre los que se incluyen: el tipo de daño al
ADN ya sea daño de cadena sencilla o doble, el porcentaje de
espermatozoides con daño en el ADN, la extensión del daño,
si existe daño combinado de nucleótidos y fragmentación, si el
daño afecta intrones o exones, el tipo de prueba de fragmentación
del ADN utilizado y la capacidad del ovocito de reparar el daño
al ADN espermático
61-63
(Tabla I).
Diversos estudios han demostrado que la expresión genética
del embrión y del ovocito están equipados con mecanismos
para hacer frente a algunas anomalías en el ADN paterno, sin
embargo, la capacidad del ovocito de iniciar la reparación
depende, en gran medida, de su calidad citoplásmica y genómica.
Por ejemplo, se sugiere que la fragmentación de doble cadena
es aquella “no reparable” por el ovocito, mientras que la simple
podría llegar a ser reparada por un ovocito sano y joven
64-66
.
I
NFERTILIDAD
Y
CALIDAD
EN
LOS
ESPERMATOZOIDES
Los parámetros obtenidos a través de un seminograma no
aportan una información completa sobre el potencial fecundante
del semen y la capacidad de dar lugar a un embri
ón sano y
un embarazo evolutivo
74
. Cuando un espermatozoide con un
daño severo en su ADN fecunda un ovocito el embrión puede
alterarse en su desarrollo o implantarse en el útero y provocar
un aborto espontáneo en un estadio más tardío. De igual manera,
cuando un espermatozoide con un mínimo de daño en su ADN
es utilizado, el desarrollo fetal puede verse afectado tardíamente
y puede dar lugar a un niño con anomalías
75, 76
.
Existe una población de hombres con problemas reproductivos
que muestran características de concentración, movilidad y
morfología normales; indicando que los parámetros seminales
no son del todo indicativos de la calidad espermática
77
. Por otro
lado parámetros seminales alterados están en estrecha asociación
con la presencia de daño en el ADN del espermatozoide y la
calidad del semen. ConFrmando que diversas alteraciones en las
características del espermatozoide se asocian con un aumento
en la proporción de espermatozoides con ADN fragmentado,
situación que ha merecido la atención en los últimos años.
Demostrando que un incremento de la fragmentación
está relacionado con una disminución de la concentración
espermática, la motilidad y la morfología y por consiguiente
con posibles problemas reproductivos
78-80
.
Las circunstancias cambiantes obligan al desarrollo de
procedimientos alternativos que permitan evaluar la calidad
espermática, como el estudio del daño del ADN espermático,
procedimiento que adquiere una mayor relevancia y que
muestra una signiFcativa correlación entre el daño y el índice
de fertilidad, con repercusiones en la tasa de fertilización, la
tasa de división del embrión, la tasa de implantación, el índice
de embarazos y el índice de natalidad
81-84
.
En conclusión, es importante el poder protocolizar de manera
sistemática el estudio cromosómico de espermatozoides en
los laboratorios clínicos, como complemento de otros estudios
y poder evidenciar un daño al ADN genómico, ya que estos
resultados pueden ser de gran ayuda al médico para identiFcar
las causas de la infertilidad masculina y orientar de mejor manera
a las parejas para lograr un embarazo a término
85-87
.
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