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Red de Revistas Científicas de América Latina y el Caribe, España y Portugal
817
Recibido: Octubre, 2006. Aprobado: Octubre, 2007.
Publicado como ARTÍCULO en Agrociencia 41: 817-826. 2007.
R
ESUMEN
La fitorremediación es una tecnología alternativa de bajo costo
para limpiar suelos contaminados con petróleo, al estimular
la actividad microbiana en la rizósfera para degradar con-
taminantes. En este trabajo se evaluó la bioestimulación con
fertilización inorgánica (solución nutritiva) u orgánica (ver-
micomposta de café) de
Phaseolus coccineus
(Pcocc) para de-
terminar su potencial de limpiar un suelo contaminado con
combustóleo (50 000 mg kg
1
). Se evaluó el crecimiento de la
planta, poblaciones microbianas, y la desaparición cualitativa
de hidrocarburos del combustóleo mediante GC-MS. El com-
bustóleo redujo significativamente (p
0.05) el crecimiento de
Pcocc. El efecto negativo de este contaminante fue compensado
con la fertilización, particularmente inorgánica, al estimular
el crecimiento y la acumulación de materia seca de las plan-
tas. La población microbiana de la rizósfera contaminada fue
parcialmente estimulada por la presencia de la planta y por
la aplicación de los fertilizantes. La fertilización redujo los
hidrocarburos del combustóleo en la rizósfera. Este estudio es
uno de los primeros reportes de la fitorremediación de hidro-
carburos en suelo usando Pcocc.
Palabras clave
: Frijol ayocote, hidrocarburos, rizósfera, solución
nutritiva, vermicomposta.
I
NTRODUCCIÓN
E
n México, el derrame accidental de hidrocarbu-
ros derivados del petróleo conduce a una conta-
minación constante de tierras de cultivo. En el
Estado de Veracruz en el 2002 hubo 41 emergencias
ambientales asociadas con el derrame de sustancias,
incluyendo hidrocarburos, elementos alcalinotérreos,
ácidos, alcoholes y otros (PROFEPA, 2003). La ma-
yoría de los derrames accidentales ocurren durante la
FITORREMEDIACIÓN DE UN SUELO CONTAMINADO CON COMBUSTÓLEO
UTILIZANDO
Phaseolus coccineus
Y FERTILIZACIÓN ORGÁNICA E INORGÁNICA
PHYTOREMEDIATION OF A FUEL OIL-POLLUTED SOIL WITH
Phaseolus coccineus
USING ORGANIC OR INORGANIC FERTILIZATION
Ronald
Ferrera-Cerrato
1
, Alejandro
Alarcón
1
, María R.
Mendoza-López
2
, Wendy
Sangabriel
3
,
Dora
Trejo-Aguilar
3
, J. Samuel
Cruz-Sánchez
2
, Carlos
López-Ortiz
1
y Julián
Delgadillo-Martínez
1
1
Area de Microbiología. Campus Montecillo. Colegio de Postgraduados. 56230. Carretera Méxi-
co-Texcoco km 36.6. Montecillo, Estado de México. (alexala@colpos.mx).
2
Unidad de Servicios
de Apoyo en Resolución Analítica (SARA). Universidad Veracruzana. 91190. Dr. Luis Castelazo
Ayala s/n. Colonia Industrial Ánimas. Xalapa, Veracruz.
3
Facultad de Agronomía. Universidad
Veracruzana s/n. Lomas del Estadio. C.P. 91090. Xalapa, Veracruz.
A
BSTRACT
Phytoremediation is an alternative, low-cost technology
to clean up petroleum contaminated soils by stimulating
microbial activity in the rhizosphere to degrade pollutants.
This study evaluated biostimulation by fertilizing
Phaseolus
coccineus
(Pcocc) with inorganic (nutrient solution) or organic
(vermicompost made of coffee residues) fertilizer to determine
its potential during phytoremediation of soil contaminated
with fuel oil (50 000 mg kg
1
). Plant growth, microbial
populations, and qualitative disappearance of fuel oil-derived
hydrocarbons were evaluated with GC-MS. Fuel oil reduced
growth of Pcocc significantly (p
0.05). The negative effect of
this pollutant was compensated by fertilization, particularly
with inorganic fertilizer, which stimulated plant growth and
accumulation of dry matter of the plants. The microbial
population in the contaminated rhizosphere was partially
stimulated by the presence of the plant and by application of
the fertilizers. Fertilization reduced fuel oil hydrocarbons in
the rhizosphere. This study is one of the first reports of soil
phytoremediation with Pcocc.
Key words
: Ayocote bean, hydrocarbons, rhizophere, nutrient
solution, vermicompost.
I
NTRODUCTION
I
n México, accidental spills of fuel oil-derived
hydrocarbons lead to constant pollution of
croplands. In 2002 in the State of Veracruz there
were 41 environmental emergencies associated with
spills of substances, including hydrocarbons, alkaline
earth metals, acids, alcohols and others (PROFEPA,
2003). Most of the accidental spills occur when fuels
are transported overland or through pipelines, such as
the 2003 accident in Frijol Colorado, Veracruz. At
this site, soil samples were taken to experiment with
phytoremediation under controlled conditions. Fuel oil
(No. 6) is a complex, variable mixture of alkanes,
818
AGROCIENCIA
, 16 de noviembre - 31 de diciembre, 2007
VOLUMEN 41, NÚMERO 8
conducción y el transporte de combustibles, como el
sucedido en 2003 en Frijol Colorado, Veracruz, donde
se tomaron muestras de suelo para hacer ensayos de
fitorremediación en condiciones controladas. El com-
bustóleo (fuel oil No. 6) es una mezcla compleja y va-
riable de alcanos, alquenos, cicloalcanos, hidrocarbu-
ros aromáticos y porcentajes bajos de compuestos que
contienen azufre y nitrógeno (Philip
et al
., 1984).
Para limpiar suelos contaminados hay tecnologías
costosas como la excavación, la incineración, el la-
vado y la bioventilación. La fitorremediación es una
alternativa donde se usa plantas y la asociación micro-
organismo-raíz para remover o contener contaminan-
tes en el suelo (Cunningham
et al
., 1996). En suelos
moderadamente contaminados, la fitorremediación tie-
ne bajo costo en comparación con técnicas físicas y
químicas (Siciliano y Germida, 1998).
Se ha evaluado el efecto de las plantas y la asocia-
ción rizosférica en la degradación de hidrocarburos
del petróleo (Ferro
et al
., 1994; Schwab y Banks,
1994; Reilley
et al
., 1996). Las leguminosas nor-
malmente tienen un sistema radical poco ramificado
pero profundo que les permite actuar sobre contami-
nantes en las capas más profundas del suelo (Kirk
et
al
., 2002). Su simbiosis con fijadores de nitrógeno
(N) del género
Rhizobium
las libera de la necesidad
de absorber N, por lo que son más competitivas en
suelos con baja fertilidad. Esta característica es im-
portante, ya que la contaminación con hidrocarburos
incrementa la relación C/N, afectando la disponibili-
dad del N.
Comparadas con gramíneas, las leguminosas pue-
den incrementar hasta diez veces la población de bac-
terias en su rizósfera (Yateem
et al
., 1999). Sin em-
bargo, para la fitorremediación de hidrocarburos es
importante seleccionar especies de leguminosas con
adaptación a las condiciones de sitio y a la concentra-
ción del contaminante. Sangabriel
et al
. (2006) repor-
taron tolerancia de
Phaseolus coccineus
al combustó-
leo. Por lo anterior, el objetivo del presente trabajo
fue evaluar el potencial de
P. coccineus
en la fitorre-
mediación de un suelo contaminado con combustóleo
con dos tratamientos de fertilización.
M
ATERIALES
Y
M
ÉTODOS
Toma de muestras de suelo
Se usó suelo contaminado (SC) con combustóleo (50 000 mg
kg
1
) de la localidad de Frijol Colorado, Veracruz, 19° 35’ 16”
N y 97° 21’ 06” O, y 2410 m de altitud. El área afectada por
el derrame fue aproximadamente 100 m
2
. El suelo presentó pH
6.6, 0.1% N, 25
μ
g g
1
P Olsen, 2.1% materia orgánica (MO),
y textura franca. Se tomaron siete muestras de el suelo de la
alkenes, cyclo-alkanes, aromatic hydrocarbons, and
low percentages of compounds containing sulfur and
nitrogen (Philip
et al
., 1984).
For cleaning polluted soils there is costly
technology, such as excavation, incineration,
lixiviation, and bio-ventilation. Phytoremediation is
an alternative in which plants and the microorganism-
root associations are used to remove or contain soil
pollution (Cunningham
et al
., 1996). In moderately
contaminated soils, phytoremediation is inexpensive
compared with physical and chemical techniques
(Siciliano and Germida, 1998).
The effect of plants and their rhizospheric
associations on petroleum hydrocarbon degradation
has been evaluated (Ferro
et al
., 1994; Schwab
and Banks, 1994; Reilley
et al
., 1996). Legumes
normally have a scantly ramified, but deep, radical
system that allows them to act on pollutants in the
deepest layers of soil (Kirk
et al
., 2002). Symbiosis
with nitrogen-fixing bacteria of the genus
Rhizobium
frees them from the necessity of absorbing N,
making them more competitive in unfertile soils.
This characteristic is important since pollution by
hydrocarbons increases the C/N ratio and affects
availability of N.
Compared with grasses, legumes can increase
the population of bacteria in their rhizosphere by
up to 10 times (Yateem
et al
., 1999). However, for
phytoremediation of hydrocarbons, it is important to
select leguminous species that are able to adapt to
the conditions of the site and to the concentration of
the pollutant. Sangabriel
et al
. (2006) reported that
Phaseolus coccineus
tolerates the presence of fuel oil.
Thus, the objective of this study was to evaluate the
potential of
P. coccineus
in phytoremediation of a
soil contaminated by fuel oil under two treatments of
fertilization.
M
ATERIALS
AND
M
ETHODS
Soil sampling
A soil polluted (SC) by fuel oil (50 000 mg kg
1
) was
collected from Frijol Colorado, Veracruz, 19° 35’ 16” N and
97° 21’ 06 W, altitude 2410 m. The area affected by the spill
was approximately 100 m
2
. Characteristics of the soil were
pH 6.6, 0.1% N, 25
μ
g g
1
P Olsen, 2.1% organic matter
(OM), and loam texture. Seven soil samples were taken from
the polluted zone (20-30 cm deep); these were homogenized to
obtain a compound sample of 35 kg. Near the sampled area,
non-polluted soil (SNC) was sampled. This soil, cultivated under
corn, had similar characteristics of texture and pH (Sangabriel
et
al
., 2006). Samples were taken in a zig-zag pattern (Paetz and
Wilke, 2005).
FITORREMEDIACIÓN DE UN SUELO CONTAMINADO CON COMBUSTÓLEO UTILIZANDO
Phaseoulus coccineus
819
FERRERA-CERRATO
et al
.
zona contaminada (20-30 cm profundidad) que se homogeneizaron
para obtener una muestra compuesta de 35 kg. Cerca de la área
muestreada se tomaron muestras de suelo no contaminado (SNC),
cultivado con maíz, con similares características en textura y pH
(Sangabriel
et al
., 2006). El método de muestreo fue en zig-zag
(Paetz y Wilke, 2005).
Establecimiento del experimento
Se estableció en invernadero el experimento de fitorremedia-
ción; la temperatura máxima/mínima y humedad relativa promedio
fueron 23.5/11.9 °C y 63/71%. Las unidades experimentales fueron
recipientes de cristal ámbar rellenados con suelo (250 g por uni-
dad). Se usó SC con combustóleo y SNC que se prepararon así: la
muestra compuesta se dividió en tres partes, en una parte se aplicó
5% MO (FOrg; vermicomposta de café); en otra parte se aplicó
solución nutritiva completa de Long Ashton (Hewitt, 1966) que fue
el tratamiento con fertilización inorgánica (FInor); el suelo restante
se mantuvo sin fertilización (NoF). Se usó
P. coccineus
L. (Pcocc)
como la especie a evaluar. En cada unidad experimental se sembra-
ron dos semillas de Pcocc. Se hicieron riegos controlados con agua
destilada para mantener el suelo a capacidad de campo.
Hubo dos tratamientos más (SC y SNC sin planta) para evaluar
la posible atenuación natural del combustóleo. Pero no se fertilizó,
por lo que los datos de población microbiana, se analizaron por
separado del experimento con Pcocc.
Variables
1) En las plantas se determinó la altura semanalmente empezan-
do 7 d después de la emergencia. A los 90 d se midió el volumen
radical y la materia seca (MS) producida.
2) La población de bacterias y hongos rizosféricos totales y
degradadores de hidrocarburos se determinó a los 90 d usando el
método de dilución y cuenta viable de unidades formadoras de colo-
nias (UFC) crecidas en su medio de cultivo en caja de Petri (Ingra-
ham e Ingraham, 1998). Para bacterias totales se usó agar nutritivo
(Baker®) y para hongos totales papa-dextrosa agar (PDA, Baker®).
Para las poblaciones de bacterias y hongos tolerantes a petróleo se
usó medio mineral (por L: 0.8 g K
2
HPO
4
; 0.2 g KH
2
PO
4
; 0.2 g
MgSO
4
·7H
2
O; 0.06 g CaCl
2
; 0.1 g NaCl
2
; 0.025 Na
2
MoO
4
·2H
2
O;
0.28 NaFe-EDTA; 5
μ
g biotina y 10
μ
g ácido
p
-amino benzoico;
pH 7) con petróleo crudo como fuente de carbono. El petróleo
se aplicó en papel filtro embebido y adherido en el interior de la
contratapa de la caja de Petri. Las cajas se incubaron 24-72 h a
25 °C, dependiendo del crecimiento microbiano. Los conteos se
transformaron a unidades logarítmicas para su análisis estadístico y
presentación de resultados.
3) La degradación de combustóleo se determinó a los 90 d,
mediante extracción y cuantificación de hidrocarburos de dos mues-
tras compuestas de suelo de cada tratamiento. La extracción se hizo
con diclorometano mediante agitación mecánica (Schwab
et al
.,
1999) usando el método modificado EPA 8270B SW-846 (USEPA
1986; Louchouarn
et al
., 2000). Los extractos se concentraron por
Experimental setup
The phytoremediation experiment was set up in a greenhouse
with maximum/minimum temperatures of 23.5/111.9 °C and relative
humidity of 63/71%. Experimental units were amber-colored glass
recipients filled with soil (250 g per unit). Soil polluted (SC) by
fuel oil and non-polluted soil (SNC) were prepared in the following
manner. The compound soil sample was divided into three parts: 5%
organic fertilizer (FOrg: vermicompost made from coffee residues)
was applied in one of the parts; in another part complete Long
Ashton (Hewitt, 1966) nutritive solution (inorganic fertilization
treatment; FInor) was applied; the remaining third was kept without
fertilization (NoF).
Phaseolus coccineus
L. (Pcocc) was used as the
species to be assessed. In each experimental unit, two Pcocc seeds
were planted and irrigated twice with distilled water; irrigation was
controlled to maintain soil moisture at field capacity.
There were two additional treatments (SC and SNC without
plants) to evaluate the possible natural degradation of the fuel oil.
These treatments were not fertilized, and so the data on microbial
population were analyzed separately.
Variables
1) Plant height was measured weekly as of 7 d after emergence. On
day 90, root volume and dry matter (MS) produced were measured.
2) Total populations of rhizospheric bacteria and fungi, and
hydrocarbon degraders were determined on day 90 using the method
of dilution and viable count of colony-forming units (UFC) grown
in culture medium in a Petri dish (Ingraham and Ingraham, 1998).
For total bacteria, nutritive agar (Baker™) was used, and for total
fungi, potato-dextrose agar (PDA, Baker™) was used. For bacterial
and fungal populations tolerant to fuel oil, a mineral medium was
used (per L: 0.8 g K
2
HPO
4
, 0.2 g KH
2
PO
4
, 0.2 g MgSO
4
·7H
2
O,
0.06 g CaCl
2
, 0.1 g NaCl
2
, 0.025 g Na
2
MoO
4
2H
2
O, 0.28 NaFe-
EDTA, 5
μ
g biotin, and 10
μ
g
p
-amino benzoic acid; pH 7) with
crude oil as the source of carbon. Filter paper was saturated with
crude oil and adhered to the inner part of the Petri dish cover.
The Petri dishes were incubated 24-72 h at 25 °C, depending on
microbial growth. Counts were transformed to logarithmic units for
statistical analysis and presentation of results.
3) Fuel oil degradation was determined at 90 d by extraction and
hydrocarbons of two compound samples of soil from each treatment
were quantified. Extraction was done by mechanical shaking with
dichloromethane (Schwab
et al
., 1999) using the modified EPA
8270B SW-846 method (USEPA 1986; Louchouarn
et al
., 2000).
The extracts were concentrated by evaporating the solvent; a 1 mL
final aliquot was collected for qualitative analysis with GC-MS
in a gas chromatograph (Hewlett-Packard GCD PLUS G1800-B)
and HP-5 capillary column (5%-phenyl)-methylpolysiloxane (30
m; 0.25 mm i.d.; 0.25
μ
m film thickness). Each component was
identified on the basis of its retention time and by comparing its
mass spectrum (70 eV) in the HP-Chemstation-NIST MS, version
A.00.00-1995 library. Qualitative analysis of the fuel oil compounds
is presented in the chromatograms.
820
AGROCIENCIA
, 16 de noviembre - 31 de diciembre, 2007
VOLUMEN 41, NÚMERO 8
evaporación del solvente, recolectando una alícuota final de 1 mL
para su análisis cualitativo con GC-MS en un cromatógrafo de ga-
ses Hewlett-Packard GCD PLUS G1800-B y una columna capilar
HP-5 (5%-fenil)-metilpolisiloxano (30 m; 0.25 mm i.d.; 0.25
μ
m
espesor de película). Cada componente se identificó con base en su
tiempo de retención y por la búsqueda y comparación de su espectro
de masas (70 eV) en la biblioteca del HP-Chemstation-NIST MS,
versión A.00.00-1995. El análisis cualitativo de los compuestos del
combustóleo se presenta en los cromatogramas.
Análisis estadístico
El diseño experimental fue completamente al azar con un arre-
glo factorial 2
×
3, y seis tratamientos con 8 repeticiones cada uno.
Los factores fueron condición del suelo (SC y SNC) y fertilización
(NoF, FInorg, y FOrg). Se hizo un análisis de varianza de los datos
y se usó la prueba de comparación de medias de Tukey (p
0.05),
con el programa SAS (SAS Institute, 2002).
R
ESULTADOS
Y
D
ISCUSIÓN
La presencia del combustóleo en el suelo redu-
jo significativamente el crecimiento y desarrollo de
Pcocc, mientras que la fertilización (tratamiento FI-
nor y Forg) estimuló significativamente (p
0.001) la
altura de las plantas desde los 70 d, con respecto a
plantas testigo (NoF) en SC (Figura 1). Estos efectos
se mantuvieron hasta los 90 d, cuando la FInor en
SC produjo alturas semejantes a la de plantas en SNC
(Cuadro 1).
La fertilización en SC, particularmente con FInor,
tuvo efectos significativos (p
0.05) en todas las va-
riables de crecimiento, excepto para el peso seco de la
parte aérea (Cuadro 1). Las plantas en SC presentaron
menor altura y MS comparado con plantas en SNC.
La interacción condición del suelo
×
fertilización tuvo
efectos significativos (p
0.05) en todas las variables
de crecimiento (Cuadro 1). Las plantas expuestas a SC
tuvieron menor peso seco total, el cual fue estimulado
con FInor y comparable al de plantas en SNC (Figura
2).
El combustóleo redujo 56% el peso seco total de
Pcocc a los 90 d, lo cual corrobora el efecto negativo
de los hidrocarburos del petróleo en el crecimiento
de las plantas reportado por Baker (1970), Adam y
Duncan (2003) y Quiñones-Aguilar
et al
. (2003).
Al aplicar FInor y FOrg, la MS de las plantas
aumentó 150% y 90%, con respecto al testigo en SC.
Así se muestra el efecto benéfico de la fertilización en
el crecimiento de plantas establecidas en suelos conta-
minados, como se reportó para gramíneas (Hutchinson
et al
., 2001; Anderson
et al
., 2002). Sin embargo, po-
cos estudios han evaluado leguminosas con importan-
cia agrícola en fitorremediación (Wiltse
et al
., 1998;
Statistical analysis
The complete random experimental design had a factorial
arrangement of 2
×
3 and six treatments with 8 replications each.
The factors were soil condition (SC and SNC) and fertilization
(NoF, FInorg and FOrg). An analysis of variance and the Tukey
test of comparison of means (p
0.05) were performed on the data,
using the SAS software (SAS Institute, 2002).
R
ESULTS
AND
D
ISCUSSION
The presence of fuel oil significantly reduced
growth and development of Pcocc, while fertilization
(treatments FInor and FOrg) significantly stimulated
(p
0.001) plant height from 70 d, compared with
control plants (NoF) in SC (Figure 1). These effects
persisted up to 90 d when FInor in SC produced
heights similar to plants in SNC (Table 1).
Fertilization in SC, particularly with FInor, had
significant effects (p
0.05) on all of the growth
variables, except for dry weight of the aerial part (Table
1). Plants in SC had lower height and DM as compared
to SNC plants. The soil condition
×
fertilization
interaction had significant effects (p
0.05) in all
growth variables Table 1. Plants exposed to SC had
lower total dry weight, which was stimulated by FInor
and comparable to SNC plants (Figure 2).
Fuel oil reduced total dry weight of Pcocc by 56%
at 90 d, corroborating the negative effect of petroleum
hydrocarbons on plant growth reported by Baker
Figura 1. Valores promedio de la altura de
Phaseolus coccineus
L. sin fertilización (NoF), fertilización inorgánica (FI-
nor) o fertilización orgánica (FOrg) en suelo no conta-
minado (SNC, símbolos cerrados) o suelo contamina-
do con combustóleo (SC, símbolos abiertos). n=8.
Figure 1. Average values for height of
Phaseolus coccineus
L.
without fertilization (NoF), inorganic fertilization
(FInor) or organic fertilization (FOrg) in non-polluted
soil (SNC, blacked in symbols) or soil polluted by fuel
oil (SC, outlined symbols). n=8.
FITORREMEDIACIÓN DE UN SUELO CONTAMINADO CON COMBUSTÓLEO UTILIZANDO
Phaseoulus coccineus
821
FERRERA-CERRATO
et al
.
Cuadro 1. Crecimiento de
Phaseolus coccineus
con fertilización (F) inorgánica (FInor) u orgánica (FOrg), en suelo no-contaminado
(SNC) o contaminado con combustóleo (SC), después de 90 d.
Table 1.
Phaseolus coccineus
growth with inorganic (FInor) or organic (FOrg) fertilization (F) in non-polluted soil (SNC) or contaminated
by fuel oil (SC) after 90 d.
Condición
Altura
Volumen
Peso seco (g)
Raíz/Parte
del suelo
F
radical
aérea
(CS)
(cm)
(cm
3
)
Parte aérea
Raíz
(g g
1
)
SNC
NoF
103.4 ab
2.3 b
1.7 a
0.6 ab
0.4 ab
FInor
112.4 a
2.2 b
1.7 a
0.7 ab
0.4 ab
FOrg
82.4 c
2.6 a
1.6 a
0.3 bc
0.2 b
SC
NoF
87.6 bc
0.9 c
0.8 b
0.2 c
0.3 ab
FInor
106.6 a
2.1 b
1.7 a
0.8 a
0.5 a
FOrg
98.1 abc
2.3 b
1.4 ab
0.5 bc
0.3 ab
CS
NS
0.001
0.05
NS
NS
F
0.001
0.001
NS
0.001
0.05
CS
×
F
0.001
0.001
0.01
0.001
0.05
abc = Medias en una columna con diferente letra son estadísticamente diferentes (p
0.05); NS = no significativo; n = 8.
Figura 2. Efecto de la fertilización inorgánica (FInor) y orgáni-
ca (FOrg) en el peso seco total de
Phaseolus coccineus
en suelo no contaminado o contaminado con combus-
tóleo, después de 90 d. Condición del suelo (p
0.05);
fertilización (p
0.01); interacción de ambos factores
(p
0.01). Barras
±
error estándar; n
=
8.
Figure 2. Effect of inorganic (FInor) and organic (FOrg)
fertilization in total dry weight of
Phaseolus coccineus
in non-polluted soil or soil polluted with fuel oil after
90 d. Soil condition (p
0.05); fertilization (p
0.01);
interaction of both factors (p
0.01). Bars
±
standard
error.
Robson
et al
., 2003; Merkl
et al
., 2005). El presente
estudio es uno de los primeros reportes sobre la adap-
tación de Pcocc en SC y respuesta positiva a la FOrg
o FInor.
Con respecto al análisis microbiológico de la ri-
zósfera, la condición del suelo, fertilización y la
interacción de ambos factores no tuvieron efectos
significativos en la población de bacterias y hon-
gos filamentosos totales (Cuadro 2). Para las bacte-
rias de vida libre-fijadoras de N atmosférico (BFN),
la condición de suelo y la interacción condición de
suelo
×
fertilización tuvieron efectos significativos
(p
0.05). Para bacterias tolerantes a hidrocarburos,
el factor fertilización (p
0.01) y la interacción condi-
ción del suelo
×
fertilización (p
0.05) fueron signifi-
cativos. La población de hongos tolerantes fue afecta-
da significativamente por la interacción condición de
suelo
×
fertilización (p
0.05).
Al comparar las poblaciones microbianas de la ri-
zósfera con las del suelo sin planta, sólo la población
de hongos tolerantes fue mayor en presencia de Pcocc
(Cuadros 2 y 3). La población de BFN fue menor en
presencia de Pcocc comparado con el suelo sin planta
(Cuadros 2 y 3). No hubo diferencias significativas en
las poblaciones microbianas entre el SNC y el SC sin
planta (Cuadro 3).
Típicamente, los hidrocarburos estimulan la pobla-
ción microbiana en el suelo (Atlas, 1995; Van Hamme
et al
., 2003), y ésta aumenta significativamente en la
rizósfera (Kim
et al
., 2005). Lo anterior es contrario
a lo observado en el presente estudio para bacterias y
hongos totales, cuya población no presentó diferencias
significativas entre tratamientos, excepto la población
de BFN que fue mayor en la rizósfera de SC con
FOrg.
(1970), Adam and Duncan (2003) and Quiñones-
Aguilar
et al
. (2003).
When FInor and FOrg was applied, plant dry
weight (MS) increased by 150% and 90%, compared
with the control in SC. Thus, the effect of fertilization
on growth of plants established in polluted soils was
beneficial as reported for grasses (Hutchinson
et
al
., 2001; Anderson
et al
., 2002). However, few
studies have evaluated important crop legumes in
822
AGROCIENCIA
, 16 de noviembre - 31 de diciembre, 2007
VOLUMEN 41, NÚMERO 8
Cuadro 3. Efecto de combustóleo en la población microbiana (unidades logarítmicas formadoras de colonias, Log
10
UFC) en suelo sin
presencia de planta, después de 90 d.
Table 3. Effect of fuel oil on microbial population (colony-forming logarithmic units, Log
10
UFC) in soil without plants, after 90 d.
Bacterias
Hongos filamentosos
Condición
Log
10
UFC
Log
10
UFC
del suelo
sin planta
Totales
BFN
Tolerantes
Totales
Tolerantes
a hidrocarburos
a hidrocarburos
SNC
7.2
7.1
7.2
4.3
3.0
SC
7.2
7.1
7.2
4.3
3.0
Tratamiento
NS
NS
NS
NS
NS
Bacterias de vida libre fijadoras de nitrógeno atmosférico.
NS
=
no significativo. n
=
3.
Cuadro 2. Efecto de combustóleo y fertilización (F) inorgánica (FInor) y orgánica (FOrg), en la población microbiana (unidades loga-
rítmicas formadoras de colonias, Log
10
UFC) de la rizósfera de
Phaseolus coccineus
, después de 90 d.
Table 2. Effect of fuel oil and fertilization (F), inorganic (FInor) and organic (FOrg), on the microbial population (logarithmic colony
forming units, Log
10
UFC) of the
Phaseolus coccineus
rhizosphere, after 90 d.
Bacterias
Hongos filamentosos
Condición
Log
10
UFC
Log
10
UFC
del suelo
F
(CS)
Totales
BFN
Tolerantes
Totales
Tolerantes
a hidrocarburos
a hidrocarburos
SNC
NoF
7.2
Nd
7.0 b
4.2
4.1
FInor
7.4
6.6 ab
7.4 a
4.3
3.9
FOrg
7.4
6.5 b
7.3 ab
4.2
3.7
SC
NoF
7.4
Nd
7.2 ab
4.3
4.2
FInor
7.3
6.7 ab
7.2 ab
4.3
3.6
FOrg
7.3
7.3 a
7.4 a
4.2
4.2
CS
NS
0.05
NS
NS
NS
F
NS
NS
0.01
NS
NS
CS
×
F
NS
0.05
0.05
NS
0.05
Bacterias de vida libre fijadoras de nitrógeno atmosférico.
NoF = no fertilizado.
ab = Medias en una columna con letra son estadísticamente diferentes (p
0.05); Nd = no determinado; NS = no significativo. n = 3.
Además, la población de microorganismos rizos-
féricos fue similar a la observada en SC sin planta.
Este efecto puede estar relacionado con la estimula-
ción de la población microbiana cuando los hidro-
carburos son recién derramados en el suelo (Atlas,
1995), misma que se atenúa al aumentar el tiempo
de exposición al contaminante. Dicha reducción en
la estimulación microbiana puede relacionarse con el
aumento de la relación C:N, causando que el N sea
limitante para plantas y microorganismos (Adam y
Duncan, 2003).
La proliferación de bacterias que fijan N atmosfé-
rico puede ser importante en la dinámica del N en el
suelo durante la fitorremediación (Adam y Duncan,
2003). En el presente estudio la población de BFN
fue estimulada principalmente por la rizósfera. Pero
ni en SC ni en SNC se detectaron nódulos radicales de
Rhizobium
, indicando que las rizobias compatibles a
Pcocc están limitadas en el suelo muestreado.
phytoremediation (Wiltse
et al
., 2998; Robson
et al
.,
2003; Merkl
et al
., 2005). Our study is one of the first
reports on adaptation of Pcocc in SC and the positive
response to FOrg or FInor.
With respect to the microbiological analysis
of the rhizosphere, soil condition, fertilization,
and the interaction between the two factors had no
significant effects on the total populations of bacteria
and filamentous fungi (Table 2). For free-living
nitrogen-fixing bacteria (BFN), the soil condition
and the interaction soil condition
×
fertilization had
significant effects (p
0.05). For hydrocarbon-tolerant
bacteria, fertilization (p
0.01) and the interaction
soil condition
×
fertilization (p
0.05) had significant
effects. The population of petroleum-tolerant fungi
were significantly affected only for the interaction
between soil condition
×
fertilization (p
0.05).
When microbial populations in the rhizosphere
were compared with those in soil without plants,
FITORREMEDIACIÓN DE UN SUELO CONTAMINADO CON COMBUSTÓLEO UTILIZANDO
Phaseoulus coccineus
823
FERRERA-CERRATO
et al
.
Figura 3. Cromatogramas que muestran la presencia/desaparición de compuestos del combustóleo, después de 90 d.
Figure 3. Chromatograms that show the presence/disappearance of fuel oil compounds, after 90 d.
La degradación del combustóleo en la rizósfera fue
estimulada al aplicar FOrg o FInor (Figura 3C-D). El
beneficio de la fertilización en SC se relaciona con la
estimulación del crecimiento de plantas y microorga-
nismos rizosféricos, contribuyendo en la degradación
del contaminante (Anderson
et al
., 1993; Ferrera-Ce-
rrato y Alarcón, 2004; Pilon-Smits, 2005). La sola
presencia de Pcocc no influyó en la degradación del
combustóleo (Figura 3A-B) en comparación con los
tratamientos fertilizados (Figura 3C-D). Esto denota
la importancia de aplicar fertilizantes en plantas como
Pocc, cuya capacidad de tolerar la contaminación por
hidrocarburos se había evaluado (Sangabriel
et al
.,
2006), para facilitar la degradación de los compuestos
contaminantes en su rizósfera, como se mostró en este
estudio.
El combustóleo está constituido por una mezcla
compleja de hidrocarburos: parafinas (n-alcanos, al-
canos ramificados, cicloalcanos), compuestos alquil
monoaromáticos (tolueno, etilbenceno), poliaromáti-
cos (PAH; fenantreno, pireno, naftaleno, etcétera); y
compuestos con N y azufre (Yender
et al
., 2002).
Los PAH son muy insolubles, poco degradables y por
tanto muy persistentes en el ambiente, y presentan
gran afinidad por los tejidos grasos lo que favorece su
bioacumulación y permanencia por muchos años (Neff
et al
., 2000).
only the tolerant fungal populations were greater in
the presence of Pcocc (Tables 2 and 3). The BFN
population was lower in the presence of Pcocc
compared with that in soil without plants (Tables 2
and 3). There were no significant differences between
the microbial populations in SNC and SC without
plants (Table 3).
Typically, hydrocarbons stimulate microbial
populations in the soil (Atlas, 1995; Van Hamme
et al
., 2003), and these increase significantly in the
rhizosphere (Kim
et al
., 2005). This contrasts with the
results of our study for total bacteria and fungi, whose
populations did not exhibit significant differences
among treatments, except for the BFN population,
which was greater in the rhizosphere of SC with
FOrg.
Also, the population of microorganisms in the
rhizosphere was similar to that observed in SC without
plants. This effect could be related to stimulation of the
microbial population when a hydrocarbon spill is recent
in the soil (Atlas, 1995); however, this population tends
to decrease with time of exposure to the pollutant. This
reduction in microbial stimulation can be related to the
increase in the C:N ratio, limiting N for plants and
microorganisms (Adam and Duncan, 2003).
Proliferation of N-fixing bacteria can be important
in the dynamics of soil N during phytoremediation
824
AGROCIENCIA
, 16 de noviembre - 31 de diciembre, 2007
VOLUMEN 41, NÚMERO 8
Mediante análisis de GC-MS se ha identificado
la presencia de compuestos orgánicos derivados del
combustóleo en SC, destacando los hidrocarburos
monoaromáticos (3,4-dimetiltiofeno) y poliaromáticos
(naftaleno y sus derivados), descritos por Sangabriel
et al
. (2006).
En el presente estudio la biodegradación del com-
bustóleo fue estimulada por la FOrg y FInor lo cual
contribuyó a disminuir la proporción de los hidrocar-
buros aromáticos en el suelo contaminado. La pro-
porción de los hidrocarburos 3,4-dimetiltiofeno, 1,2-
dihidro-1-fenilnaftaleno, 1-fenilnaftaleno, y 1-metil-2-
fenil-1H-indol, reportados inicialmente en el mismo
SC (Sangabriel
et al
., 2006), disminuyó después del
tratamiento.
No todos los hidrocarburos se degradan con la
misma facilidad porque la tasa de biodegradación dis-
minuye con el aumento del peso molecular y la com-
plejidad de los hidrocarburos, y es inversamente pro-
porcional al número de anillos y de sustituciones. Los
más volátiles son los hidrocarburos monoaromáticos y
su disminución es notable en el proceso de degrada-
ción natural, llegando incluso a desaparecer (Wang y
Fingas, 1994).
La planta Pocc se cultiva en la zona donde se
produjo el derrame accidental, por lo que puede con-
tribuir a largo plazo en la desaparición del contami-
nante. No obstante, la fertilización puede estimular
la rápida desaparición del combustóleo. En nuestro
entendimiento, este estudio es uno de los primeros
reportes de fitorremediación utilizando Pcocc.
C
ONCLUSIONES
Phaseolus coccineus
tiene potencial de uso en la
fitorremediación de suelos contaminados con com-
bustóleo; además, la fertilización orgánica e inorgá-
nica contribuyó en la reducción de los hidrocarburos
del combustóleo en la rizósfera de Pcocc. El efecto
negativo del combustóleo en el crecimiento de Pcocc
fue compensado con la FInor y la FOrg, mientras
que la población microbiana de la rizósfera contami-
nada fue parcialmente estimulada por la planta o por
la fertilización.
A
GRADECIMIENTOS
Trabajo financiado por proyecto SEMARNAT-CONACYT
2002-CO1-0023.
L
ITERATURA
C
ITADA
Adam G., and H. Duncan. 2003. The effect of diesel fuel on com-
mon vetch (
Vicia sativa
L.) plants. Environ. Geochem. Health
25: 123-130.
(Adam and Duncan, 2003). In our study, the BFN
population was stimulated mainly by the rhizosphere.
But root nodules of
Rhizobium
were not detected in
SC nor in SNC, indicating that the rhizobia compatible
with Pcocc are limited in the sampled soil.
Degradation of fuel oil in the rhizosphere was
stimulated with FOrg or FInor (Figure 3C-D). The
benefit of fertilization in SC is related to stimulation
of plant and rhizospheric microorganism growth,
contributing to degradation of the pollutant (Anderson
et al
., 1993; Ferrera-Cerrato and Alarcon, 2004;
Pilon-Smits, 2005). The presence of Pcocc alone had
no influence on fuel oil degradation (Figure 3A-B), by
comparison with the effect of the fertilizer treatments
(Figure 3C-D). This underlines the importance of
applying fertilizers in plants such as Pcocc, whose
capacity to tolerate hydrocarbon pollution has been
reported (Sangabriel
et al
., 2006), to facilitate
degradation of contaminants compounds in their
rhizosphere, as was shown in our study.
Fuel oil is composed of a complex mixture of
hydrocarbons: parafins (n-alkanes, ramified alkanes,
cyclo-alkanes), monoaromatic alquil (toluene,
ethylbenzene), polyaromatics (PAH, phenanthrene,
pyrene, naphthalene, etc.), and N and sulfur compounds
(Yender
et al
., 2002). PAH are quite insoluble, hard to
degrade, and therefore, persistent in the environment;
they have an affinity for fatty tissues, which favors
its bioaccumulation and permanence for many years
(Neff
et al
., 2000).
With GC-MS, organic compounds derived
from fuel oil in SC have been identified, notably:
monoaromatic hydrocarbons (3,4-dimethyltiophene)
and polyaromatics (naphthalene and its derivatives),
described by Sangabriel
et al
. (2006).
In our study biodegradation of fuel oil was
stimulated by FOrg and FInor, contributing to reducing
the proportion of aromatic hydrocarbons in the
polluted soil. The proportion of the hydrocarbons 3,4-
dimethyltiophene,1,2-dihydro-1-phenylnaphthalene,
1-fenylnaphthalene, and 2-methyl-2-phenyl-1H-indol,
first reported in the same SC (Sangrabriel
et al
., 2006),
decreased after applying the fertilizer treatment.
Not all hydrocarbons are degraded at the same
rate; the biodegradation rate decreases with the
molecular weight and complexity of the hydrocarbons
and is inversely proportional to the number of rings
and substitutions. The most volatile are monoaromatic
hydrocarbons, and their decrease is notable in the
natural degradation process to the point of disappearing
(Wang and Fingas, 1994).
Pcocc is cultivated in the area where the accidental
spill occurred and can thus contribute to eliminating
the pollutant over the long term. Nevertheless,
FITORREMEDIACIÓN DE UN SUELO CONTAMINADO CON COMBUSTÓLEO UTILIZANDO
Phaseoulus coccineus
825
FERRERA-CERRATO
et al
.
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fertilization can stimulate the rapid disappearance of
the fuel oil. As far as we know, this is one of the first
reports of the use of Pcocc in phytoremediation.
C
ONCLUSIONS
Phaseolus coccineus
has the potential to be used
in phytoremediation of soils polluted with fuel oil.
Organic and inorganic fertilization contributed to the
reduction of the hydrocarbons in the rhizosphere of
Pcocc. The negative effect of the fuel oil in Pcocc
growth was compensated with FInor and FOrg, while
the microbial population in the polluted rhizosphere
was partially stimulated by the plant or by the
fertilizers.
—End of the English version—
pvP
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