Anadara tuberculosa (Sowerby, 1833), popularmente conocida en la región Tumbes como concha negra, es un molusco bivalvo perteneciente a la familia Arcidae, que se distribuye a lo largo de la costa del Océano Pacífico, desde Baja California, México hasta Tumbes, Perú (Espinosa, Delgado, Orobio, Mejía-Ladino, & Gil-Agudelo, 2010; Cruz, Fonseca, & Chavarría-Solera, 2012); habita la zona intermareal, asociada a los sustratos fangosos, arcillosos o limo-arcillosos del ecosistema de manglar (Mendoza & Peralta, 2004). Se explota artesanalmente por extractores conocidos como “concheros” quienes sustentan parte de su economía con la extracción y venta de este molusco; sin embargo, la mayoría de los bancos naturales actualmente se encuentran sobreexplotados y algunas poblaciones, en la mayoría de los países, cercanas al colapso (Lucero, Cantera, & Neira, 2012). En Perú, las poblaciones de A. tuberculosa se han reducido en un 73.2 % durante el periodo de 1996 al 2007 (Ordinola, Montero, Alemán, & Llanos, 2007). Por este motivo, se están realizando actividades alternativas como la producción de semillas en laboratorio, cuyas experiencias favorables han sido posibles en México, El Salvador, Perú y Ecuador. En Perú, el engorde en el manglar de semillas producidas en laboratorio ha sido un éxito, aunque con problemas de elevadas mortalidades, asociadas al descenso de la salinidad, en los meses de lluvia (Diringer, Vásquez, Moreno, Pretell, & Sahuquet, 2012; Pretell, 2015-comunicación personal).

A pesar de las diferencias de sensibilidad a variaciones de salinidades, todos los bivalvos son osmoconformes, es decir poseen poca o nula capacidad para la regulación osmótica de su hemolinfa, motivo por lo que, las células soportan la carga de la regulación del volumen ajustando las concentraciones intracelulares de amino ácidos libres (FAAs) y otras moléculas orgánicas pequeñas; sin embargo, los FAAs son principalmente obtenidos del catabolismo de proteínas (autofagia) cuya excesiva pérdida provoca la muerte del animal (Gosling, 2015). A. tuberculosa adultas, muestran gran adaptación a salinidades de 20 a 40 ppt, sin mortalidades asociadas (Nieves et al., 2009); pero experiencias realizadas sobre semillas de 5 mm, mostraron que a salinidades inferiores a 25 ppt provocan importantes mortalidades después de unos días (Diringer et al., 2012).

Los principales mecanismos de adaptación a diferentes salinidades de la ostra y del mejillón han sido caracterizados a nivel molecular (Cross, Merlo, Rodríguez, Portela-Bens, & Rebordinos, 2014; Eierman & Hare, 2014); en particular, Meng et al. (2013), resaltaron la primordial importancia de las vías de metabolismo de los FAAs para la adaptación eurihalina de la ostra Crassostrea gigas. A pesar que la mayoría de los trabajos han sido realizados en diferentes especies de bivalvos, es muy probable que los mecanismos de osmorregulación se conserven a nivel inter-específico. Recientemente, tecnologías de proteómica se han presentado como una alternativa para estudiar la respuesta de bivalvos frente a estrés abióticos (Artigaud et al., 2015; Rocher et al., 2015).

Por lo anterior, es que el objetivo de este trabajo fue determinar la respuesta fisiológica y molecular de A. tuberculosa sometida a un estrés de baja salinidad. Adultos de A. tuberculosa fueron sometidos a salinidades de 5 a 33 ppt mediante desafíos experimentales de diferentes rangos de salinidad. Asimismo, en paralelo se caracterizó los genes asociados a la osmorregulación con técnicas de genómica y de proteómica comparativas, permitiendo caracterizar la respuesta de concha negra al estrés de salinidad, tanto en lo ecofisiológico como en lo molecular, para entender los mecanismos de adaptación, que permitirán a futuro seleccionar marcadores para programas de mejoramiento genético de este importante recurso en la Región Tumbes.

Materiales y métodos

Un total de 150 ejemplares de A. tuberculosa fueron recolectados entre agosto 2015 y enero 2016 en los bancos naturales del manglar colindante a la Bahía de Puerto Pizarro (3°30’12.96” S - 80°23’55.87” W), Tumbes, Perú. Los esteros que conforman este ecosistema poseen una salinidad de 33 ppt en marea alta, llegando a alcanzar una altura promedio de 1.20 m, con una fluctuación entre la alta y baja marea de 6 horas. Se seleccionaron los ejemplares que presentaban un tamaño ≥ 45 mm de longitud de valva para luego ser transportados al Centro Colectivo Educativo Experimental de Biología y Biotecnología Acuática y Acuícola de Puerto Pizarro (CEBAP).

Aclimatación y desafíos experimentales

Se realizó un primer ensayo en agosto 2015. La parte ventral de la concha de los ejemplares seleccionados fue limada con la finalidad de que las branquias queden expuestas (Zhao, Yu, Kong, & Li, 2012). Posteriormente, todos ellos se aclimataron por 24 horas a 33 ppt de salinidad en agua de mar filtrada a 1µm y tratada (AMFT) con 10 ppm de Ca(ClO)2 y neutralizada con 0.9 ppm de Na2S2O3. Transcurrido este periodo, se formaron grupos de diez animales por triplicado y se colocaron en recipientes con 20 litros de agua de mar previamente mezclada con diferentes proporciones de agua dulce para obtener los diferentes grados de salinidad. Los individuos fueron directamente sometidos a condiciones de estrés hipo-osmótico (extremo: 5 y 10 ppt); (moderado: 15 y 25 ppt) y sin estrés (grupo control: 33 ppt). Las muestras fueron evaluadas por un periodo de 16 días con 100 % de recambio de agua cada 48 h, o en caso de presentar mortalidad. Los animales fueron alimentados durante el tiempo del bioensayo con un mix de microalgas (Isocrisis sp. y Chaetoceros spp.) a una concentración de 50 000 cel/mL de cada cepa, una vez al día. Estas muestras sirvieron para las evaluaciones genéticas.

En enero 2016, se realizó una segunda prueba utilizando el mismo procedimiento antes mencionado para la evaluación proteómica, con la diferencia de que los animales fueron expuestos solamente por periodos de 4, 8 y 12 horas, sin alimentación.

Extracción de ADN

Se usó 80 mg de tejido branquial macerado de A. tuberculosa, mediante el método de extracción CTAB 2 % (Bromuro de hexadeciltrimetilamonio), complementado con proteinasa K (Gardes & Bruns, 1993). El ADN genómico se obtuvo con fenol, cloroformo y alcohol isoamil en proporción (25:24:1 v/v). Se precipitó con etanol frío al 95 %, y se realizó un lavado con etanol al 75 %. El ADN obtenido se resuspendió en 50 µL de buffer TE Tris/EDTA (Tris 10 mM, EDTA 1 mM) y fue conservado a -20 °C.

Amplificación por PCR de genes de referencia y genes de interés

La calidad del ADN genómico se evaluó por amplificación del gen constitutivo mitocondrial COI con los iniciadores LCO (GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG’) y HCO (TAAACTTCAGGG TGACCAAA AAATCA). Los genes de interés evaluados para este estudio fueron: Aminomethyltransferase, Glycine dehydrogenase, Glycine hydroxymethyltransferase, Δ-1pyrroline-5-carboxylate synthase, Ornithine aminotransferase, Arginase, Alanine transaminase, Alanine-glyoxylate transaminase, Glutamate decarboxylase, Glutamate decarboxylase 1-2, Spermidine synthase, Aldehyde dehydrogenase, ATP-grasp domain-containing protein, Cysteine sulfinic acid decarboxylase1-2, Taurine transporter, HSP beta 1, Sodium- and chloride-dependent glycine transporter (Meng et al., 2013; Cross et al., 2014; Eierman & Hare, 2014).

El mix de PCR “Thermo Scientific DNA Polymerase” (Invitrogen) contenía 15 pmol por cada juego de iniciador en un volumen final de 25 μL: Buffer de PCR (1X), Cl2Mg (1.5 mM), taq polimerasa (2 U) y dNTPs (0.2 mM). Se utilizó un termociclador (Biometra UNO thermoblock) con una programación de 95 °C por 5 min para la desnaturalización inicial; 35 ciclos a 94 °C por 30 s; para la desnaturalización, 50 °C por 45 s para la hibridación y 72 °C por 45 s para la polimerización. Se usó como control positivo ADN extraído a partir de branquias de Crassostrea gigas.

Extracción de proteínas a partir de tejido branquial

Fragmentos de la parte blanda de las branquias fueron extraídas a las 4, 8 y 12 horas de exposición a partir de animales expuestos y aclimatados a salinidades de 0, 5, 15 y 25 ppt, y almacenadas en PMSF 0.1 mM (fluoruro de fenilmetilsulfonilo) a -20 °C. Para la extracción de proteínas se utilizó el método PBS 1X (buffer fosfato salino), con 1 mM de PMSF, y se usó como agentes de precipitación TCA (ácido tricloroacetico) con acetona para luego ser resuspendido en 100 μL de buffer de rehidratación (Agua grado HPLC/0.1 % TFA Ácido trifluroacetico), almacenándolo a -20 °C.

Migración en SDS page y visualización de bandas

Las proteínas purificadas fueron luego tratadas según el protocolo descrito por Shevchenko, Henrik, Jan, Jesper y Matthias (2006). Brevemente, de la muestra anterior se tomó 25 μL y se mezcló con 10 μL de buffer de carga (1M de Tris pH 6.8, 10 % SDS, 10 % glicerol, 0.02 % azul de bromofenol, 0.71 M DTT y agua bidestilada) a 2x. Se llevó a migrar en gel SDS PAGE al 12 %. Las bandas de interés fueron extraídas y digeridas. Las muestras fueron hidratadas con agua grado HPLC con TCA y se les adicionó el mismo volumen de matriz CHCA, se homogenizó cuidadosamente y fue colocada en el spot de la OptiTOF® sample plate.

Análisis proteómico por espectrometría de masas

A través de un espectrómetro de masa MALDI TOF/TOF MS Analyzer 5800 (Applied Biosystems) en modo MS Linear High Mass Positive y MS Reflector Positive con un láser Nd:YAG de λ a 335 nm, frecuencia 200 Hz. La placa Opti-Tof fue calibrada en un rango de 800-1 800 m/z utilizando una mezcla de calibrantes, los espectros se obtuvieron con 500 disparos con 3 200 U internas de intensidad de láser en un rango de 600-4 000 m/z. En modo TOF/TOF, los iones fueron acelerados a 8 kV y el análisis se realizó usando el programa 4000 Series Explorer versión 3.5.3 (Applied Biosystem). Se usó los iones de autólisis de la tripsina 842,510 m/z y 2 211,105 m/z para calibración interna del equipo.

Resultados

Efecto de cambios de salinidad sobre A. tuberculosa

No se reportó mortalidades en los tratamientos con salinidades de 15 a 33 ppt durante el periodo evaluado. El primer ejemplar muerto apareció al tercer día a 5 ppt; luego, la disminución de supervivencia fue progresiva, hasta que el último animal murió a los 15 días del ensayo. La mortalidad a 10 ppt inició a los 12 días, pero fue más severa con la desaparición del 90 % de los ejemplares a los cuatro días. Se observó mortalidades en los adultos mantenidos a una salinidad de 20 ppt después de 18 días.

Desde un punto de vista de comportamiento, los animales expuestos a salinidades hipo-osmóticas extremas (5 y 10 ppt), cerraron las valvas y la filtración del alimento fue mínima. A partir del tercer día presentaron una motilidad aletargada y daño en el tejido branquial, así también, desangramiento parcial. Los animales expuestos a estrés hipo-osmótico moderado 15 ppt y 25 ppt, así como el control a 33 ppt, presentaron actividad frecuente (movilidad, alimentación), y formación de biso.

Amplificación de genes osmoreguladores

En este estudio se evaluó la presencia de 19 genes asociados a la osmorregulación en ostras y mejillones (Cuadro 1). De estos, se evidenció que 15 son enzimas claves del metabolismos de los FAAs (2 al 16), tres son transportadores de los principales FAAs (17 al 19), uno está relacionado al mecanismo de estrés (20), y se incluyó un control positivo que había sido utilizado en estudios anteriores sobre A. tuberculosa (1).

De todos los genes evaluados, el gen COI fue el único en ser amplificado mediante PCR en A. tuberculosa, lo que valida la calidad de la extracción de ADN para este molusco. Luego, 18 de los 20 genes fueron exitosamente amplificados para la muestra de C. gigas, incluyendo el gen COI, lo que validó también los protocolos de amplificación de la mayoría de los genes, pero Δ-1-pyrroline-5-carboxylate synthase y Glycine hydroxymethyltransferase fueron los únicos que no amplificaron.

Estos resultados evidencian diferencias, al menos a nivel genómico, de los genes involucrados en la osmorregulación de A. tuberculosa con C. gigas.

Identificación de secuencias peptídicas

De los individuos expuestos a salinidades de 0, 5, 15 y 25 ppt durante la segunda evaluación, se extrajo proteínas a partir de las branquias. Se obtuvo un total 26 secuencias, de las cuales 10 se expresaron únicamente en los individuos mantenidos a 0 y 5 ppt (diferencial), y 16 expresadas en todos los grupos (presencial) (Cuadro 2). De todas estas, se encontró que dos están relacionadas al mecanismo de osmorregulación en invertebrados marinos. La primera secuencia corresponde a un fragmento de una heat shock protein de 70 Kda (HSP70), que se encontró de manera presencial en todas las muestras a diferentes salinidades, cualitativamente la HSP70 presentó una mayor expresión a 0 y 5 ppt, cuando se comparaba las intensidades de las bandas extraídas del gel de SDS Page. Por su parte, la segunda corresponde a una secuencia de seis péptidos, que pertenecen a canales de cloro (chloride channel protein), que aparece como un candidato válido del mecanismo de osmoregulación para la concha negra A. tuberculosa.

Discusión

La comprensión de los mecanismos por los cuales los organismos pueden adaptarse a los desafíos ambientales y los factores que limitan sus capacidades de distribución, han sido durante mucho tiempo la interrogante de la biología. La supervivencia de los organismos marinos requerirá la aclimatación y adaptación a estas variantes ambientales. En el ecosistema manglar de Tumbes, donde habita el bivalvo A. tuberculosa existen eventos de descensos bruscos de salinidad, que suelen acontecer principalmente durante el verano con la entrada de agua dulce. En estas zonas de encuentro, la salinidad puede disminuir drásticamente en un lapso de unas horas y hasta ser completamente dulce durante las mareas bajas (Nieves et al., 2009).

El presente trabajo complementa los resultados obtenidos por Nieves et al. (2009), quienes evaluaron por 15 días al bivalvo A. tuberculosa, y monstraron crecimiento en adultos mantenidos entre 20 a 50 ppt de salinidad a distintas temperaturas, concluyendo que las salinidades altas (40 a 50 ppt) perjudican el crecimiento, y que las condiciones óptimas de cultivo son 20 ppt y 32 °C. Sin embargo, al finalizar estos experimentos, los individuos que se mantuvieron a salinidades de 20 ppt mostraron mortalidades después de 18 días (resultados no mostrados). Por otro lado, los resultados de Diringer et al. (2012) quienes evaluaron la supervivencia de semillas de A. tuberculosa producidas en laboratorio y mantenidas de 45 a 0 ppt por 20 días, demostraron que la supervivencia fue severamente afectada a salinidades inferiores o igual a 20 ppt (100 % de mortalidad entre 2 a 11 días) y moderadamente afectadas a salinidad de 45 ppt (20 % de mortalidad a los 18 días). En conjunto, estos resultados demuestran que A. tuberculosa es una especie eurihalina. Se sugiere que la supervivencia a salinidades inferiores o iguales a 20 ppt está relacionada a la capacidad del bivalvo a reajustar su volumen celular a través de la excreción de FAAs, que y que depende de las reservas energéticas inicial de cada individuo, tal como lo menciona Gosling (2015). Esta hipótesis se ajusta a los resultados obtenidos con semillas de A. tuberculosa que poseen menos reservas o que poseen un desgaste más acelerado que un adulto.

Estudios previos han demostrado que los FAAs intracelulares son los principales contribuyentes a la regulación de la osmolaridad intracelular y del volumen celular en bivalvos (Gosling, 2015). En este trabajo se diseñó 18 marcadores moleculares asociados al sistema de regulación por FAAs, y uno a partir de la proteína de estrés (HSP70), usando las secuencias disponibles publicadas de cuatro bivalvos modelos: las ostras C. gigas, C. angulata, C. virginica y el mejillón M. galloprovincialis (Meng et al., 2013; Cross et al., 2014; Eierman & Hare, 2014).

La utilización de dos controles positivos (COI para bivalvos y ADN de ostras) permitió confirmar que la ausencia de amplificación de los genes evaluados se debe o a diferencias genéticas en las regiones conservadas evaluadas, o a la ausencia de estos genes en A. tuberculosa. La primera hipótesis aparece como la más probable debido al predominio del sistema de osmorregulación mediante la utilización de FAAs en bivalvos y gasterópodos marinos; así como, porque importantes diferencias a nivel genético, en particular en los genes asociados a mecanismos de respuestas a estrés abióticos, se encontraron entre las secuencias nucleotídicas de C. angulata y C. virginica con C. gigas (Cross et al., 2014; Eierman & Hare, 2014).

Existen diferentes alternativas para a futuro identificar a nivel nucleotídico los genes específicos involucrados en la osmoregulacion en A. tuberculosa. Los trabajos realizados a nivel genómico o transcriptómico por Cross et al. (2014), o Meng et al. (2013) y Eierman y Hare (2014) en ostras, abrieron el camino para la identificación de marcadores genéticos específicos de bivalvos, mediante la aplicación de herramientas de Next Generation Sequencing (NGS) y podrían ser aplicados a A. tuberculosa. Es importante resaltar un estudio realizado por Barman et al. (2012) en el camarón Macrobrachium rosenbergii, que evaluó la expresión de ARNm del crustáceo expuesto a diferentes salinidades, por transcriptómica diferencial, mediante la técnica de Hibridación Substractiva y Supresiva (SSH), que permite resaltar a los transcriptos más discretos.

Como alternativa al trabajo genético, se exploró el proteoma diferencial de A. tuberculosa sometida a diferentes salinidades, lográndose identificar a 16 proteínas “presenciales” y 10 proteínas expresadas de forma diferenciales (38.5 %) al control, mediante separación por electroforesis SDS PAGE 1D. El único trabajo similar realizado en bivalvos fue presentado por Tomanek, Zuzow, Hitt, Serafini, y Valenzuela Tomanek, (2012) que compararon la respuesta al estrés hipo-osmótico en dos especies de mejillón. A pesar de que este equipo obtuvo más proteínas aisladas gracias a un sistema de separación SDS PAGE 2D, la proporción de proteínas diferenciales fue de 29 % para M. galloprovincialis y 39 % para M. trossulus, lo que está dentro del rango del presente estudio.

La familia de HSP es comúnmente encontrada en moluscos sometidos a estrés abióticos y ha sido reiteradamente propuesta como biomarcador (Gracey et al., 2008; Yang et al., 2014; Patterson, Boettcher, & Carmichael, 2014; Liu, He, Chi, & Lv, 2015; Shiel, Hall, Cooke, Robinson, & Strugnell, 2015). En este trabajo se intentó sin éxito amplificar por PCR una región conservada de esta chaperona, mientras que esta proteína pudo ser detectada mediante proteómica, esto se debe al carácter muy variable de HSP70 que presenta mucha variabilidad intra e inter específica, tal como lo menciona Yang et al. (2014).

El canal a cloro encontrado en A. tuberculosa, presentó grandes similitudes con una proteína de C. gigas (chloride channel protein 2-like isoform X2) sometida a condiciones de estrés de salinidad (Damiens et al., 2006). Estos canales cumplen una variedad de importantes roles celulares y fisiológicos entre los que se encuentran la regulación del pH, regulación del volumen en la homeostasis, transporte de solutos orgánicos, migración celular y diferenciación por lo que parece como un candidato válido del mecanismo de osmoregulación para A. tuberculosa.

La no amplificación de los genes evaluados por PCR revela diferencias genéticas entre A. tuberculosa y los bivalvos previamente estudiados (C. gigas, C. angulata, O. edulis y M. galloprovincialis), sin poder determinar si estas corresponden a diferencias nucleotídicas de las regiones conservadas, o por la ausencia de estos genes en A. tuberculosa.

Las secuencias aminoacídicas obtenidas por espectrometría de masas identificaron HSP 70, canal de cloro, y al piruvato kinasa como posibles biomarcadores del sistema de osmorregulación en A. tuberculosa, y permitirán diseñar iniciadores específicos para la puesta en marcha de futuros programas de mejoramiento genético de este importante recurso.

Agradecimientos

El presente estudio fue posible gracias al aporte de financiamientos por parte de la Universidad Nacional de Tumbes a través del proyecto CANON Resolución Nº 00723-2014/UNT-R., K.P y V.C. recibieron una beca de CONCYTEC (CONVENIO DE GESTIÓN N° 015-2013- FONDECYT, y R.P.Nº 206-2013-CONCYTEC-P.), y B.D de la Escuela Doctoral Franco-Peruana en Ciencias de la Vida.

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