Avaliação da exposição ocupacional ao benzeno em trabalhadores frentistas e analistas de combustíveis utilizando o Teste Cometa como biomarcador de genotoxicidade

Comet assay as a biomarker of genotoxicity to assess occupational exposure to benzene in gas-station attendants and fuel analysts

O benzeno é o hidrocarboneto aromático mais tóxico, classificado pela Agência Internacional de Pesquisa em Câncer (IARC), da Organização Mundial da Saúde (OMS), no Grupo I, como cancerígeno para os seres humanos. É encontrado naturalmente no petróleo e na produção de aço como um subproduto na produção de “coque” e em processos de síntese química, onde ocorre a principal exposição ocupacional ao benzeno¹.

A gasolina é uma importante fonte de exposição ambiental e ocupacional ao benzeno considerando que a substância pode estar presente de 1 a 5%, cujo valor real varia em diferentes países². No Brasil, a Agência Nacional do Petróleo (ANP) estabeleceu por meio da Resolução 40, de 25 de outubro de 2013³, o valor máximo de concentração de benzeno de 1% (v/v) na gasolina do tipo C ou Premium tipo C. Atualmente, as diretrizes dos países da América do Norte e da Europa apontam para redução do benzeno na gasolina para um nível menor que 1%. A tendência de reduzir o benzeno na gasolina nesses países é devido à necessidade de redução da exposição ocupacional dos trabalhadores, pela preocupação com efeitos tóxicos na saúde e também da diminuição da exposição ambiental ao benzeno para a população em geral⁴.

O risco da exposição ao benzeno é amplificado quando se considera que a gasolina é um produto usado sem qualquer controle em áreas residenciais, na indústria de impressão e oficinas mecânicas como um solvente de limpeza. Nos últimos anos, a exposição ocupacional ao benzeno pela gasolina tem sido objeto de pesquisa, a fim de estabelecer a relação de causa-efeito a partir de fontes de exposição ambiental e ocupacional^5)-(8.

O uso de biomarcadores na avaliação da exposição ocupacional às substâncias químicas constitui uma forma de detectar precocemente uma exposição excessiva do trabalhador, para prevenir a ocorrência dos efeitos adversos à saúde⁹. Na monitorização biológica da exposição ocupacional ao benzeno normalmente são utilizados os biomarcadores de exposição, os quais são a própria substância inalterada na urina, sangue e ar expirado, ou seus metabólitos na urina. No entanto, os estudos de avaliação da exposição ocupacional ao benzeno podem ser complementados por outros parâmetros analíticos que avaliam, além da intensidade da exposição, o efeito genotóxico^5),(10),(11. Agentes genotóxicos, tais como o benzeno, interagem quimicamente com o material genético, resultando em adutos, modificações oxidativas ou mesmo quebras na molécula de DNA. O agente químico que promove a formação de aduto de DNA é conhecido como “DNA reativo” e, portanto, considerado como um agente genotóxico^12)-(14.

O Teste Cometa tem larga aplicação na toxicologia para avaliar o efeito genotóxico de produtos químicos, além de ser utilizado nos estudos de biomonitoramento de trabalhadores para avaliar o risco da exposição ocupacional aos agentes potenciais ou comprovadamente cancerígenos. É considerada uma técnica versátil por sua adaptabilidade a uma variedade de tecidos, como culturas de células ou amostras biológicas^15)-(18. O uso do Teste Cometa em células sanguíneas tem sido empregado na avaliação da exposição de trabalhadores expostos às substâncias químicas e na população em geral, como um biomarcador de efeito de substâncias químicas genotóxicas e potencialmente mutagênicas ou carcinogênicas^19)-(22.

O objetivo deste estudo foi avaliar a exposição ocupacional ao benzeno utilizando o Teste Cometa como biomarcador de genotoxicidade em células sanguíneas de trabalhadores expostos à gasolina, e confrontar esses resultados com o ácido trans, trans-mucônico (AttM) na urina; cujo parâmetro como biomarcador de exposição correlaciona-se com a intensidade do benzeno no ar.

Foi realizado um estudo transversal utilizando ferramentas quantitativas e avaliação das variáveis sociodemográficas e tempo de exposição.

A população de estudo foi composta de 53 indivíduos entre as idades de 19 a 55 anos, dos quais 31 eram do sexo masculino e 22 do sexo feminino. Dos 53 indivíduos que aceitaram participar do estudo, 31 eram trabalhadores expostos e 22 eram indivíduos não expostos ocupacionalmente ao benzeno. A fim de minimizar os fatores de confusão, os grupos foram categorizados por faixa etária (< 25; 25 a 35; e > 35 anos), sexo, tempo de exposição e consumo de álcool. A média (desvio padrão) da idade do Grupo I (exposto) foi de 29 (8,8) anos, variando de 23 a 55 anos. A maioria era de frentistas (58%), homens (58%), entre 25 e 35 anos (54,8%), e trabalhavam há mais de dois anos na profissão (38,7%). Como todos os indivíduos do Grupo I trabalhavam 8 horas por dia, esta não foi considerada uma variável a ser analisada. A idade média do Grupo II (não exposto) foi de 33 (8,3), variando de 19 a 55, sendo que a maioria eram homens (59,1%) com idade entre 25 e 35 anos (54,5%).

O resultado do Teste Cometa para os Grupos I e II é mostrado na Tabela 1. Os valores desse biomarcador são expressos pelo Índice de Dano (ID) e mostraram diferenças significativas (p < 0,05) entre os dois grupos. Os resultados das análises em relação aos fatores individuais, como sexo e idade, mostraram diferenças entre os grupos, com exceção para a categoria de idade com mais de 35 anos, cuja diferença não foi observada. O consumo de álcool entre os grupos e o tempo de exposição dentro do Grupo I não foram variáveis significativamente diferentes.

Tabela 1
Distribuição do Índice de Dano médio pelo Teste Cometa para os Grupos I (exposto) e II (não exposto), Belo Horizonte, MG, 2012

Em relação ao tipo de profissão, verificou-se um aumento do ID em frentistas quando comparado aos analistas de combustíveis, cujos resultados são apresentados na Tabela 2. Também foram observadas diferenças significativas nos valores de ID entre frentistas e analistas, relacionados ao gênero e idade entre 25 a 35 anos.

Tabela 2
Distribuição do Índice de Dano médio pelo Teste Cometa para o Grupo I por profissão, Belo Horizonte, MG, 2012

Os valores encontrados do AttM urinário para ambos os grupos são mostrados na Tabela 3. Os valores médios desse biomarcador no Grupo I apresentaram diferença significativa quando comparado com os valores do Grupo II (p < 0,05). Os indivíduos com idade maior que 25 anos, e de 25 a 35 anos no grupo exposto, apresentaram níveis de AttM elevados, em comparação com indivíduos não expostos. Mulheres expostas também apresentaram aumento dos níveis de AttM. O consumo de álcool entre os grupos e o tempo de exposição dentro do Grupo I não foram variáveis significativamente diferentes.

Tabela 3
Distribuição da concentração média do ácido trans, trans-mucônico urinário para os Grupos I (exposto) e II (não exposto), Belo Horizonte, MG, 2012

Frentistas apresentaram maior concentração de AttM em comparação com analistas de combustíveis, cujos resultados são mostrados na Tabela 4. Após estratificação do Grupo I, entre frentistas e analistas de combustíveis, a diferença nos valores de AttM foi observada para o gênero feminino e não diferenciado em relação à idade.

Tabela 4
Distribuição da concentração média do ácido trans, trans-mucônico urinário para o Grupo I por profissão, Belo Horizonte, MG, 2012

A associação entre os dois biomarcadores é demonstrada graficamente na Figura 1, cujo coeficiente de correlação linear de Pearson (r) foi 0,81 (p<0,05).

Figura 1
Relação entre a concentração de AttM urinário e Índice de Dano pelo Teste Cometa em trabalhadores expostos ao benzeno (frentistas e analistas de combustíveis). Coeficiente de correlação de Pearson = 0,81, Belo Horizonte, MG, 2012

Este estudo investigou o risco da exposição ocupacional ao benzeno frente aos possíveis efeitos genotóxicos em frentistas e analistas de combustíveis. Para isso, foi utilizado o Teste Cometa para determinar a extensão do dano primário ao DNA em indivíduos expostos e não expostos à gasolina, correlacionando os achados com valores de AttM urinário, que é biomarcador de dose interna do benzeno. Exposições ocupacionais a substâncias tóxicas constituem importante problema de saúde pública e este ensaio indica a possibilidade para identificar fatores de risco como uma ferramenta para caracterizar o problema, além de reforçar a necessidade de medidas de controle eficazes para proteger a saúde dos trabalhadores desse setor.

O dano ao DNA através do Teste Cometa pode ser medido manualmente ou por software. A quantificação manual foi usada para expressar os resultados, uma vez que nem todos os laboratórios têm automação. Moller et al.³¹ e Moller³² compararam a quantificação manual e automatizada e concluíram que havia uma relação estreita entre as duas formas, sendo considerada também a performance individual dos observadores participantes do estudo.

Os dados encontrados do Teste Cometa mostrando que o grupo exposto exibiu um grau significativamente mais elevado de danos ao DNA em linfócitos periféricos do que o grupo não exposto, seguido por um aumento da excreção urinária de AttM, foi evidenciado também em estudos relatados por outros autores^{5),(10),(11),(33}.

Ao estratificar a população, para comparar os valores de ID do Teste Cometa, observamos que entre os sexos, e para idade inferior a 35 anos, a diferença entre os dois grupos é mantida, mas que para maiores de 35 anos não existe diferença de dano ao DNA para o grupo exposto e não exposto. Esse achado pode ser explicado pelo acúmulo de danos ao DNA, incluindo mutações, que ocorrem naturalmente em indivíduos mais velhos, além do pequeno número de indivíduos dessa faixa etária (n=9)³¹. Esse dado é, potencialmente, uma limitação no uso do Teste Cometa, como biomarcador para avaliar a exposição ao benzeno ou a outra substância genotóxica, pois a sensibilidade pode ser afetada pela idade dos indivíduos expostos, sendo menor para grupos de indivíduos acima de 35 anos, atingindo um nível de saturação que limita a sensibilidade do Teste Cometa.

Em relação ao consumo de álcool, não foi encontrada diferença significativa nas concentrações de AttM urinário e nos valores do Teste Cometa entre os indivíduos que relataram o consumo ou não consumo de bebida alcoólica. Dado semelhante foi relatado no estudo realizado por Rekhadevi et al.³⁴ com Teste Cometa em frentistas de postos de combustíveis. Nenhuma diferença estatística foi observada no Grupo I, com relação ao tempo de exposição menor ou maior que dois anos, concordando também com dados da literatura¹¹.

A diferença no ID encontrado entre frentistas e analistas pode estar relacionada ao fato de que os analistas de combustíveis em geral trabalham com EPI num local com fluxo de ar controlado, diminuindo o risco da exposição pelos solventes, entre eles o benzeno. Porém, quando comparado ao controle, o grupo de analistas ainda possui um dano ao DNA relativamente mais alto e significativo.

Em relação ao biomarcador de dose interna, o ácido trans, trans-mucônico urinário, a média dos valores encontrados foi significativamente maior entre os indivíduos do Grupo I, de acordo com a norma nacional³⁵, o que indica uma exposição ocupacional a baixas concentrações de benzeno no ar. Valores similares para frentistas também foram relatados no estudo de Costa e Costa³⁶. No entanto, a exposição a benzeno em doses baixas não exclui o risco à saúde^37),(38. De acordo com Smith et al³⁸, o mecanismo de ação do benzeno na medula óssea leva aos efeitos tóxicos também em baixos níveis de exposição e podem aumentar gradativamente com doses crescentes e sugere que um modelo em que não exista um limite de exposição segura é o mais apropriado para a exposição ao benzeno.

No Grupo II, os valores encontrados de AttM urinário são similares a valores reportados na literatura, que foram de <0,01-0,66 mg/g de creatinina^28),(39),(40, considerando os diversos fatores que influenciam a concentração do AttM na urina, como tabagismo, o consumo de ácido sórbico e seus sais presentes em alguns alimentos, álcool, além de fatores individuais. Para diminuir os fatores de confusão, foram excluídos deste estudo os indivíduos fumantes e um questionário detalhado foi aplicado em ambos os grupos. O consumo de álcool não gerou diferença estatística entre os grupos, como também foi relatado por Paula et al.²⁹. Não houve participantes do estudo que relataram o consumo excessivo de alimentos com alto teor de conservantes, como enlatados e embutidos.

Para o Grupo I, o tempo de exposição (6 meses a 2 anos e mais de 2 anos) não influenciou os valores dos biomarcadores. Foi observada uma correlação positiva entre a idade e a excreção de AttM em ambos os grupos (expostos e não expostos), demonstrando que quanto maior a idade, maior a concentração de AttM urinário, o que corrobora com o estudo realizado por Paula et al.²⁹. Além disso, o valor médio de excreção urinária de AttM entre os frentistas foi acima daquele observado entre analistas de combustíveis, cuja diferença entre os grupos já foi mencionada para o Teste Cometa. Ao estratificar o Grupo I em relação ao gênero, foi observado que o grupo feminino apresentou maior excreção de AttM, mesma diferença observada para o Teste Cometa.

O biomonitoramento da população exposta a agentes químicos pelo Teste Cometa, nos últimos anos, tornou-se uma ferramenta importante para detectar efeitos celulares como danos do DNA^{5),(11),(21),(17),(37}. Embora a detecção de danos no DNA, utilizando linfócitos do sangue periférico, não represente o surgimento de patologias no curto e médio prazo, os especialistas concordam que as células do sangue podem ser usadas como “células-sentinela”, a fim de fornecer um sinal de detecção precoce de efeitos adversos à saúde⁴¹.

Alguns fatores individuais, como tabagismo, consumo de álcool, idade, sexo e outros são possíveis de controlar em estudos de biomonitorização, mas às vezes não é possível atribuir o dano genotóxico para um produto químico em particular. A utilização do Teste Cometa tem limitações devido à influência desses fatores de confusão. Assim, o dano ao DNA observado em nosso estudo não pode ser atribuído apenas ao benzeno, mas também a um efeito cumulativo de muitos outros compostos químicos e condições que não foram avaliadas e que podem fazer parte da vida dos participantes, no ambiente de trabalho ou não. No entanto, como neste estudo foi utilizado um grupo “controle”, consideramos que há fortes evidências de que o aumento de dano ao DNA encontrado na população está ligado ao benzeno, e essa exposição ocupacional constitui um risco para a saúde.

Assim, buscou-se associar a intensidade da exposição ao benzeno expressa pelo biomarcador de dose interna (AttM urinário), com o biomarcador de genotoxicidade pelo índice de danos no DNA expresso pelo Teste Cometa. O Teste Cometa correlacionou de maneira positiva com os resultados do AttM, ou seja, quando houve uma excreção urinária maior do biomarcador, os danos ao DNA também eram maiores. Essa associação entre ambos os biomarcadores sugere que a maior exposição ocupacional está associada a um risco aumentado de dano genético entre indivíduos expostos à gasolina. O valor encontrado do coeficiente de correlação de 0,81 na população estudada foi superior à mesma associação descrita por Moro et al⁵. Apesar do Teste Cometa não ser um biomarcador de efeito específico do benzeno, sua comparação com biomarcador específico de dose interna de benzeno agrega valor à avaliação da exposição ocupacional e reconhecimento do risco.

Ao correlacionar os resultados dos biomarcadores com as variáveis de sexo e idade, a correlação positiva entre o Teste Cometa e AttM não foi mais observada, provavelmente devido aos fatores de confundimento de cada biomarcador ou pequeno número de indivíduos no estudo.

O biomarcador de exposição do benzeno, ácido trans, trans-mucônico, permitiu verificar que a população exposta estudada estava em contato com a substância e que os níveis aumentados deste biomarcador para frentistas e analistas de combustível caracterizaram uma exposição ocupacional.

O Teste Cometa possibilitou diferenciar o grupo exposto mostrando-se como um biomarcador de efeito sensível, o qual é uma indicação precoce de um efeito nocivo ou uma doença.

A correlação obtida entre o biomarcador de exposição e o Teste Cometa foi forte, o que contribui para a confiabilidade do achado de que existe um risco ocupacional e genotóxico em relação à exposição ao benzeno na gasolina.