De todos los componentes de la fracción orgánica del hueso arriba mencionados, el colágeno es el mejor conocido en cuanto a sus patrones de alteración diagenética. Las PNC, por el contrario, han sido menos estudiadas desde una perspectiva diagenética, principalmente debido a su escasez, lo que hace poco práctico su uso como blanco de análisis químicos de importancia arqueológica (Smith 2002); por este motivo no serán abordadas en este trabajo -para un tratamiento actualizado de este tema, remitimos al lector a Procopio et al. (2021) y a Wadsworth et al. (2017)-.

Colágeno

A medida que el hueso se degrada, la cantidad de colágeno se reduce (Hedges y Law 1989), pero el propio colágeno también se degrada, de modo que ya no se encuentra bien definido desde un punto de vista químico (Hedges et al. 1995). El colágeno se puede degradar a través de dos mecanismos principales: a) hidrólisis enzimática a partir de las colagenasas y proteasas bacterianas, y b) hidrólisis química de los enlaces peptídicos (Child 1995a). Los principales factores que controlan la tasa de hidrólisis del colágeno son la temperatura de la reacción, la disponibilidad de agua y el pH de la solución (Smith 2002).

La degradación por hidrólisis del colágeno normalmente es lenta (Dobberstein et al. 2009). Esto es particularmente cierto en el colágeno mineralizado, ya que el mineral mantiene unidos los componentes de la matriz (complejo colágeno-apatita), dándole estabilidad y previniendo la expansión de la triple hélice del colágeno, que es un requisito previo para el colapso de las fibrillas (Buckley et al. 2008). Sin embargo, la tasa de degradación puede aumentar mediante incrementos de temperatura o mediante catálisis ácida o alcalina (Rudakova y Zaikov 1987). La velocidad de hidrólisis del colágeno también puede ser catalizada por actividad enzimática. Se estima que la hidrólisis producida por este mecanismo, a temperatura ambiente, es mucho más rápida que la hidrólisis química de los enlaces peptídicos (Smith 2002). Se ha propuesto que, mientras la asociación colágeno-apatita esté intacta, las colagenasas y proteasas específicas con actividad colagenasa producidas por microorganismos no pueden funcionar adecuadamente, es decir, solo lo harían una vez que el hueso esté parcialmente desmineralizado (Child 1995a y 1995b). Debido al gran tamaño de las bacterias y de las colagenasas en relación con la porosidad existente entre el colágeno y la apatita, primero debería eliminarse el mineral para exponer la triple hélice del colágeno (Hedges 2002; Nielsen-Marsh et al. 2000), tal cual ocurre durante la reabsorción ósea (Kendall et al. 2018).

El resultado de la hidrólisis, tanto enzimática como química, es la transformación de la estructura rígida e insoluble del colágeno en una gelatina amorfa soluble en agua que posteriormente se lixivia del hueso (Pfretzschner 2006; Smith et al. 2002). Esto provoca una reducción del contenido de colágeno, un aumento de la porosidad (Nielsen-Marsh y Hedges 1999) y una pérdida de resistencia mecánica del hueso (Turner-Walker y Parry 1995). Las condiciones del suelo, como la acidez o alcalinidad extrema, pueden exacerbar los efectos de la hidrólisis, lo que provoca que el colágeno se pierda mucho más rápida y eficazmente (Collins et al. 1995; Smith et al. 2002).

Pfretzschner (2006) sostiene que la cantidad de proteína eliminada por la actividad microbiana durante la fase inicial de la diagénesis ósea (véanse Jans et al. 2004; Kendall et al. 2018, y Turner-Walker 2012) es sorprendentemente baja en los huesos largos grandes, ya que equivale al 5 %-10 % del contenido total de colágeno de un hueso fresco. Esto significaría que la mayor parte del colágeno óseo se elimina mediante degradación química y lixiviación (Pfretzschner 2006). La destrucción química del colágeno, por otra parte, está influenciada por aumentos repentinos de la temperatura media (Von Endt y Ortner 1984), como se infiere en el caso de los huesos de la localidad italiana de Apigliano, emblemáticos de la vía diagenética denominada hidrólisis acelerada del colágeno (Smith et al. 2002)⁴. Lo mismo ocurre en huesos sometidos a procesos de cocción, en los que las altas temperaturas producen una pérdida importante de colágeno (Roberts et al. 2002; Solari et al. 2013)⁵. Otro factor es el daño a la estructura ósea a nivel macroscópico. En este sentido, se ha demostrado que las áreas alrededor de las superficies óseas agrietadas, ya sea por el mascado o roído o por meteorización subaérea, pierden colágeno mucho más rápidamente que las regiones no agrietadas (Boaks et al. 2014; Trueman et al. 2004).

Los parámetros diseñados para medir la diagénesis del colágeno óseo en muestras arqueológicas evalúan la cantidad remanente en el hueso y su calidad. En cuanto a la cantidad, se mide en términos porcentuales respecto al contenido original (en peso). Una muestra se considera aceptable para datación por radiocarbono o análisis isotópico siempre que tenga una cantidad de colágeno mayor que ~2 %-5 % de la cantidad original (Ambrose 1990; Hedges y Van Klinken 1992). Sin embargo, la mayoría de los laboratorios de análisis isotópicos establecen un límite de rechazo inferior al 1 % (Vitale et al. 2019). En cuanto a la calidad del colágeno, el parámetro más utilizado (aunque no el único, ya que también se utilizan el %C y el %N) es la relación atómica C/N (C/N_atómica), que es útil como indicador de contaminación y/o degradación de la proteína.

DeNiro (1985) encontró que, en hueso fresco, la C/N_atómica variaba entre 2,9 y 3,6. A partir de entonces, se adoptó este rango como el adecuado para considerar una muestra de colágeno como aceptable para datación radiocarbónica y, sobre todo, estudios paleodietarios. Sin embargo, Van Klinken (1999) considera que este rango es demasiado amplio y propone -también sobre bases empíricas, pero con un número mucho mayor de casos- uno más restringido, situado entre 3,1 y 3,5. Más recientemente, Guiry y Szpak (2021) plantearon, basándose en modelos de simulación, un límite superior de aceptabilidad variable, dependiendo del taxón y del valor de d¹³C medido en la muestra de colágeno. Finalmente, un estudio teórico de Schwarcz y Nahal (2021) sostiene que 3,243 sería el valor de la C/N_atómica genéticamente determinada (calculada a partir de la suma de la C/N_atómica de cada uno de los aminoácidos que componen cada una de las tres cadenas polipeptídicas que forman la triple hélice del colágeno). Valores por debajo del límite inferior establecido por DeNiro (1985) se deberían a una pérdida selectiva de aminoácidos distintos de la glicina (que ocupa una posición más interna dentro de la estructura tridimensional de la proteína y, por tanto, está menos expuesta a los factores del suelo), mientras que valores por encima del límite superior indicado por DeNiro (1985) se deberían a contaminación con sustancias húmicas, que generalmente tienen un bajo contenido de N (Schwarcz y Nahal 2021) (figura 2).

Figura 2 Fuente: elaboración propia.

Las alternativas a los análisis de abundancia elemental para evaluar la calidad del colágeno en huesos arqueológicos y paleontológicos se basan en el uso de técnicas de espectroscopia vibratoria. Estas consisten en el análisis de propiedades moleculares a partir de la captura de vibraciones a nivel molecular. La espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR, por su sigla en inglés) y la espectroscopia Raman son los dos tipos de espectroscopia vibratoria adecuados para caracterizar la composición del tejido óseo. Ambas técnicas miden, para generar espectros, cambios en las energías vibratorias de los enlaces intramoleculares excitados por la luz incidente. Son técnicas complementarias, en el sentido de que excitan diferentes vibraciones de una misma molécula (Taylor y Donnelly 2020). Se ha planteado su uso como herramientas mínimamente invasivas, rápidas y eficientes para hacer un filtrado o selección a relativamente bajo costo de las muestras, antes de la realización de procedimientos de extracción de colágeno (Hollund 2013; Vitale et al. 2019).

Los cristales de bioapatita son termodinámicamente inestables y se mantienen mediante el proceso homeostático del cuerpo; una vez que este cesa, los cristales pueden cambiar. Su pequeño tamaño (16-50 nm × 8-20 nm × 2 nm [Glimcher 2006]) implica que tienen una superficie muy grande en relación con su volumen, propiedad que los hace muy reactivos, lo que determina el tipo de modificaciones diagenéticas que pueden experimentar en entornos de depositación o enterramiento (Kendall et al. 2018; Smith 2002).

En el individuo vivo, el tamaño, la forma y la composición de los cristales de bioapatita se ven afectados por varios factores intrínsecos y extrínsecos, incluidas las propiedades del colágeno y la distribución de PNC (v. g., la osteocalcina) -que intervienen en el nucleamiento y en el crecimiento de los cristales-, la dieta, las enfermedades, la viabilidad celular y el recambio óseo (Boskey 2007). En los huesos arqueológicos, los cambios más significativos en el mineral son tres: a) disolución preferencial de las fases más inestables, b) aumento de la cristalinidad a través de la recristalización de las fases inestables y/o el crecimiento de nuevas fases autigénicas (modificadas químicamente), y c) absorción de iones exógenos (cationes metálicos) (Smith 2002; Trueman 2013). Estos cambios se producen como consecuencia de su interacción con factores ambientales, principalmente el agua. Los efectos del agua sobre el hueso dependen de su química (pH, iones disueltos) y del régimen hidrológico que prevalece en el sitio (Hedges y Millard 1995). De hecho, los cambios minerales requieren una hidrología activa (recarga con aguas meteóricas) o una reducción del pH (Hedges 2002; Hedges y Millard 1995; Nielsen-Marsh et al. 2000). La hidroxiapatita tiende a ser más estable bajo valores de pH de ~7,5-8; en ambientes ligeramente alcalinos o casi neutros, tiene baja solubilidad, y se disuelve o se recristaliza en entornos con un pH inferior a 6 o superior a 9 (Berna et al. 2004; Keenan y Engel 2017).

La recristalización ósea aumenta la cristalinidad, es decir, el tamaño del cristal y la perfección de la red cristalina, y promueve la formación de una fase mineral más estable y autigénica, caracterizada por un menor contenido de carbonato, ya que los cristales iniciales -más desordenados- son menos estables energéticamente (Nielsen-Marsh y Hedges 2000; Stathopoulou et al. 2008; Trueman 2013). Un factor que altera la cristalinidad, además de producir la disolución y recristalización de los minerales, es la bioerosión microbiana, principalmente bacteriana (Turner-Walker et al. 2002). Para acceder al colágeno, las bacterias primero deben alterar el mineral óseo (Nielsen-Marsh et al. 2000), por lo que su actividad puede conducir a la disolución del mineral, seguida de una redistribución del fosfato, necesaria para el crecimiento de nuevos cristales (Trueman et al. 2004). La pérdida de proteínas debido a los procesos mencionados en el apartado anterior también puede influir en la cristalinidad (Nielsen-Marsh y Hedges 2000; Smith et al. 2007), ya que la pérdida de matriz orgánica en los tejidos mineralizados puede exponer algunas fracciones minerales poco cristalinas al agua que fluye por el hueso. Esto permite la lixiviación y reprecipitación sobre los cristales preexistentes y dentro de los poros. Esta interacción del agua subterránea con la capa hidratada de cristales de bioapatita permite la incorporación de diversos iones lábiles y reactivos -v. g., HPO₄ ^2ˉ, PO₄ ^3ˉ, CO₃ ^2ˉ, Ca²⁺, Mg²⁺- (Stathopoulou et al. 2008; White y Hannus 1983).

Los cambios en la cristalinidad se han analizado, en muestras de hueso en polvo, mediante el estudio del patrón de difracción de rayos X (DRX), ya sea a través de difractogramas (v. g. Urquiza 2016) o del cálculo de un índice de cristalinidad (IC) (v. g. Hedges et al. 1995). Asimismo, se ha utilizado espectroscopia Raman (v. g. Colonese et al. 2014). Sin embargo, la técnica más empleada es el cálculo del factor de desdoblamiento infrarrojo (IRSF, por su sigla en inglés), una medida indirecta del largo medio de los cristales. Este factor se deriva de espectros FTIR (Weiner y Bar-Yosef 1990). La ventaja de esta técnica es que permite la identificación de otras fases minerales, como la calcita diagenética, y también la evaluación semicuantitativa de la relación carbonato/fosfato (Smith 2002); además, es rápida y se puede implementar en el terreno utilizando pequeños tamaños de muestra (Trueman et al. 2008). Aunque en general los espectros FTIR proporcionan una buena indicación del contenido orgánico y de la recristalización de la apatita del hueso, existen evidencias de que no son indicadores confiables del grado de conservación de elementos traza biogénicos o de las relaciones de isótopos estables originales, sobre todo en huesos muy antiguos (Trueman et al. 2008).

Después de la muerte de un organismo, la porosidad del hueso puede aumentar o disminuir. Si disminuye, la probabilidad de supervivencia del hueso se incrementa con la permineralización (i. e. precipitación de minerales -sulfatos, sulfuros, silicatos, óxidos de hierro, fosfatos y carbonatos- en los poros y oquedades del hueso [Fernández López 2000]), que conduce gradualmente a la fosilización y conservación del espécimen en un depósito arqueológico. Si, por el contrario, la porosidad aumenta, las perspectivas de supervivencia del espécimen disminuyen sensiblemente a medida que el agua fluye cada vez más libremente a través del hueso, de modo que puede hacerlo desaparecer por completo (Kendall et al. 2019; Smith 2002; Smith et al. 2007). La modulación de la tasa de destrucción del hueso a través del aumento de la porosidad depende de factores ambientales, tanto físicos (v. g., nivel de aireación del suelo, temperatura, pH, hidrología local) como biológicos (v. g., actividad microbiana).

Diversos estudios comparativos efectuados sobre huesos arqueológicos y modernos han demostrado que las variaciones en el tamaño de los poros pueden asociarse con procesos diagenéticos específicos⁶. De este modo, se han definido tres tipos de porosidad: a) porosidad grande o macroporosidad (> 8,5 µm), vinculada con una pérdida considerable de mineral óseo; b) porosidad media o mesoporosidad (entre 0,1 µm y 8,5 µm), relacionada con el ataque microbiano, y c) porosidad pequeña o microporosidad (< 0,1 µm), atribuida a la degradación química de las fibrillas de colágeno a través de mecanismos como la hidrólisis acelerada del colágeno inducida, ya sea por el calor ambiental (Smith et al. 2007; Turner-Walker et al. 2002) o por el hervido de los huesos previo a su depositación (Roberts et al. 2002) (figura 3). Por este motivo, la distribución por tamaño de la porosidad, medida mediante la técnica denominada porosimetría por intrusión de mercurio, se considera el mejor indicador del estado general de preservación del hueso (Nielsen-Marsh 1997; Nielsen-Marsh et al. 2000) y, por ello, un adecuado predictor de su capacidad de supervivencia en su respectivo ambiente de enterramiento. Antes de que esta técnica fuera utilizada, la distribución por tamaño de la porosidad se medía mediante porosimetría por adsorción de vapor de agua, una metodología similar a la que se emplea para medir la porosidad en suelos (Marshall y Holmes 1988)⁷. Esta técnica no permite evaluar la porosidad mediana o mesoporosidad (Nielsen-Marsh y Hedges 1999), por lo que ha sido prácticamente abandonada en estudios sobre diagénesis ósea, aunque existen ejemplos de aplicación reciente (v. g. Rodríguez et al. 2024).

Figura 3 Fuente: modificado por los autores a partir de Galligani (2020). * Como referencia, se indica la distribución de la porosidad en un hueso in vivo: PV, PLC y PCA (Cardoso et al. 2016).

Estudios realizados en Europa indican que la cantidad de vías diagenéticas es notoriamente reducida, no específica de ningún sitio en particular, y solo cuatro de ellas pueden identificarse claramente: a) buena conservación: huesos tipo 1; b) hidrólisis acelerada del colágeno: huesos tipo 2; c) ataque microbiano: huesos tipo 3, y d) disolución catastrófica: huesos tipo 4 (Hedges et al. 1995, 208; Smith et al. 2007, 1489) (figura 4).

Figura 4 Fuente: esquema elaborado por los autores.

Con la excepción de la hidrólisis acelerada del colágeno, que se debe a circunstancias muy particulares -i. e. eventos de alta temperatura, suelos alcalinos y ciclos extremos de humectación y secado de los huesos- (Smith et al. 2002), la disolución catastrófica y el ataque microbiano son fenómenos relativamente frecuentes que, de manera eventual, pueden vincularse entre sí (Smith et al. 2007). El principal aspecto en común entre estas dos formas de diagénesis es el aumento de la mesoporosidad (Turner-Walker et al. 2002). En el caso de los huesos atacados por microorganismos en ambientes terrestres -particularmente bacterias (Turner-Waker 2012 y 2019; Turner-Walker et al. 2023)⁸-, este aumento de la porosidad intermedia permite una mayor interacción con el agua del suelo -principalmente bajo regímenes hidrológicos de recarga y flujo (sensuHedges y Millard 1995)- y, por tanto, una aceleración de la disolución mineral. A su vez, la disolución aumenta la porosidad del hueso y, cuanto mayor es esta, mayor es la velocidad de disolución, lo que lleva a una pérdida catastrófica del mineral (Pike et al. 2001).

La química del suelo, por su parte, afectaría de manera significativa solo a la pérdida mineral o disolución mineral catastrófica (Nielsen-Marsh et al. 2007), mientras que su textura y permeabilidad afectarían los niveles de actividad de la microflora bacteriana aeróbica, que es mayor en suelos bien drenados y aireados y menor, o inexistente, en condiciones de encharcamiento permanente o semipermanente -con alta probabilidad, las bacterias capaces de producir bioerosión en el hueso, bajo condiciones naturales, son solo aeróbicas (Kendall et al. 2018; Schotsmans et al. 2024; Turner-Walker 2012 y 2019; Turner-Walker et al. 2023)-. Las interacciones entre los diferentes factores mencionados, así como los tipos de hueso resultantes, se pueden visualizar en la figura 5.

Figura 5 Fuente: elaborado por los autores a partir de Galligani (2020) y Morales (2022).