2023
723
23012023
06022024
Aída Inés Moreno Santamaría aiimorenosa@unal.edu.co
Universidad Nacional de Colombia, Colombia
Sebastián Reynaldi sreynaldi@unal.edu.co
Universidad Nacional de Colombia, Colombia
Resumen: El protista Spongospora subterranea es el patógeno del suelo causante de la sarna polvosa de la papa. Es un parásito obligado que se reproduce en raíces y tubérculos, donde produce grupos de zoosporas enquistadas, quistosoros, los cuales pasan al suelo para generar un nuevo ciclo infectivo. La prevención de esta enfermedad requiere identificar y cuantificar los quistosoros del suelo. Con el propósito de automatizar el proceso, fotografiamos digitalmente quistosoros de diferentes cultivos bajo las mismas condiciones, y caracterizamos su tamaño y forma como área y circularidad con análisis de imágenes. El rango de área fue 1086- 2247 µm2 y el de circularidad fue 0.824-0.886. Con estos rangos analizamos un número creciente fotografías digitales (1-90) de un mismo suelo con quistosoros (infectado) y sin ellos (control), utilizando una rutina macro. El número de identificaciones resultó lineal, positiva y significativamente (p<0.001) correlacionado con el número de fotografías analizadas tanto en el suelo infectado (r2=0.996, y=1.679x) como en el control (r2=0.968, y=0.367x). Las identificaciones en el suelo control infectado fueron cinco veces menores y fueron sustraídas a las identificaciones del suelo infectado para cada número de fotografías analizadas. Esta sustracción resultó lineal (y=1.048x), positiva (r2=0.979) y significativamente (p<0.001) correlacionada con el promedio de quistosoros cuantificados visualmente en las mismas fotografías. Los resultados muestran que los quistosoros del suelo pueden ser cuantificados por análisis de imágenes. La automatización independiza la precisión de la cuantificación de la experiencia y habilidad de la persona que la realiza.
Palabras clave: Cuantificación automática, estructuras de resistencia, patógeno del suelo, papa, sarna polvosa.
Abstract: The protist Spongospora subterranea is the soil-borne pathogen that causes the powdery scab of potatoes. This obligate parasite reproduces in roots and tubers, producing clusters of encysted zoospores or cystosori. These cystosori move to the soil and generate a new infective cycle. The prevention of this disease requires identifying and quantifying cystosori in the soil. In this study, cystosori from different crops were digitally photographed under the same conditions, to automate the process. The images were then analyzed to characterize their size and shape in terms of area and circularity. The ranges of the area and circularity were 1086-2247 µm2 and 0.824-0.886, respectively. With these ranges, an increasing number of digital photographs (1-90) of the same soil with cystosori (infected) and without cystosori (control) were analyzed using a macro routine to automate the process. The number of identifications per photograph was linearly, positively, and significantly (p<0.001) correlated with the number of photographs analyzed in both the infected (r2=0.996, y=1.679x) and control (r2=0.968, y=0.367x) soils. However, the number of identifications was five times higher in the infected soil. The identifications of the control soil were subtracted from those of the infected soil for each number of photographs analyzed. This subtraction was linear (y=1.048x), positive (r2=0.979), and significantly correlated (p<0.001) with the average number of cystosori visually quantified in the same photographs. The results show that it is possible to quantify soil cystosori using image analysis. Automatization makes quantification accuracy independent of the operator´s experience and skill.
Keywords: Automated quantification, potato, powdery scab, resistance structure, soil pathogen.
Articles
Cuantificación por análisis de imágenes de quistosoros de Spongospora subterranea en suelo
Quantification of Spongospora subterranea by cystosori image analysis in soil
Aída Inés Moreno Santamaría aiimorenosa@unal.edu.co
Sebastián Reynaldi sreynaldi@unal.edu.co
Received: 23 January 2023
Accepted: 06 February 2024
El protista Spongospora subterranea f. sp. Subterránea (Wallr.) Lagerh. 1892 es el patógeno del suelo causante de la sarna polvosa de la papa (Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura [FAO], Grupo Técnico Intergubernamental del Suelo [ITPS], Iniciativa Global sobre la Biodiversidad del Suelo [GSBI], Convenio sobre la Diversidad Biológica [CDB] y Comisión Europea [CE], 2021). Esta enfermedad afecta cosméticamente los tubérculos de papa (Balendres et al., 2016) y reduce su producción (Gilchrist-Ramelli et al., 2009; Gilchrist-Ramelli et al., 2011 y Falloon et al., 2016). S. subterranea es un parásito obligado que se reproduce en raíces y tubérculos. La reproducción resulta en conjuntos de zoosporas enquistadas llamados quistosoros, los cuales permanecen latentes en el suelo hasta tomar contacto con el agua (Beltrán-Sánchez et al., 2009; Balendres et al., 2017). S. subterranea es un patógeno del suelo porque sus zoosporas activas son reconocidas por nadar con sus dos flagelos (Beltrán-Sánchez et al., 2009), lo cual sugiere que las esporas activas nadan hasta encontrar raíces y tubérculos donde comenzar un nuevo ciclo infectivo.
La sarna polvosa es una enfermedad que requiere de varias estrategias para ser superada, entre las más importantes está la prevención: cultivar papa en suelos bien drenados y libres de quistosoros de S. subterranea (Mesa et al., 2017; Strydom et al., 2024). Para poder escoger suelos libres de S. subterranea es necesario identificar y cuantificar los quistosoros de los suelos destinados para el cultivo de papa.
Los quistosoros de S. subterranea, como toda estructura biológica, presentan variabilidad en su morfología, esto condiciona su identificación a la experiencia y habilidad del operador (National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine [NASEM], 2019). Independizar la presión, la identificación y cuantificación de la persona que las realiza requiere encontrar características que permitan automatizar el proceso por análisis de imágenes (Schroeder et al., 2021). La cuantificación automática de los quistosoros permitiría comparar trabajos de diferentes autores y realizar una evaluación de los suelos de cultivo a gran escala.
Así, el objetivo es este trabajo fue identificar y cuantificar automáticamente quistosoros en fotografías digitales.
Los quistosoros de S. subterranea tienen una forma esferoide o ligeramente ovoide al microscopio electrónico (Beltrán-Sánchez et al., 2009). Al microscopio óptico, con un aumento de 10x, los quistosoros tienen la forma de una elipse con un radio mayor de entre 20 y 31.1 µm y un radio menor de entre 15.5 y 24.9 µm (Jaramillo-Villegas et al.,2008 y Falloon et al., 2011). Este tamaño y esta forma han sido utilizados para reconocer y cuantificar los quistosoros visualmente bajo el microscopio óptico con un aumento de 10x (Pérez-Pérez et al., 2012) y podrían resultar viables para identificar quistosoros.
El programa ImageJ fue creado para analizar imágenes de estructuras biológicas, es público y de uso gratuito para investigación (Schneider et al., 2012); ImageJ transforma las fotografías digitales a un formato que polariza la escala de grises (Gallagher, 2014). Sobre este formato se pueden caracterizar el área y la circularidad de las estructuras biológicas, para luego identificarlas y cuantificarlas automáticamente utilizando una rutina macro (Ferreira y Rasband, 2012). Esta rutina fue evaluada en suelo con y sin quistosoros para analizar la sensibilidad y selectividad de la cuantificación automática, la cual fue finalmente comparada con el conteo visual.
Las suspensiones de quistosoros fueron realizadas según Pérez-Pérez et al. (2012), utilizando quistosoros obtenidos de raíces de papa Solanum tuberosum infectadas con Spongospora subterranea en diferentes cultivos. Las raíces infectadas fueron deshidratadas durante 15 días en desecador, para luego ser mezcladas con 1 l de agua de red y maceradas en una licuadora de cocina hasta lograr una suspensión de aspecto homogéneo. Esta suspensión fue guardada para caracterizar los rangos de área, la circularidad de los quistosoros y para luego mezclarla con suelo.
Se recolectó suelo de un lote donde nunca se cultivó papa. El suelo recolectado fue secado en un horno a 60 °C durante 30 horas y triturado con un rodillo de madera para homogenizarlo. Finalmente, 300 gr. del suelo seco y homogenizado se mezclaron con un 1 mL de la suspensión de quistosoros para formar el suelo infectado, o con un 1 mL de agua de red para formar el suelo control. Ambos suelos se tamizaron mecánicamente (Rotav, WS Tyler, EE. UU.), utilizando sucesivamente mallas de 500, 250 y 53 µm de poro. El tamizado comenzó con el suelo control para evitar contaminación. Los tamizados de la malla de 53 µm fueron almacenados por separado en desecador. Al momento del análisis, se prepararon suspensiones mezclando un gramo del tamizado de cada tipo de suelo con 10 mL de agua de red en tubos plásticos de 15 mL con tapa hermética.
Alícuotas de 20 µL de cada una de las suspensiones fueron colocadas en una cámara de Neubauer. Antes de tomar las alícuotas, cada tubo se giró 180° en tres oportunidades para homogenizar la suspensión. Una vez colocada la alícuota en la cámara de Neubauer, los cuadrados grandes de la cámara fueron fotografiados con un objetivo (10x) de un microscopio óptico (Eclipse E200, Nikon, Japón) equipado con cámara digital (Digital Sight DS-Fi1, Nikon, Japón). Se tomaron en total 90 fotografías de cada suspensión.
Las fotografías digitales fueron analizadas mediante el programa ImageJ (Schneider et al., 2012), siguiendo su manual (Ferreira y Rasband, 2012). Primero, se fijó la escala de conversión de píxeles a µm con el comando Set Scale, y se utilizaron los píxeles correspondientes a los 250 µm que miden los lados de los cuadrados grandes de la cámara de Neubauer. La escala resultante fue 1.045 píxeles por µm.
Segundo, se caracterizó el área y la circularidad de 81 quistosoros extraídos de las raíces de papa infectadas. Las fotografías en formato jpg que muestra la Figura 1A se pasaron a un formato 8-bit con el comando Type (Figura 1B). El formato 8-bit contrasta los objetos en la fotografía con una escala de 255 grises, las estructuras cercanas al negro (255) contrastan contra el blanco (0) del fondo (Ferreira y Rasband, 2012). Este contraste de grises se polarizó en una imagen blanco y negro con el comando Auto (Figura 1C). La identificación de cada quistosoro se realizó con el comando Wand Tool. El comando Measure midió automáticamente el área y la circularidad de cada quistosoro identificado (Figura 1D). Este comando también reporta los valores de área y circularidad medidas en una planilla de cálculo. Los rangos de área y circularidad se determinaron con el mayor y menor valor de estas variables. Estos rangos se graficaron en diagramas de cajas y bigotes, e histogramas, utilizando una rutina en lenguaje R (https://www.r-project.org/).
Finalmente, se generó una rutina macro utilizando el comando Record. La rutina automatizó el uso de los comandos descritos arriba, a los cuales se les sumó Analyze particle, que realizó automáticamente las identificaciones utilizando los rangos de área y la circularidad.
El comando Macro aplicó la rutina de análisis de imágenes a las fotografías digitales de las suspensiones de suelo con y sin quistosoros.
El número de identificaciones realizadas automáticamente con la rutina se correlacionaron con el número de fotografías digitales utilizando una rutina en lenguaje R.
Se realizaron conteos visuales, de acuerdo con Pérez-Pérez et al. (2012), en las mismas fotografías en las cuales se realizó el análisis de imágenes con la rutina de ImageJ arriba descrita. Se realizaron tres conteos independientes de cada fotografía. El promedio de estos conteos se correlacionó con las identificaciones realizadas por la rutina de análisis de imágenes en el suelo infectado, luego de sustraer las identificaciones realizadas en el suelo control. Esta correlación también se realizó utilizando una rutina en lenguaje R.
El menor valor de área de los quistosoros fue 1086 µm2 y el mayor valor fue 2247 µm2 (Tabla 1), determinado el rango de área que se utilizó en la rutina de análisis de imágenes. La mediana del área resultó 25.5 % mayor que el menor valor y un 11 % mayor que el primer cuartil (Tabla 1). También, la mediana resultó un 14 % menor al tercer cuartil y un 35 % menor al mayor valor (Tabla 1). El diagrama de caja y bigotes muestra que la mayoría de los quistosoros fueron menores a 1750 µm2 (Figura 2A). El histograma de 30 intervalos muestra que la mayoría de los quistosoros se concentra en los 15 menores intervalos. Los quistosoros con un área mayor a 2000 µm2 fueron los más escasos (Figura 2B).
El menor valor de circularidad de los quistosoros fue 0.824 y el mayor valor fue 0.886 (Tabla 1), determinando el rango de circularidad que se utilizó para identificar los quistosoros. La mediana de circularidad resultó un 3.4 % mayor que el menor valor y un 1.3 % mayor que el primer cuartil (Tabla 1). También, la mediana resultó un 1 % menor que al tercer cuartil y un 3.7 % menor al mayor valor (Tabla 1). El diagrama de caja y bigotes muestra que la mayoría de los quistosoros resultaron con una circularidad dentro del intervalo comprendido por 0.84 y 0.86 (Figura 2C). El histograma muestra que los intervalos intermedios resultaron con el mayor número de quistosoros, la mayoría de los quistosoros tuvo un valor de circularidad similar (Figura 2D).
Los rangos de área y circularidad se utilizaron en una rutina en ImageJ para realizar identificaciones automáticas. Las identificaciones resultaron positiva y significativamente (p<0.001) correlacionadas con el incremento de las fotografías digitales analizadas tanto en el suelo infectado como en el suelo control (Figura 3A). Las ecuaciones de regresión lineal están representadas en los gráficos con la línea puntuada (Figura 3), su pendiente fue 4.57 veces mayor para el suelo infectado con respecto al suelo control (Figura 3A). En total, se realizaron 149 identificaciones en el suelo infectado y 31 identificaciones en el suelo control.
Las identificaciones en el suelo control fueron sustraídas de las identificaciones en el suelo infectado para cada número de fotografías analizadas. El resultado de estas sustracciones resultó lineal, positiva y significativamente (p<0.001) correlacionado con el promedio de las identificaciones de un conteo visual para cada número de fotografías analizadas (Figura 3B).
El análisis de imágenes pudo identificar quistosoros y cuantificarlos en el suelo infectado. El análisis de imágenes es automático, el cual supera los problemas de reproducibilidad o precisión de la cuantificación visual (NASEM, 2019). La independencia del operador permitiría comparar cuantificaciones reportadas por diferentes autores, aunque la necesidad de un suelo control puede limitar la aplicación generalizada del método de análisis de imágenes. Esta necesidad se debe a la exigencia de estructuras en el suelo con un tamaño y forma similares a los quistosoros caracterizados (Figura 3).
La caracterización de los quistosoros se realizó mediante el tamaño y la forma, las cuales, en el programa ImageJ, se analizan como área y circularidad (Ferreira y Rasband, 2012). La literatura reporta radios de quistosoros recolectados en cultivos en Colombia (Jaramillo-Villegas et al., 2008) y a lo largo del mundo (Falloon et al., 2011). Estos radios permiten calcular el área utilizando la fórmula del área de la elipse, la cual multiplica el radio mayor por el radio menor y por π (https://en.wikipedia.org/wiki/Area). El rango de área resultante (1048-2412 µm2) contiene, para Falloon et al. (2011), el rango de Jaramillo-Villegas et al. (2008) y el medido en el presente trabajo (Tabla 1).
La circularidad resulta de multiplicar el área por 4π, y dividir el resultado de esta multiplicación por el cuadrado del perímetro. El valor uno de circularidad corresponde a un círculo y el 0.5 a un rectángulo, la forma elíptica se encuentra en el medio de este intervalo (Ferreira y Rasband, 2012). En el presente trabajo, la circularidad de los quistosoros resultó entre 0.82 y 0.89 (Figura 2), una forma elíptica más cercana al círculo que al rectángulo. La forma circular elíptica ha sido previamente reportada por Jaramillo- Villegas et al. (2008), Beltrán-Sánchez et al. (2009) y Falloon et al. (2011).
La bibliografía también menciona un color ocre característico de los quistosoros (Falloon et al., 2011). Sin embargo, en el presente trabajo, estructuras con el área y circularidad caracterizada para quistosoros presentaron una tonalidad oscura, y, por el contrario, estructuras de color ocre no presentaban el área, ni la circularidad de los quistosoros (Figura 1). Estas observaciones se realizaron con quistosoros en muestras de suelo, donde el color de los quistosoros es difícil de distinguir.
El análisis de imágenes realizó identificaciones en el suelo control porque existen estructuras de área y circularidad contenidas en los rangos caracterizados para los quistosoros (Tabla 1). Estas identificaciones no parecen ser el resultado de una contaminación, porque su sustracción se correlacionó con el conteo visual (Figura 3B). Además, a diferencia de los quistosoros, las estructuras del suelo control no presentaron las formas esféricas más extremas, particularmente las cercanas al círculo (Figura 4A y C).
La circularidad de los quistosoros presentó un rango proporcionalmente mucho más estrecho que el presentado por el área (Tabla 1 y Figura 2), esto sugiere que la mayoría de los quistosoros tienen una forma elíptica similar, siendo una forma más característica que el tamaño. Sin embargo, la Figura 4 muestra que los rangos de área y circularidad de las estructuras del suelo control están contenidas por los rangos de los quistosoros, aun en las de circularidad, esto indica que no se pueden refinar los rangos sin perder capacidad de detección.
Las estructuras del suelo con tamaño y forma similar a los quistosoros parecen estar presentes en el suelo en una baja proporción porque se incrementaron con el aumento de fotografías analizadas con una tasa 4.57 veces menor que la de los quistosoros (Figura 3A), esto indica que su influencia en las cuantificaciones disminuye con el aumento de los quistosoros en el suelo. El suelo control es realmente útil para evaluar suelos con bajas concentraciones de quistosoros.
La necesidad de suelo control a bajas concentraciones de quistosoros se podría evitar procesando las muestras antes de realizar las fotografías digitales, buscando separar las estructuras en el suelo control y los quistosoros. Las diferencias de densidad podrían ofrecer una alternativa, aunque no se podría utilizar el tiempo que tarda la suspensión en precipitar, ya que podríamos perder quistosoros por la activación de las zoosporas que los forman (Beltrán-Sánchez et al., 2009). Alternativamente, se podría evitar invertir el tubo con la suspensión de suelo; las estructuras con densidad similar a la del agua tenderían a permanecer en suspensión independientemente de la inversión del tubo. También se podrían centrifugar las muestras a diferentes intensidades y analizar los precipitados.
Futuros trabajos deberían investigar si las estructuras observadas en el control están asociadas al tipo de suelo utilizado, para esto se deben cuantificar los quistosoros en distintos tipos de suelos por análisis de imágenes.
La caracterización de los quistosoros por área y circularidad coincidió con los datos de la literatura. La rutina de análisis de imágenes realizada con los rangos de área y circularidad fue sensible para identificar quistosoros en suelo. Sin embargo, existen estructuras en el suelo con área y circularidad similares a los quistosoros. Esto se pudo solucionar sustrayendo las identificaciones del suelo control a las identificaciones del suelo infestado. El resultado fue óptimo, mostrando que el análisis de imágenes es capaz de cuantificar quistosoros del suelo. Esto es muy relevante porque independiza la precisión de las cuantificaciones de la experiencia y habilidad del operador, lo cual permitiría en un futuro comparar las cuantificaciones de diferentes autores con un alto grado de confianza; sin embargo, la necesidad de suelo control puede limitar la aplicación de este método. Futuros trabajos deberán enfocarse en aumentar la especificidad de la metodología para posibilitar su aplicación aun a muestras que carezcan de suelo control.
