Introducción

Guazuma crinita Mart., conocida como bolaina blanca, es una especie forestal nativa de Ucayali, Perú, que en las últimas décadas ha ganado relevancia debido a su alta demanda por parte de los productores forestales. Esto se debe a su rápido crecimiento y su notable capacidad de rebrote (Revilla-Chávez et al., 2021). Además, posee un notable potencial para proyectos de reforestación y restauración ecológica (Arévalo-Hernández et al., 2024). La madera de bolina blanca tiene múltiples aplicaciones en diversas industrias, incluyendo la fabricación de diversos utensilios, muebles y parihuelas. También se emplea como materia para la obtención de celulosa para la producción de papel (Tuisima-Coral et al., 2020; Casas et al., 2022).

Generalmente G. crinita se reproduce a través de semillas biológicas, lo que resulta en una alta variabilidad genética producida por la libre reproducción sexual, y dificulta, de esta manera, la transmisión de características especiales de individuos a su descendencia. A esto hay que agregar que este medio de reproducción limita los estudios sobre fisiología y manipulaciones genéticas.

Para aprovechar las características especiales que podrían tener algunos especímenes de esta especie, como, por ejemplo, mayor velocidad de crecimiento en altura e incremento en volumen, la propagación asexual emplea diversos métodos que facilitan la multiplicación de muchas plantas. Dentro de estos métodos se destaca el cultivo in vitro de tejidos vegetales, que consiste en la multiplicación de células, tejidos u órganos de plantas en condiciones controladas (Chen et al., 2016) y a través del cual se puede mejorar el potencial productivo y acelerar el desarrollo fisiológico (Jayusman y Dalimunthe, 2022), así como sentar las bases para futuros programas de mejoramiento genético en plantas leñosas.

El cultivo in vitro es un método útil para favorecer la germinación de semillas libres de patógenos. También se constituye como un método rápido y confiable para la propagación debido a las altas tasas de multiplicación que se puede lograr con pequeños fragmentos vegetales, lo cual garantiza el establecimiento de plantas ex vitro durante todo el año (Micheli et al., 2020; Sakr, 2022).

Sin embargo, el éxito de la germinación in vitro está vinculado a muchos factores; uno de ellos es el tipo de medio de cultivo, ya que su composición desempeña un papel crucial en el desarrollo de las plantas al suministrar sustancias esenciales para el crecimiento de los explantes. El medio de cultivo utilizado con mayor frecuencia es Murashige y Skoog (MS), aunque el Woody Plant Medium (WPM) también ha demostrado ser efectivo para explantes leñosas (Tombion et al., 2023).

Actualmente existen pocos estudios sobre el manejo in vitro de Guazuma crinita. Estos estudios representan avances parciales en diferentes fases, como la asepsia de semillas biológicas, la exploración de diversas fitohormonas para el desarrollo morfogénico (Gonzales-Alvarado et al., 2022), la micropropagación in vitro (Maruyama et al., 1997), la criopreservación (Maruyama, 2002) y el encapsulamiento de brotes in vitro (Maruyama et al., 1997). Sin embargo, estos estudios no han abordado de manera integral la optimización del desarrollo fisiológico utilizando los diferentes medios de cultivo disponibles en el mercado. Nuestra investigación plantea que el uso de los medios de cultivo adecuados podría mejorar significativamente tanto la respuesta germinativa como el desarrollo fisiológico in vitro de Guazuma crinita, estableciendo base sólida para su mejoramiento genético. En este contexto, el presente estudio tuvo como objetivo evaluar la respuesta germinativa y desarrollo fisiológico in vitro de Guazuma crinita a partir de semillas sexuales, con el fin de establecer un método que permita optimizar el tiempo de germinación y el desarrollo fisiológico para contribuir al mejoramiento genético de la especie.

Material y métodos

Lugar de ejecución

La investigación se ejecutó en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos Meristemas de la Universidad Nacional Ucayali, ubicado dentro en el kilómetro 6.200 de la Carretera Federico Basadre, Ucayali, Perú.

Origen y desinfección de semillas

Fueron utilizadas semillas biológicas sanas de plantaciones de G. crinita establecidas por el Centro Internacional de Investigación Agroforestal (ICRAF) dentro de su programa de domesticación participativa de árboles desarrollado en la región Ucayali en la década del 90 y del 2000.

Para la desinfección de las semillas biológicas fue replicado el protocolo desarrollado por Gonzales-Alvarado et al. (2022), el cual se detalla a continuación: 30 minutos de desinfección superficial con 30 g L-1 de Benlate®, 2 % de hipoclorito de sodio (NaClO) durante 10 minutos, 1 minuto en alcohol comercial de 70 % y 5 enjuagadas con agua destilada esterilizada.

Medios de cultivo, tratamientos y variables

Como medios de cultivo se utilizaron las formulaciones de Murashige y Skoog (1962), y Lloyd y McCown (1980) (Murashige y Skoog [MS] y Woody Plant Medium [WPM], respectivamente) a diferentes concentraciones. Se aplicaron 5 tratamientos (tabla 1) que son los siguientes: 100 % MS (T2), 50 % MS (T3), 100 % WPM (T4), 50 % WPM (T5) y el testigo (T1) sin ningún medio de cultivo. En todos los medios de cultivo se agregó 7 g L-1 de agar (PhytoTech) y 30 g L-1 de sacarosa. Así mismo, para cada tratamiento, se ajustó el pH a 5.8.

Para cada unidad experimental 25 mL de medio de cultivo fueron vertidos en frascos de 80 mm x 63 mm. Todos los fueron autoclavados a 121 °C; 1.1 atm durante 20 minutos. Luego fueron retirados y enfriados. En cada frasco se inocularon 4 semillas y luego fueron situados en un ambiente de 23 °C ± 2 °C con 75 % de humedad y fotoperiodo de 16 horas. Cada tratamiento estuvo compuesto por 35 repeticiones; la unidad experimental fue un frasco con 4 semillas.

Las variables analizadas fueron porcentaje de germinación (%G), altura aérea de la plántula (HP) (cm/planta), número de nudos (NN), número de hojas (NH), y masa fresca y masa seca (MF/MS) (mg/planta). Para el cálculo de %G, las semillas se consideraron germinadas únicamente cuando la radícula sobresalía 0.1 cm. Las variables HP, NN y NH se evaluaron 120 días después de la inoculación, mientras que el %G fue evaluado 2 veces por semana, durante 30 días.

Para la determinación de masa fresca (mg/ planta), 10 plántulas fueron retiradas de los frascos y limpiadas, después fueron pesadas en una balanza analítica digital con precisión de 0.1 mg. Para la masa seca (mg/planta), estas mismas plántulas fueron secadas en una estufa a 70 °C por 72 h, y fueron pesadas nuevamente en una balanza analítica de precisión (Gonzales-Alvarado y Cardoso, 2024).

Diseño experimental y análisis de datos

El experimento fue conducido con un diseño completamente al azar (DCA). Los resultados fueron sometidos a análisis de varianza (ANVA) y cuando los resultados dieron diferencias significativas, fueron sometidos a pruebas de comparación de medias con Tukey al 5 % de significancia ( = 0.05). Los datos recopilados de las evaluaciones de las variables y el análisis estadístico fueron procesados en Open Office. Por su parte, el análisis estadístico se realizó en el programa computacional Sistema para Análisis de Variancia (SISVAR 5.6) (Ferreira, 2019). Para determinar las correlaciones, se realizó el análisis de correlación utilizando el coeficiente de correlación de Spearman, con un nivel de significancia del 5 % a partir de las medias, mientras para el PCA se utilizaron todos los datos; para ambos se utilizó el software R Studio.

Resultados

Efecto de los medios de cultivo en el porcentaje de germinación

Durante 30 días de evaluación, el porcentaje de germinación (%G) de semillas de G. crinita fue mayor en el tratamiento T1, con 46.09 %, 55.47 %, 59.38 %, 60.94 %, 61.72 %, 61.72 %, 63.28 %, 63.28 % para las 8 evaluaciones. Por otro lado, el tratamiento T4 mostró un comportamiento similar al T1 en la quinta evaluación (15 días), en la que ambos fueron estadísticamente semejantes (60.94ª; 61.72ª), aunque difirieron con el transcurso del tiempo en las evaluaciones posteriores, como se detalla en la tabla 2.

Todos los tratamientos presentaron una tasa de germinación superior a 50 % (> 50), y el T1 se destacó con un 63.28 % sin la presencia de un medio de cultivo y el T4 (61.7 2%) que tenía WPM al 100 %. Además, se observó estabilidad numérica de la germinación en la penúltima y en la última evaluación (figura 1).

Desarrollo fisiológico

El efecto del medio de cultivo en la altura parte aérea (HP) mostró diferentes respuestas para cada tratamiento. El tratamiento T4 (WPM 100 %) obtuvo el mayor crecimiento (17.59 cm/planta), mientras que el tratamiento T1 mostró el menor crecimiento (5.07 cm/planta) (figura 2A). En cuanto al número de nodos (NN) (figura 2B), los tratamientos T4 y T5 presentaron los valores más altos (5.25 y 4.20 nudos/plantas, respectivamente), mientras T1 obtuvo los valores más bajos (1.93 nudos/plantas). En relación con el número de hojas (NH) (figura 2C), T4 obtuvo mayor número de hojas (6.18 hojas/ plantas), mientras T1 obtuvo los valores más bajos (1.26 hojas/plantas). Por otro lado, los tratamientos T2, T3 y T5 mostraron valores intermedios para todas las variables estudiadas sin diferencias estadísticas entre ellas, excepto para la variable NN, cuyos valores intermedios fueron obtenidos en T2 y T3.

Los resultados de producción de masa fresca y seca (MF y MS) indicaron diferencias entre los tratamientos. El tratamiento T4 mostró mayor valor numérico en MF y MS (192.8 y 24.1 mg/planta, respectivamente), lo cual no difirió estadísticamente con los otros tratamientos. Por otro lado, el tratamiento T1 registró los valores numéricos más bajos de MF y MS para ambas variables (55.6 y 6.9 mg/planta, respectivamente). Mientras tanto, el tratamiento T5 obtuvo valores intermedios (114.8 y 14.4 mg/planta, respectivamente), como se muestra en la figura 3a y b.

Producción de masa fresca y seca, correlación y PCA de las variables

Los resultados de producción de masa fresca y seca (MF y MS) indicaron diferencias entre los tratamientos (figura 3a y b). El tratamiento T4 mostró los mayores valores numéricos en MF y MS, con 192.8 mg/planta y 24.1 mg/planta, respectivamente. Por otro lado, el tratamiento T1 registró los valores numéricos más bajos de MF y MS para ambas variables (55.6 y 6.9 mg/planta, respectivamente). Mientras tanto, el tratamiento T5 obtuvo valores intermedios (114.8 y 14.4 mg/planta, respectivamente), como se muestra en la figura 3a y b.

El análisis de correlación identificó 10 correlaciones, todas positivas. 9 correlaciones mostraron valores iguales o superiores a 0.90. Específicamente, las variables HP y MF; HP y MS; MF y MS presentaron valor absoluto de correlación de 1 ***, lo que indica una correlación perfecta entre ellas (figura 4). Por su parte, el análisis del PCA reveló distintos agrupamientos para cada uno de los tratamientos, con 94.4 % de la variación explicada por la primera dimensión (figura 5).

Discusión

En este estudio, los resultados obtenidos del efecto de los medios de cultivo en la germinación demostraron que el tratamiento T1, compuesto de agar, logró mayor porcentaje de germinación (63.28 %). Estos resultados son similares a los reportados por Gonzales-Alvarado et al. (2022), quienes obtuvieron un 72.55 % de germinación utilizando el agente gelificante Fitogel; la utilización de agentes gelificantes facilita la disponibilidad de agua libre (Al-Mayahi y Ali, 2021). Por otra parte, se observó que los tratamientos compuestos por diferentes medios de cultivo en diferentes concentraciones presentaron menores porcentajes de germinación debido a la presencia de sales, lo que genera disminución del potencial hídrico y osmótico del sustrato, y ocasiona que la semilla pierda agua o, en todo caso, demore más tiempo en absorber agua para su germinación (Rodríguez et al., 2014).

En comparación con los tratamientos con MS, los tratamientos con WPM al 100 % y al 50 % obtuvieron los porcentajes más altos de germinación (61.7 2% y 58.62 %, respectivamente). La composición del WPM se caracteriza por tener una baja concentración de sales de NH4+ y NO3-, lo cual lo hace ideal para el cultivo de plantas leñosas (Cassells y Curry, 2001).

Por otro lado, el MS está compuesto por altas concentraciones de iones de amonio, nitrato, cloro y MoO4-, y bajas concentraciones de PO4-, Mg+, Cu++ y Ca; este último es un componente tóxico para especies leñosas (Parada y Villegas, 2009) porque inhibe los procesos metabólicos y enzimáticos, como en el caso de G. crinita (Taiz et al., 2017).

Desarrollo fisiológico

El desarrollo fisiológico está influenciado por la composición de los medios de cultivo (Lantos et al., 2023). En G. crinita, se determinó que la utilización de Woody Plant Medium (WPM) resultó en una mayor altura de planta (HP) (17.59 cm), número de nudos (NN) (5.25 nudos/planta) y número de hojas (NH) (6.18 hojas/plantas). Resultados similares fueron reportados por Rafael (2023) en Bertholletia excelsa, quien obtuvo una altura de 22.5 cm, 2.68 nudos/ planta y 2.1 hojas/plantas con la utilización de WPM. Se considera que WPM es esencial para el cultivo de plantas leñosas (Cassells y Curry, 2021; Nowakowska et al., 2019), ya que se ha observado un potencial regenerativo en diferentes especies (Tar et al., 2018) contrarrestando la sensibilidad a las sales de algunas especies leñosas (Lloyd y McCow, 1980; Hechavarría- Pérez et al., 2023); por esta razón se observó un mayor desarrollo de G. crinita con el uso de WPM al 100 %.

El mejor crecimiento en altura aérea de la planta, número de nudos y hojas obtenidos en el cultivo in vitro de semillas de G. crinita en el medio WPM puede relacionarse con el menor contenido de sales, incluido el nitrógeno, en comparación con el medio de cultivo MS (Nowakowska et al., 2019). Según Parada y Villegas (2009), el medio WPM presenta un 25 % de las cantidades de iones nitrato y amonio comparado con el medio MS. Es importante recordar que el WPM fue originalmente formulado para el cultivo de plantas leñosas (Harry y Thorpe, 1994).

Sin embargo, también se debe considerar que para algunas especies leñosas se obtienen mejores resultados con el medio MS. Según Daffalla et al. (2022), Sir El-Khatim et al. (2022) y Stephen et al. (2023) se obtuvieron mayores valores en la parte aérea (13.51 cm; 9.29 cm; 7.12 cm) con la utilización de MS en Acacia sieberiana, Acacia nubica y Cannabis sativa, respectivamente.

Por otra parte, el hecho de que se obtuvieron mejores resultados con el medio WPM al 100 % que con el medio WPM al 50 %, podría indicar que la concentración de sales y otros compuestos nutritivos presentes en esa concentración son los más adecuados para el desarrollo de las plantas a partir de semillas de G. crinita. El tratamiento basado en agar (T1) demostró menor desarrollo, con una altura aérea de 5.07 cm/ planta. 1.93 nudos/planta y 1.26 hojas/planta. Esta pequeña dimensión conlleva la disminución de las reservas nutricionales con el tiempo, lo que genera estrés en las plantas y, eventualmente, puede llevar su muerte (Gonzales-Alvarado et al., 2022).

Producción de masa fresca y seca, correlación y PCA de las variables

La producción de masa fresca y seca es fundamental porque demuestra la capacidad que tienen los explantes para formar tejido. En esta investigación se encontró que la mayor cantidad de masa fresca y masa seca se produjo con la utilización WPM en un periodo de 120 días, con lo cual se obtuvieron 192.8 mg/planta y 24.1 mg/planta de MF y MS, respectivamente.

Resultados semejantes fueron reportados por Gonzales-Alvarado y Cardoso (2024) en Melaleuca alternifolia, quienes obtuvieron los mayores valores de MF (180 mg/planta) y MS (15 mg/planta) en condiciones ambientales similares a las de esta investigación. Por el contrario, el tratamiento T1 obtuvo los valores más bajos (56 mg/planta; 7 mg/planta) de MF y MS, respectivamente. Este resultado se debe a que este tratamiento no recibió ningún medio de cultivo, el cual actúa como fuente nutricional para el desarrollo vegetal.

Los resultados obtenidos respaldaron nuestra hipótesis, demostrando que el uso de medios de cultivo resultó superior en comparación con el testigo compuesto únicamente por agar. En particular, el medio de cultivo WPM destacó al proporcionar las mejores respuestas fisiológicas. Por otro lado, las plantas germinadas exclusivamente en agar dependieron de las reservas nutricionales de la semilla para su desarrollo. Sin embargo, la falta de nutrientes esenciales en el medio afectó significativamente su crecimiento, lo que se reflejó en una menor MF y MS (55.6 mg/planta y 6.9 mg/planta, respectivamente). Estos resultados coinciden con los reportados por Gonzales-Alvarado et al. (2022).

El análisis de correlación entre las variables identificó correlaciones positivas absolutas (1 ***) entre HP y MF, HP y MS y MF y MS (figura 4). Resultados similares fueron reportados por Gonzales-Alvarado y Cardoso (2024); Sarropoulou et al. (2023)); Bello-Bello et al. (2016) en especies de Melaleuca alternifolia, Cereza y Vanilla planifolia, respectivamente, quienes observaron altas correlaciones positivas entre las variables analizadas. Estos hallazgos subrayan la importancia de la correlación entre la altura de la planta y la masa fresca y la masa seca, la cual refleja el crecimiento y desarrollo saludables de las plantas en medios de cultivos apropiados para esta especie, como es el WPM.

Conclusiones

Se determinó que el agar permite mayor tasa de germinación (63.28 %) y que el WPM favoreció el desarrollo fisiológico de Guazuma crinita, pues alcanzó los valores más altos en todas las variables evaluadas: HP (altura de la planta) 17.59 cm/planta, NN (número de nudos) 5.25 nudos/planta, NH (número de hojas) 6.18 hojas/planta, MF y MS (masa fresca y seca) 192.8 mg/planta y 24.1 mg/planta, respectivamente.

Estos resultados subrayan la relevancia de seleccionar medios de cultivo adecuados para optimizar tanto la germinación como el desarrollo fisiológico de G. crinita. Las principales contribuciones de esta investigación abren nuevas posibilidades para el mejoramiento genético y la propagación in vitro. En investigaciones futuras sería relevante explorar la optimización de otros factores fisiológicos, como el potencial osmótico del medio de cultivo, los azúcares clave para el desarrollo de las plantas, así como la adaptación a diferentes condiciones ambientales. Además, el análisis molecular de las respuestas al estrés en estos medios podría contribuir a mejorar la eficiencia del crecimiento y la capacidad de respuesta de G. crinita ante condiciones adversas.

Agradecimientos

Agradecemos al Fondo de Desarrollo Socioeconómico de Camisea (FOCAM) de la Universidad Nacional de Ucayali por el financiamiento de esta investigación, aprobada mediante la Resolución N° 990-2022-UNU- CU-R. También extendemos nuestro agradecimiento a los colaboradores que participaron en las fases de campo y gabinete, así como a los revisores anónimos por sus valiosas sugerencias para mejorar este manuscrito.

Referencias

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