INTRODUCCION

La preeclampsia constituye una de las causas principales de morbilidad y mortalidad neonatal y materna en todo el mundo. Es un trastorno multifactorial caracterizado por la aparición de hipertensión arterial en la segunda mitad del embarazo (≥20 semanas de gestación), acompañada de proteinuria y disfunción endotelial^1,2,3. Ahora bien, en mujeres con diabetes mellitus pre-gestacional (tipo 1 o tipo 2), el riesgo de sufrir PE se incrementa alrededor de cuatro veces en comparación con las mujeres no diabéticas⁴; igualmente las mujeres con síndrome metabólico también están en alto riesgo de sufrir PE⁵. Se sabe que el síndrome metabólico y diabetes tipo 26 se encuentran asociados a la a resistencia a la insulina; y el embarazo por sí mismo induce resistencia a la insulina, especialmente después de 20 semanas de gestación^7,8. Efectivamente, el embarazo es un estado único caracterizado por resistencia a la insulina fisiológica que se resuelve después del parto9. Sin embargo, los mecanismos responsables de la resistencia a la insulina y su posible asociación con la PE no están aun totalmente esclarecidos.

Recientemente, las investigaciones se han centrado en nuevos potenciales mediadores de la resistencia a la insulina en diabetes mellitus gestacional (DMG), tales como la adipocina: resistina. Las adipocinas tienen efectos sobre la secreción y la acción de la insulina, el gasto energético, la inflamación, la regulación de la adipogénesis y la reproducción¹⁰; y las mismas han sido implicadas en la regulación de la resistencia a la insulina durante el embarazo. El tejido adiposo se considera su fuente principal, pero durante el embarazo también pueden producirse en la placenta. La resistina es secretada por los macrófagos, monocitos y tejido adiposo blanco; reduce la absorción de glucosa de los adipocitos, aumenta la glucosa en plasma y promueve inflamación y resistencia a la insulina¹¹. Durante la diabetes mellitus gestacional, la resistina disminuye la sensibilidad a la insulina y aumenta la resistencia a la insulina^12,13. La placenta también sintetiza y secreta resistina a la circulación materna y contribuye con los niveles circulante de dicha hormona en el embarazo^14,15, lo cual promueve el incremento en la resistencia a la insulina, la disminución de la sensibilidad a la insulina y la hiperglicemia post-prandial que conduce a la diabetes gestacional¹⁴. Aunado a ello, se ha reportado que la insulina estimula la liberación de resistina desde la placenta humana¹⁶, lo que apoya su papel en la inducción de resistencia a la insulina durante el embarazo¹⁶.

Con el fin de establecer la posible correlación entre el incremento de la presión arterial en PE y las alteraciones de los niveles circulantes de resistina, en el presente estudio se determinaron los niveles plasmáticos de esta adipocina en un grupo de mujeres venezolanas embarazadas sanas o con PE. Aunado a ello, se sugiere a la resistina circulante como un posible biomarcador prometedores en la diabetes mellitus gestacional y/o en la mujer preeclámptica.

MATERIALES Y MÉTODOS

Población y Muestra. Reclutamiento y selección de los sujetos

Se realizó un estudio experimental controlado en mujeres embarazadas sanas y en mujeres con preeclampsia que cumplan con los requisitos de inclusión en el estudio. Se seleccionaron aquellas pacientes que acuden al servicio de Ginecología del Hospital Clínico Universitario de Caracas (HUC), Los Chaguaramos, Municipio Libertador, Caracas-Venezuela. Las participantes fueron mujeres embarazadas que acudieron al servicio de obstetricia del HUC en sala de emergencia entre las fechas del mes de Junio del 2014 hasta julio 2015 y, que residen en la ciudad de Caracas.

La población estuvo conformada por 30 mujeres embarazadas comprendida entre: 17 mujeres embarazadas sanas y 13 mujeres embarazadas con preeclampsia, en edades comprendidas entre 17 hasta 40 años y con edades gestacionales entre 28 y 40 semanas o en el último trimestre de embarazo.

Se establecieron como criterios de exclusión: hipertensión crónica, enfermedades autoinmunes, diabetes mellitus tipo 1 y tipo 2, angiopatía, retraso mental, trastornos neurológicos, embarazo múltiple, enfermedad renal crónica, pacientes con índice de masa corporal igual o superior a 30 Kg/m2, infección materna o fetal, y anomalías congénitas del feto. A las pacientes seleccionadas se les realizó un examen físico, medición de la presión arterial con el uso de un esfingomanómetro de mercurio y se les tomó las muestras biológicas.

Todas las voluntarias firmaron y fecharon con anterioridad (antes de la recolección de las muestras biológicas), el consentimiento informado luego de haber leído con detenimiento el mismo, donde un personal entrenado les explicó en forma oral y escrita de manera sencilla en que consiste el estudio y que análisis se realizarán con sus muestras biológicas. Asimismo, las participantes aclararon sus dudas con el investigador que estaba a cargo.

Todos los procedimientos empleados fueron sometidos ante el Comité de Bioética del Hospital Universitario de Caracas, Caracas-Venezuela, y cumplieron con la Declaración de Helsinki para estudios de experimentación con seres humanos (1975 y revisada en 1983).

Muestras Biológicas

Las condiciones pre-analíticas fueron las recomendadas mundialmente para este tipo de valoraciones: Las muestras de sangre se obtuvieron en ayunas de 8-12 horas y sin dieta previa habitual, desde la vena antecubital del brazo (izquierdo o derecho) mediante venipunción directa en la región antecubital con agujas múltiples (Venojet®), utilizando tubos con acelerador de coagulación (Vacutainer®). Inmediatamente, se centrifugaron a 3000 rpm durante 15 minutos. Se separó el plasma para la cuantificación de las concentraciones plasmáticas de las quimocinas y determinación del perfil lipídico. Las alícuotas de plasma se almacenaron a una temperatura de -80°C hasta su posterior análisis.

Determinación de la presión arterial (PA) y de la frecuencia cardíaca (FC)

En posición supina, se determinó la PA sistólica (PAS) y diastólica (PAD) con el uso de un esfingomanómetro de mercurio, que se colocó en el brazo izquierdo. El valor de la presión arterial media (PAM) se calculó mediante la siguiente fórmula: PAM = PAD + 1/3 (PAS-PAD).

Métodos Bioquímicos

Se determinó los valores de glicemia, triglicéridos, colesterol total y c-HDL, por métodos enzimáticos, utilizando el estuche comercial (Stanbio). Los valores de referencia para las variables estudiadas fueron, glicemia: 70–105 mg/dL; colesterol total<200 mg/dL; c-HDL<150mg/dL y triglicéridos>60 mg/dL.

Cuantificación de la excreción urinaria de proteínas totales

Se empleó el método colorimétrico basado en el método de Biuret, en el cual se determina la cantidad de proteínas presentes en la orina mediante la formación de un quelato coloreado, donde ocurre una reacción entre los iones cúpricos y los enlaces peptídicos¹⁷. El método se fundamenta en la co-precipitación de proteínas totales de la muestra, en presencia del reactivo de rojo Ponceau y la adición del ácido tricloroacético. Brevemente, las muestras de orina fueron centrifugadas para eliminar células tubulares y los oxalatos, a 50 µl orina, se le adicionaron 500 µl del reactivo de rojo Ponceau (40 g/L) y ácido tricloroacético (300 g/L). Seguidamente se centrifugó a 12.000 r.p.m., durante 10 minutos. El precipitado formado fue resuspendido mediante la adición de 1,0 mL de hidróxido de sodio (8 g/L) y la concentración de proteínas urinarias se cuantificó espectrofotométricamente a 560 nm. La concentración de proteínas en orina se calculó mediante una curva estándar de albúmina sérica de bovino a concentraciones comprendidas entre 0,125 a 8 mg/mL. Los resultados se expresaron como mg de proteína/100 gramos de peso corporal.

Determinación de la producción de óxido nítrico (ON)

La producción de ON fue determinada colorimétricamente como una medida de la producción de nitratos/nitritos formados. Este ensayo consiste en determinar la acumulación de nitrito (producto final estable de la síntesis de ON) en el sobrenadante mediante la reacción de Griess¹⁸. Para ello, 100μL de plasma fueron colocados en placas de 96 pozos, mezclados con 50μL de sulfanilamida 1% m/v (en ácido fosfórico al 2,5% m/v) e incubados a 4ºC por 10 minutos; seguidamente se agregó 50μL de diclorhidrato de naftiletilendiamina 0,1% m/v, se mezcló e incubó a 4ºC por 10 minutos adicionales para completar la reacción de diazotación. Paralelamente se construyó una curva patrón con nitrato de sodio. Se determinó la densidad óptica a 540 nm y la concentración de nitrato formado fue expresada en µM.

Determinación de adipocinas plasmáticas

Todas las muestras de plasma se evaluaron por duplicado mediante el análisis multiplex de microesferas (Bio-Plex Pro Assays Cytokine, Chemokine and Growth Factors, Life Science Grup, BIORAD). Brevemente, el sistema Bio-Plex. se basa en tres núcleos tecnológicos. El primero constituye una tecnología novedosa que emplea hasta 100 microesferas de poliestireno (5,6μm) o magnéticas (8μm), teñidas fluorescentemente codificadas con un código espectral (Tecnología xMAP), la cual permite la detección simultanea de 100 molélulas diferentes en uno solo de los pozo de la microplaca de 96 pozos. El segundo es un citómetro de flujo con dos rayos láser asociados a un sistema óptico que permite cuantificar las diferentes moléculas unidas a la superficie de las micoesferas. El tercero está constituido por un procesador de señal digital de alta velocidad que manja los datos de fluorescencia con alta eficiencia. Esta técnica permitió estudiar en forma simultánea las cocentraciones circulantes de Péptico C, Grelica, GIP,GLP-1, Glucagón, Insulina, Leptina, PAI-1, Resistina, Visfatina, Adiponectina y Adipsina.

Análisis estadístico

Los datos fueron expresados como la media ± error estándar de la media (E.E.M.). Se evaluó la distribución de los datos mediante las pruebas de normalidad de Shapiro-Wilk, Kolmogorov-Smirnov, Jarque-Bera. Se empleó la t-Student y el análisis de varianza (ANOVA) con análisis post-hoc para comparar los grupos experimentales sujetos a éste estudio. Las correlaciones entre las variables fueron realizadas con la prueba de correlación de Sprearman. Se consideró significativo p<0,05. Se utilizó el programa GraphPad Instat (GraphPad Software, Inc).

RESULTADOS

Características de las pacientes

Las características clínicas de las pacientes se describen en la Tabla I. Como se observa, no se encontraron diferencias estadísticamente significativas en la edad, peso, talla, edad gestacional e índice de masa corporal entre ambos grupos estudiados. Por el contrario los valores de PAS, PAD, PAM y FC fueron significativamente superiores en las mujeres con preeclampsia al compararlas con las mujeres embarazadas sanas. Efectivamente, las mujeres con preeclampsia han sido clasificadas por una elevación de la presión arterial de +20 mmHg y, con valores superiores a 140 mmHg en la presión arterial sistólica, y superior a 78 mmHg en la presión arterial diastólica, con una presión arterial media igual o superior a 105 mmHg.

Parámetros de Laboratorio

Los parámetros de laboratorio se describen en la Tabla II, donde se puede apreciar incrementos estadísticamente significativos en los valores de glicemia, nitrógeno ureico en sangre (BUN), proteinuria, creatinina, eosinófilos y neutrófilos en mujeres embarazadas preeclámpticas al compararlos con las mujeres embarazadas sanas. En las mujeres embarazadas con preeclampsia se observó una tendencia a la trombocitopenia aunque no resultó significativa. Adicionalmente, se analizó la presencia de nitratos en las muestras de plasma de las pacientes y se encontró un aumento significativo de los nitratos en las mujeres embarazadas con preeclampsia.

Niveles plasmáticos de adipocinas en mujeres embarazadas sanas y en pacientes con preeclampsia (pg/ml)

Bajo nuestras condiciones experimentales, de las adipocinas evaluadas en las muestras de plasma, solo los valores plasmáticos de la resistina mostraron incrementos significativos en el grupo de pacientes con preeclampsia comparados con el grupo de embarazadas sanas. Estos aumentos estuvieron asociados a niveles incrementados de Insulina (Tabla III).

Correlación entre la PAS, los parámetros clínicos de laboratorio y las adipocinas plasmáticas

Al establecer la posible correlación entre los valores de PAS y los parámetros de laboratorio calculado por la correlación de Spearman en todos los sujetos, se encontró que existe una la correlación positiva, estadísticamente significativa, entre la PAS vs. proteinuria (r=0,8192; p=0,0001), PAS vs. glicemia (r=0,450; p<0,05) y PAS vs. ON (r=0,7419; p=0,0004). Igualmente, se muestra que la Insulina y la resistina mostraron una correlación positiva estadísticamente significativa con los valores de PAS (Tabla IV).

DISCUSIÓN

Se ha establecido que el incremento de la producción de ON en el endotelio vascular y su bioactividad normal constituyen mecanismos críticos que explican la adaptación hemodinámica en el embarazo normal¹⁹. Ahora bien, la característica más importante observada en la PE es la vasoconstricción generalizada. Debido a ello, se ha propuesto la existencia de una alteración endotelial en la síntesis de ON. Por otra parte, debido a la alta reactividad del ON en transformarse en nitratos y nitritos, se postula que posiblemente exista una baja bioactividad del mismo. Debido a ello, muchos investigadores han realizado estudios clínicos en mujeres embarazadas con PE versus mujeres embarazadas controles, para evaluar la concentración sérica de nitratos y nitritos. Nuestros hallazgos en mujeres con preeclampsia, demuestran niveles elevados de nitritos (metabolito de ON) en la circulación periférica de embarazadas complicadas por preeclampsia comparados con embarazadas normales. Aún más, el análisis de la correlación de Spearman de todas las pacientes mostró una correlación positiva y significativa entre los valores de PAS y nitritos plasmáticos. Estos datos son difíciles de conciliar con el concepto que la reducción de la actividad de NOS endotelial materna como la causa de la preeclampsia. Hasta la fecha, los estudios acerca de los niveles circulantes de ON en la preeclampsia son múltiples pero conflictivos. Efectivamente, se ha reportado incrementos^20-22, disminución²³ o ninguna alteración^24,25de los niveles plasmáticos de ON en la PE. Las discrepancias pueden surgir como resultado de las fluctuaciones en los niveles de ON que resultan de la condición médica del paciente, de la intervención o de la dieta. Nuestros hallazgos de valores incrementados se ven avalados por los reportados por Nobunaga y col.²⁶, quienes demuestran en un estudio amplio de más 400 pacientes, la presencia de niveles elevados de metabolitos de ON en plasma de mujeres con preeclampsia en comparación con embarazo normal. Estos resultados sugieren que el aumento de circulación los niveles de ON encontrados en PE podrían representar un aumento compensatorio de la producción endotelial y plaquetaria de ON aunado a una reducción en su degradación. Colectivamente, estos datos sugieren que los altos niveles de metabolitos circulantes de ON son posiblemente un epifenómeno resultante de la vasoconstricción en la preeclampsia. Sin embargo, la presencia de una alta presión arterial materna indica que los niveles elevados séricos de ON no puede compensar la vasoconstricción que ocurre en preeclampsia, lo que sugiere que la vasculatura de pacientes con preeclampsia, de alguna manera resulta insensible o resistente a los efectos del ON.

El tejido adiposo no solo está involucrado en el almacenamiento de energía sino que también funciona como un órgano endocrino que secreta varias moléculas bioactivas denominadas colectivamente adipocinas. Las mismas están involucradas en una amplia gama de procesos fisiológicos que incluyen hemostasia, metabolismo de lípidos, aterosclerosis, regulación de la presión arterial, sensibilidad a la insulina y angiogénesis. Varias adipocinas también influyen en la inmunidad y la inflamación. Durante el embarazo la placenta produce y secretada citocinas y adipocinas, que incluyen el factor de necrosis tumoral a (TNF-α), la interleucina-6 (IL-6), la leptina, la adiponectina, la resistina, visfatin y apelin^27-33. Además de regular metabolismo energético materno y la sensibilidad a la insulina en el embarazo normal, las adipocinas han sido implicadas en las complicaciones del embarazo como la diabetes mellitus gestacional y la PE^16,34-37. Se han demostrado alteraciones en los niveles circulantes de las adipocinas como la adiponectina, resistina, leptina, visfatina, RBP4 y vaspina durante la DMG y PE^38-41

En el presente estudio se demuestra la desregulación de la adipocina: la resistina, en mujeres embarazadas venezolanas con PE, cuya condición fue confirmada por la clara manifestación del incremento en la presión arte.ial y la proteinuria. Aunado a ello, las mujeres embarazadas con PE mostraron incrementos significativos en los niveles plasmáticos de insulina y glucosa. Aún más, nuestros hallazgos demuestran que los valores de PAS de la población de pacientes embarazadas se correlacionaron positivamente con los valores de resistina plasmática (P=0,0067), insulina (P=0,01), glicemia (P=0,0067) y proteinuria (P=0,0067), sugiriendo la coexistencia de PE con resistencia a la insulina materna y diabetes mellitus gestacional (DMG) en el último trimestre del embarazo. Este estudio constituye la primera descripción en que se relacionan las variables de presión arterial y los niveles circulantes de resistina en PE.

La resistina es una hormona secretada por monocitos, macrófagos y adipocitos. Los estudios en animales han demostrado que la resistina induce resistencia a la insulina y reduce la tolerancia a la glucosa al interferir con la captación de glucosa en el hígado¹¹. Sin embargo, el papel de la resistina en la fisiología del embarazo y las complicaciones del embarazo aún no ha sido esclarecido. El presente estudio se demostró que los niveles de resistina se encuentran significativamente elevados en las pacientes con PE cuando se comparan con el grupo de embarazadas control. Resultados similares fueron reportados por Song y col.³⁹ y Seol y col.⁴² quienes también demostraron que los niveles de resistina del suero materno se encuentran significativamente elevados en mujeres embarazadas con PE al compararlas con las embarazadas normales.

Existe evidencia que indica que ni el tejido adiposo ni la placenta son la fuente del incremento de la resistina en la PE. En efecto, se ha demostrado que no existe diferencia entre los niveles de resistina placentaria entre las mujeres con PE y con embarazo normal⁴² y se ha demostrado que la expresión de resistina es baja en el tejido adiposo y se mantiene constante a lo largo de todo el embarazo³¹. Desde que la resistina puede ser secretada por monocitos, los cuales están regulados por varios mediadores inflamatorios⁴³ y debido a que la PE se considera una enfermedad inflamatoria sistémica y la activación de monocitos es un rasgo característico de un estado inflamatorio, se podría inferir que el aumento de los niveles de resistina en plasma en PE podría estar asociado con la activación de monocitos debido a una respuesta inflamatoria sistémica. En efecto, se ha demostrado la presencia de concentraciones elevadas de TNF-α e IL-6 en la circulación materna en PE^36,38,44-48. Igualmente, Szarka y col.⁴⁹ demostraron que los niveles circulantes de citoquinas proinflamatorias IL-6 y TNF-a, las quimioquinas IL-8, IP-10 y MCP-1, así como las moléculas de adhesión ICAM-1 y VCAM-1, se encuentran incrementados en PE comparados con embarazadas normales, lo que resulta en un entorno sistémico proinflamatorio. Estos niveles elevados de citoquinas proinflamatorias en la circulación materna podrían jugar un papel central en la respuesta inflamatoria sistémica, así como en la disfunción endotelial generalizada característica del síndrome materno de preeclampsia. Se ha sugerido que estos aumentos de las concentraciones de citoquinas explican el mecanismo subyacente de la activación de los leucocitos en este trastorno^18,45,47. En este sentido, la IL-6 puede desencadenar la producción del factor derivado de plaquetas, el factor de crecimiento y un aumento en la relación tromboxano A2/prostaciclina, 2, procesos frecuentemente descritos durante la PE⁵⁰. De igual manera se ha implicado al TNF-α en la activación de las células endoteliales característica de la PE⁵¹.

Las adipocinas circulantes pueden servir como medida indirecta de la resistencia a la insulina tanto en embarazadas como no embarazadas^5,52,53por lo tanto, podrían ser candidatos a biomarcadores en la preeclampsia.

En conclusión, se reporta aumentos circulantes de resistina en una población de mujeres embarazadas venezolana con 28-40 semanas de gestación, la cual podría desempeñar un papel en el desarrollo de resistencia a la insulina en pacientes con PE. Estos cambios de los niveles resistina circulante, junto con los factores de riesgo tradicionales, ayudará a determinar la coexistencia de PE y DMG. Además, permitirá establecer a la resistina como biomarcador prometedor para evaluar la sensibilidad a la insulina y la resistencia a la insulina en la PE y/o la DMG. Sin embargo se requieren estudios a gran escala y prospectivos para evaluar si la asociación entre el incremento de la presión arterial, la proteinuria, y el aumento de la resistina constituyen marcadores tempranos que permitan pronosticar el desarrollo de DMG en pacientes con PE.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen al Ministerio del Poder Popular para la Ciencia, Tecnología e Innovación por la subvención del Proyecto de Estímulo a la Investigación PEII No. 20122000787.

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