Vacunas contra Leishmania

Vaccines against Leishmania

As vacinas contra Leishmania

La leishmaniosis es una enfermedad causada por protozoos del géneroLeishmania. Se trata de un parásito intracelular obligado que reside dentro del macrófago, donde prolifera, y que es transmitido por flebótomos. Se ha descrito la leishmaniosis en 98 países de cinco continentes, afecta a más de 12 millones de personas y cerca de 350 millones están en riesgo de padecerla. Cada año se producen entre 1,5 y 2 millones de casos nuevos de leishmaniosis tegumentaria y 500.000 de la forma visceral (1)-(3).

La leishmaniosis tegumentaria está presente en América Central y Suramérica, con excepción de Chile y Uruguay, y la forma visceral, en doce de sus países, aunque con baja frecuencia en los considerados andinos (Bolivia, Colombia, Ecuador, Perú y Venezuela), excepto Brasil que tiene morbimortalidad importante por leishmaniosis en algunas de sus regiones. La compleja distribución geográfica de la leishmaniosis en América obedece a variaciones en los ciclos de transmisión, los reservorios y los insectos transmisores, así como a los deficientes programas de control. Todo ello explica la tendencia al aumento de las personas afectadas y del riesgo de transmisión (4)-(6).

En la leishmaniosis, como en muchas de las enfermedades parasitarias, y a pesar de las variadas estrategias empleadas por el parásito para sobrevivir en el mamífero, el hospedero puede adquirir inmunidad a la infección por la misma especie que agrupa al patógeno, a pesar de la respuesta inmune celular ineficiente dependiente de las citocinas y la polarización de los macrófagos. Por tanto, la vacunación podría ser exitosa para prevenir y tratar la enfermedad (1)-(3),(7). Tal estrategia sería importante por la toxicidad de la quimioterapia y la resistencia a la misma, que cada vez son mayores, al igual que por otras circunstancias: aumento de la incidencia de la enfermedad en sujetos inmunocomprometidos, dificultad para el control epidemiológico y definición incompleta de los determinantes de susceptibilidad y progreso de la enfermedad (8).

Se han desarrollado varias generaciones de vacunas contra la leishmaniosis: la primera se centró en parásitos muertos o extractos crudos (9),(10). Las vacunas fabricadas con parásitos muertos con o sin adyuvante tienen las siguientes características: composición bioquímica estable, antigenicidad y tolerancia buenas, seguridad y bajo costo; fueron desarrolladas a partir de 1930 en Brasil y se han usado en Suramérica desde la década de 1940 (11), por ejemplo, en Colombia y Ecuador (12).

Estas vacunas han sido preparadas conLeishmania amazonensis y/o Leishmania major, lisadas por autoclave y con adyuvante de Freund completo (13),(14), o mediante la mezcla de promastigotos deLeishmania mexicanasometidos al autoclave y BCG (Bacilo de Calmette-Guérin). Se han usado para inmunoterapia o inmunoquimioterapia, que resultó efectiva contra la enfermedad cutánea leve y en la prevención de las lesiones cutáneas deformantes, pero no contra la leishmaniosis visceral (10),(12),(15),(16). En 1980 la vacunación contra la leishmaniosis con parásitos muertos experimentó un auge con base en la demostración de la excelente protección que confiere en ratones, cuando se administra intravenosa o intraperitonealmente; infortunadamente, con el tiempo los parásitos sometidos al autoclave pierden su potencia inmunogénica (17).

En el caso de la leishmaniosis visceral canina, se han empleado con éxito vacunas con fracciones del parásito, entre ellas laLeishmune^®, que consiste en una preparación enriquecida de glicoproteína de promastigotos deLeishmania donovani, llamada ligando de fucosa-manosa (FML, por su sigla en inglés) que es formulada con saponina deQuillaja saponania, como adyuvante. La glicoproteína, el FML, es una molécula esencial (involucrada en la construcción del DNA del parásito) y constituye el mayor complejo antigénico deL. donovani(18). También se ha usado ampliamente como candidato para vacuna el lipofosfoglicano (LPG) deLeishmania spp., un ligando para TLR2 en células NK que regula la producción de IFN-γ y TNF-α, pero con resultados contradictorios (19).

Otro enfoque de la inmunoterapia consiste en usar una sola proteína antigénica del patógeno con el fin de provocar una respuesta inmunitaria específica; en este sentido, se ha empleado el péptido gp63 deLeishmania(leishmanolisina) por ser una proteína inmunógena en todas las especies deLeishmania. Esto lo hace un buen candidato para vacunas de péptidos contra este grupo de parásitos (20),(21).

También se han usado en perros vacunas contraLeishmania infantumatenuadas con gentamicina, aminoglucósido que afecta el metabolismo tiol-redox del parásito, que es crucial para su supervivencia cuando se expone al estrés oxidativo generado durante su entrada al macrófago del mamífero; el parásito puede penetrar, pero no sobrevive y genera una fuerte respuesta inmunitaria del hospedero (22).

Asimismo, en perros se demostró protección contraL. infantumcuando se los inmunizaba con antígenos de secreción/excreción purificados de sobrenadantes de cultivos de promastigotos de esa especie del parásito sin adyuvante (LiESAp) o con el adyuvante dipéptido muramil (LiESAp-MDP), lo que induce la proliferación de linfocitos específicos Th1, productores de IFN-γ, que potencian la actividad antileishmania mediada por el óxido nítrico secretado por monocitos derivados de macrófagos (23). Igual papel en la activación de la respuesta Th1 tienen las enzimas enolasa (LdEno) y aldolasa (LdAld) de la vía glicolítica extraídas de lisados solubles de aislamientos deL. donovani, y las serina-proteasas extracelulares deL. amazonensis, que incluso administrada por vía nasal confiere protección en ratones BALB/c (24). El mismo efecto lo pueden tener las siguientes proteínas solubles: F14, elF2, P45, PDI, TPI y TPR (25)^. De igual forma se recurre a la cisteína-proteasa en liposomas catiónicos con receptores agonistas contraL. donovanien el modelo del hámster (26),(27).

De la misma manera, pero en ratones, se ha empleado la vacunación con proteína ribosomal purificada de extractos crudos de promastigotos (LRP, por la sigla en inglés deLeishmania major ribosomal protein) combinada con el oligodeoxinucleótido CpG (CpG ODN), como adyuvante, pues induce respuesta Th1 (28). Igualmente, se han usado antígenos deLeishmania spp., tales como: tiol antioxidante específico (TSA, por la sigla en inglés dethiol specific antioxidant), proteína 1 inductora de estrés (LmSTI1, por la sigla en inglés), cisteína peptidasa (CPA), histona H1, factor iniciador eucariótico deLeishmania(LelF), proteína 11 de membrana de quinetoplasto (KMP11, por la sigla en inglés), proteínas de membranas Dp 7, gp 70-2 y FML, proteína B de superficie hidrófila acilada (HASPB, por la sigla en inglés), proteína específica de amastigoto (A2) y cisteína-proteinasa B (CPB, por la sigla en inglés), todos con efecto protector individual para solo una especie deLeishmania(25),(29)-(39).

La inmunización con la enzima esterol metiltransferasa- c-24 (SMT, por la sigla en inglés) (formulada con una emulsión estable de monofosforil lípido A) es capaz de generar protección cruzada contra diferentes especies deLeishmaniapor ser una proteína altamente conservada entre ellas (36); esta proteína se requiere para la síntesis de ergosterol, el principal esterol de la membrana deLeishmania, que está ausente en los mamíferos. Con poca efectividad profiláctica se han empleado poliproteínas como Q, Leish-111f, Leish- 110f y KSAC (25).

Otra estrategia de vacunación es el uso de las proteínas de choque térmico (HSP, por la sigla en inglés) llamadas chaperonas moleculares porque intervienen en el plegado, montaje, localización intracelular, secreción y degradación de proteínas como las inmunoglobulinas y el complejo mayor de histocompatibilidad), debido a que son altamente conservadas y tienen potencial para estimular las células T. Al respecto, se ha usado satisfactoriamente la proteína de choque térmico 70 (HSP70) deL. donovanien el control de la infección en hámsteres (40^,41), incluso las observaciones indican que vacunas basadas en la combinación de HSP70 con proteínas estimuladoras Th1 (triosa fosfato isomerasa, proteína disulfuro-isomerasa y el factor 2 de elongación) deL. donovanipotencian la efectividad en la destrucción del parásito intracelular (42).

Se basa en una antigua observación: que después de curarse de una lesión el individuo se hace resistente a la reinfección. Esta práctica, conocida comoleishmanización, consiste en la inoculación deliberada de formas vivas deLeishmania, procedentes del exudado de lesiones cutáneas de personas infectadas, en sitios anatómicos no expuestos de individuos sanos. Esta técnica ha sido practicada por siglos (43),(44) y a gran escala en Israel, Irán y la extinta Unión Soviética (11),(17). Sin embargo, su empleo se ha limitado por razones éticas y por la aparición de efectos adversos, como el desarrollo de lesiones persistentes, psoriasis, inmunosupresión, hipersensibilidad y persistencia del parásito; también por las dificultades en la cuantificación del inóculo (9),(11),(17),(45).

La siguiente vía en el desarrollo de vacunas contraLeishmaniafue el uso de parásitos vivos atenuados por medios físicos, químicos o genéticos, a saber: cultivos in vitro por largos períodos, sensibilidad a la temperatura, atenuación por rayos gamma, atenuación química, mutagénesis química, cultivos bajo presión de drogas y modificaciones del parásito como la disrupción genética (46)-(50). Sin embargo, los principales problemas del uso de parásitos atenuados son la seguridad y la poca factibilidad de utilizarlos a gran escala en el campo (42),(51).

Al respecto, la atenuación por modificación genética de los parásitos permite reducir la virulencia, mantener la inmunogenicidad y producir una respuesta inmunitaria similar a la obtenida con los parásitos vivos y virulentos, pero sin el daño asociado a estos (11).

Con la secuenciación completa deL. majorse puede atenuar su virulencia mediante el bloqueo o reemplazo (knock-out) de genes esenciales (7),(52). Lo que se pretende es diseñar parásitos sin los genes que les garantizan larga supervivencia dentro del hospedero, haciéndolos, por tanto, seguros para inmunizar (44). Por ejemplo, enL. majorse modificó el gen de dihidrofolato reductasa-timidilato sintasa (DHFR-TS), y enL. mexicanala cisteína-proteasa CPA y CCPB (18,53-55). Asimismo, por deleciones se han desarrollado leishmaniasknock-outpara los genes A2 rel, SIR2 y Hsp70-II y para genes de proteínas esenciales como: cisteína-proteinasa, transportador de bioterina, complejo citocromo C oxidasa, proteína parecida a ubiquitina, proteína que convierte el precursor Ufm1 a su forma conjugada y proteína p27 específica de amastigotos (26),(54),(56)-(63).

En la atenuación de la virulencia deLeishmaniase ha recurrido a la adición de casetes suicidas que ocasionan la muerte del parásito en respuesta a un determinado estímulo externo, como la introducción de genes de sensibilidad a drogas (17), por ejemplo: la expresión enL. majorde los genes timidina-quinasa del virus herpes tipo 1 que la hacen sensible al ganciclovir (64) y el gen de la citosina-deaminasa deSacharomyces cerevisiae, que hace al parásito sensible a drogas como 5-fluorocitosina (65).

Otro enfoque de las vacunas de segunda generación es el uso de virus o bacterias vivos recombinantes que expresan antígenos deLeishmania. Ambos, virus y bacterias, expresan proteínas del parásito y actúan como sistema coadyuvante. Son ejemplos de proteínas del parásito expresadas por bacterias con este propósito: la proteasa de superficie gp63 deL. major, el antígeno de superficie clonado enSalmonella thypymuriummutante (patógeno intracelular capaz de penetrar en el macrófago humano), sola o en asociación con IL-2, IFN-γ, TNF-α o antígeno LACK (66); o en BCG (67) oLactococcus lactis(bacteria grampositiva no patógena, usada en la fermentación de alimentos) que expresan A2 deL. donovani y L. lactisy coexpresan LACK e IL1249.

Los siguientes son ejemplos de virus que expresan proteínasvacunantes: a) virus de la vaccinia que expresa la proteína de superficie del promastigoto G46/M-2/ PSA-2, que protege contraL. amazonensis(68), análogo en el parásito del receptor para activar la quinasa C de los mamíferos que protege a ratones BALB/c contraL major(69); b) adenovirus que expresan el antígeno A2 de amastigotos (70).

También se han empleado parásitos distintos aLeishmaniaen la técnica de vacunación con base en la atenuación como el antígeno LCR1 deL. chagasi(similar a una proteína flagelar deTripanosoma cruzi) en BCG (71); el antígeno proteico de la membrana del quinetoplasto KMP-11 en taquizoítos atenuados deToxoplasma gondii(72) yLeishmania tarentolae(no patógena para humanos), bien sea solo, recombinante con expresión única del gen A2 o fusionado con los genes CPA, CPB y CTE49. Este último enfoque para las vacunas vivas atenuadas, es decir, el empleo deLeishmaniasno patógenas para el ser humano, fue ideado por Breton (73), con base en el alto nivel de inmunorreactividad cruzada que se observa entre especies de parásitos patógenos y no patógenos para el ser humano, y podría llegar a ser la vacuna que mayor seguridad ofrezca al receptor en esta categoría.

También es posible modificar los parásitos para que produzcan sustancias biológicas que activen el sistema inmunitario, como el factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) (74). Sin embargo, hay varios argumentos en contra de las vacunas atenuadas, entre ellos, que la deleción de genes de virulencia esenciales pueda ocasionar la completa destrucción del parásito, o la aparición de mutantes que favorezcan el desarrollo de lesión (73).

Por esta razón, actualmente se está investigando con la radiación ionizante en la atenuación deLeishmaniapara el desarrollo de vacunas, empleando para ello el modelo del ratón BALB/c y las vías de administración intramuscular e intraperitoneal (49),(75).

Incluye, como el procedimiento de vacunación más reciente, la codificación de genes para un antígeno de protección, clonado en un vector; en pocas palabras, este método implica la inoculación de DNA insertado en un plásmido bacteriano que actúa como vector. El gen del antígeno vacunal queda bajo el control de un potente promotor mamífero. Cuando se inocula en un animal este plásmido, construido por ingeniería genética, es capturado por las células del hospedero, en las cuales el DNA se transcribe a RNAm y se traduce en la proteína endógena de la vacuna (33),(76),(77).

De esta generación la sustancia más probada como candidato para vacuna recombinante es la proteína de superficie B1 acilada hidrófila (HASPB1), que confiere protección contraL. donovani(31). También se ha empleado el candidato antigénico NH36, que confiere protección contra la infección porL. chagasi, L. mexicana(32) yL. amazonensis.Esto plantea su efectividad potencial como vacuna inmunoprofiláctica bivalente, para el control de ambas endemias. A la par se han empleado las proteínas ribosomales recombinantes L3 y L5 deL. majorpara el desarrollo de vacunas contraLeishmania(78). Asimismo, la vacuna de DNA basada en la expresión de la proteína antioxidante tiol específica de amastigoto y promastigoto induce respuesta inmune de la plataforma Th1, cuyo efecto puede amplificarse cuando se acompaña con aluminio: este es un ejemplo de los intentos por impulsar las vacunas DNA con adyuvantes (79),(80). Otros antígenos deLeishmaniacandidatos para vacuna de DNA son el factor de elongación e iniciación, K26/ HASPB, la quinasa C activa, la nucleósido-hidrolasa, P36LACK, A2, gp63, KMP11, CPB, ORFF, UBQ-ORFF, TRYP, H2A, H2B, H3, H4, GCS-γ, PSA-2 y la esterol-metiltransferasa 24-C (25),(42),(81).

Coler y colaboradores (82) han trabajado en leishmaniosis visceral con tres poliproteínas recombinantes deLeishmania(TSA, LmSTI1, LeIF) en asociación con el lípido monofosforil y el hidrocarburo escualeno como coadyuvante (MPL-SE). En Europa se están haciendo pruebas clínicas de dos nuevas vacunas de DNA (una basada en un vector viral, y la otra, en la expresión genética de antígenos seleccionados de Leishmania denominada LEISHDNAVAX2) (51).

Por las siguientes razones son notorias las ventajas de estas estrategias profilácticas sobre las anteriores: son vacunas simples, se pueden producir a gran escala, son estables a temperatura ambiente, lo que facilita su almacenamiento y transporte, y, finalmente, se pueden combinar varios antígenos y administrarlos en una sola dosis y por tanto brindar protección contra más de una especie deLeishmania, con lo cual se reduce el número de vacunas (83).

A las categorías de vacunas ya mencionadas se suman otros enfoques: la disrupción, si se quiere química, de la señalización mediante elknock-outgenético del factor de transcripción STAT6 para reducir la expresión de la enzima arginasa, molécula que contribuye a la replicación intracelular deLeishmaniapor competencia con la óxido nítrico sintetasa (NOS2) por el sustrato arginina y por la generación de poliaminas que promueven el crecimiento del parásito (84); las células T asesinas (únicas que reconocen glicolípidos) estimuladas con el antígeno alfa galactosil ceramida (aGalCer) para incrementar su efecto natural en la infección (85); el uso con fines de vacunación de células dendríticas pulsadas ex vivo con antígenos deLeishmania, pues actuarían como vectores de antígenos y adyuvantes naturales, en la estimulación de respuestas protectoras, como lo demostraron Moll y Berberich (86), porque las células dendríticas son muy especializadas en la presentación de antígenos, mecanismo esencial para la generación de células T en la respuesta inmunitaria protectora, directamente dependiente de la naturaleza del estímulo microbiano. La manipulación de estas células para la generación de una respuesta celular Th1 específica de antígeno parece ser una estrategia promisoria de vacunación contraLeishmania. (87)-(90).

También se han empleado con éxito en vacunación e inmunoterapia en un modelo de ratón (91) células dendríticas que sobreexpresan IL-12 (citocina que estimula la respuesta inmunitaria), y fragmentos o exosomas derivados de células dendríticas previamente expuestas a lisados deLeishmania(92). Además, se han pulsado células dendríticas con péptidos específicos del parásito como gp63 o con péptidos multiepítope (93),(94). Asimismo, se han usado en las terapias con células dendríticas adyuvantes como el CpG-ODN, que es un ligando TLR9, que induce la activación de dichas células y estimula la respuesta Th1 (95). In vivo, se ha manipulado el receptor DEC205 de las células dendríticas con antígenos (LACK, Lelf, Lm- STI1a) conjugados con anticuerpos como herramienta de inmunización contraLeishmania(96). Finalmente, se ha usado la transfectación genética Flt3L in vivo con el objeto de incrementar la población de células dendríticas (97).

Por su efecto contra tripanosomas, se ha usado el extracto deWarburgia ugandensissubsp.ugandensis, planta de uso medicinal en África, con antígenos solubles deL. majorcomo vacuna en ratones BALB/c (98), y las vacunas con componentes de la saliva del flebótomo, en particular los antígenos MAX o MAXIDILAN (99), PpSP15, LJM19, LJL143 y LJM17, proteínas obtenidas de este insecto que inducen resistencia significativa contra la infección porL. majoryL. infantum(100). Actualmente se prueba el efecto protector de una vacuna basada en la proteína PpSp15 de la saliva del vector conLeishmania tarentolaeviva recombinante que expresa proteína-cisteinasa (101). Para finalizar, es prudente reconocer que ninguna de las estrategias de vacunación desarrolladas hasta el momento es capaz de controlar eficientemente la enfermedad