La infección por el virus del papiloma humano (VPH) es la enfermedad infecciosa de transmisión sexual más común en el mundo y prácticamente la causante del cáncer cérvico-uterino (CCU).¹ EL CCU actualmente constituye la tercera causa de muerte en el mundo,^1,2,3,4 y la quinta causa de muerte en Cuba. ⁴

De entre los virus de alto riesgo oncogénico se destaca al VPH 16 como el principal responsable del cáncer cérvicouterino y de fracciones variables de los cánceres de vulva, vagina, pene, ano, orofaringe y bucal.⁵ En la actualidad, las vacunas preventivas que se encuentran en el mercado (Cervarix ^TM, Gardasil ^TM y Gardasil ^9TM) se basan en estructuras complejas conocidas como Partículas Similares al Virus (PSV) formadas a partir del autoensamblaje de 360 moléculas de la proteína L1.^6,7 Estas PSV son seguras y proporcionan protección duradera, debido entre otras cosas, a que carecen de material genético del virus y poseen las mismas características inmunogénicas que la partícula viral.³ Las vacunas, al ser producidas en sistemas de expresión eucariota poseen el inconveniente de los bajos niveles de producción y su elevado costo las hace inaccesible a la población que posee bajos recursos.³ Por otro lado, Escherichia coli es un hospedero que posee entre otras ventajas, los elevados niveles de producción de proteínas recombinantes en medios de cultivo baratos y la facilidad de su manipulación genética.⁸ Además existe una gran variedad de cepas que han sido manipuladas genéticamente, como es el caso de E. coli Shuffle C3026, la cual posee un ambiente citoplasmático que promueve la formación de puentes disulfuro y la solubilidad de proteínas que se producen en dicho compartimento. ⁹ En trabajos realizados por el grupo de Zhang en 1998 y posteriormente el de Bang en el 2016 encontraron que la proteína L1 de VPH ¹⁶ producida en forma de cuerpos de inclusión en E. coli puede ser renaturalizada, y que las PSV auto-ensambladas in vitro poseen características inmunológicas similares a las de las partículas virales.^10,11 El objetivo del siguiente trabajo es expresar en Escherichia coli Shuffle C3026 al gen l1 del virus del papiloma humano tipo16 procedente de un aislado clínico cubano.

Construcción del plasmidio pETHPV16L1myc-His

Para obtener la construcción pETHPV16L1myc-His, al plasmidio pBADHPV16L1myc-His previamente obtenido en nuestro laboratorio y en el que no se detectó producción de la proteína L1myc-6xHis ( datos no mostrados), se le extrajo un fragmento de 2 472 pb que incluía al gen l1 del VPH16 y a la secuencia nucleotídica que codifica para el epítope myc y seis histidinas (etiqueta) con las enzimas de restricción NcoI y ScaI, y se ligó en el plasmidio pET28a(+) previamente digerido con HindIII rellenado con klenow y digerido con NcoI(Fig.1A). Dicha ligazón se transformó en E. coli Mach1 y los transformantes se seleccionaron mediante siembra en placas de agar LB suplementadas con kanamicina 100 μg/mL, y se incubaron a 37 °C durante 15 h.

Dicha transformación rindió 165 colonias, a cuatro de estas se le extrajo el plasmidio para análisis mediante doble digestión con las NcoI y Soy, y simple digestión con XbaI. La digestión realizada con las enzimas NcoI y XhoI rindió dos fragmentos de aproximadamente 2 500 pb correspondiente al inserto y otro poco mayor de 5 000 pb correspondiente al vector, mientras que la digestión con la enzima XbaI sólo rindió un fragmento de aproximadamente 8 000 pb, lo cual está en correspondencia con los tamaños esperados. Dichas digestiones evidenciaron la presencia del fragmento de 2 472 pb en los sitios NcoI y HindIII del plasmidio pET28a (+) (Fig.1B.). Luego el plasmidio procedente del clon 2 previamente analizado por restricción se transformó en E. coli Shuffle C3026, los transformantes se sembraron en placas de agar LB suplementadas con kanamicina 100 μg/mL , se incubaron durante 14 h a 28 °C y cuatro de estos se conservaron en LB-glicerol al 20 %(v/v).

Fig.1.

A: Estrategia de sub-clonaje del gen l1 de VPH16 en el plasmidio pET28a(+). B: Electroforesis en gel de agarosa al 0, 8 % de los plasmidios pETHPV16L1myc-His analizados mediante restricción. Carril 1, marcador de peso 1 kb DNa Step Ladder (Promega). Carril 2, plasmidio del clon1 sin digerir. Carriles 2 al 6, plasmidios de los clones 1 al 4 digerido con las enzimas NcoI y XhoI. Carriles 7 al 10 plasmidios de los clones 1 al 4 digerido con la enzima XbaI.

Expresión de la proteína L1Myc-6xHis en E. coli SHuffle C3026 mediante SDS-PAGE y western blot

Para la evaluación de la producción de la proteína L1Myc-6xHis en E. coli SHuffle C3026 una colonia de cada clon conservado incluyendo un clon portador del plasmidio pET28a(+) se inocularon en 5 mL de caldo LB suplementado con kanamicina a 100 μg/mL durante 12 h a 27 °C en agitación (200 r/min). Seguidamente, este preinóculo se diluyó 100 veces en 5 mL de caldo LB suplementado con el mismo antibiótico, y las células se crecieron en las mismas condiciones hasta que la absorbancia a 600 nm (A₆₀₀) alcanzó el valor de 0,6. Luego la expresión del genl1 se indujo con 0, 4 mmol/L de Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) durante cuatro horas.

Las muestras se procesaron ajustándoles la A₆₀₀ a^6,5 en tampón fosfato de sodio (PBS1X) (109439, Merck, Alemania). Seguidamente se mezclaron 80 μL de las mismas con 20 μL de tampón para muestra 6 X (Tris-HCl 375 mmol/L pH ^6,8; bromofenol azul 0,03 % (m/v); glicerol 50 % (v/v); SDS 9 % (m/v) y β-mercaptoetanol 9 % (v/v)),12 se incubaron a 95 °C durante 10 min y se conservaron a -20 °C para análisis mediante SDS-PAGE al 10 % y western blot.

Los resultados obtenidos en el análisis del SDS-PAGE mostraron una proteína intensamente teñida observada en los carriles 1 al 4 (E. coli Shuffle C3026/pETHPV16L1Myc-His) que no se observó en el carril 5 (E. coli Shuffle C3026/pET28a) (Fig.2 A), lo cual indica que la proteína intensamente teñida pudiera corresponder a la proteína L1Myc-His. A su vez el rendimiento de la misma se estimó mediante densitometría con la herramienta bioinformática ImageJ 58d,⁹ constituyendo un 11-14 % respecto a las proteínas totales. En 1998, el grupo de Zhang obtuvo un 10-15 % de la proteína al expresarla fusionada en el extremo amino terminal a la señal de secreción pelB del vector pET22b.¹¹ De modo similar procedió el grupo de Jeong Cho en el 2007 fusionándola a la enzima glutatión-S-transferasa (GST) y a la proteína de unión a maltosa (PUM).¹³ Se conoce que la producción de la proteína L1 a partir del gen silvestre en E. coli no siempre ha sido posible lograrlo a niveles detectables en SDS-PAGE por lo que se ha necesitado fusionarlo en la región 5´ a genes que codifican para proteínas o pépticos de fácil traducción.¹¹ La proteína GST por lo general se ha utilizado con este fin, siendo el empleo de un gen con uso optimizado de codones la mejor opción.¹⁴ Los resultados obtenidos en nuestros experimentos mostraron que la producción de la proteína L1 del VPH16 no requirió de su fusión a proteínas de fácil traducción para hacerla detectable en SDS-PAGE a diferencia de los trabajos reportados por los grupos de Zang y de Ma.^{11,12,13,14,15} Aunque las estrategias de fusión en ocasiones han logrado incrementar los niveles de producción de la proteína recombinante y facilitan su posterior purificación no son rentables para un proceso de producción a escala industrial debido a que requeriría de grandes cantidades de enzima para separar la proteína de fusión de la proteína de interés.¹⁶

Igualmente, la identidad de la proteína L1Myc-His se verificó mediante western blot empleando el procedimiento previamente descrito por el grupo de Falero.¹⁷ Para lo cual se utilizaron los anticuerpos primarios anti-Myc (CB9E10, CIGB Sancti Spiritus, Cuba) diluido 1: 500 y anti-L1 (MAB 885, Merck USA) diluido 1: 50 000 en tampón PBS1XTween-20 0,05 % (PBST) y como secundario el anticuerpo de conejo anti-IgG de ratón conjugado con la enzima peroxidasa de rábano (CB10S0, CIGB Sancti Spiritus, Cuba) diluido 1:1 000 en PBST.

En la membrana de western blot, se observa una banda mayoritaria y otras de menor tamaño (Fig. 2. B y C), lo cual pudiera estar dado a causa del efecto combinado de la degradación proteolítica y terminaciones tempranas de la traducción,¹⁰ así como a la degradación proteolítica y a la presencia codones alternativos de inicio de la traducción en el genl1.15 Estos resultados confirman que la proteína expresada en E. coli Shuffle C3026/pETHPV16L1Myc-His corresponde a la proteína L1 de VPH 16 y que el epítope Myc y las seis histidinas se encontraban fusionados al extremo carboxilo terminal de la misma.

Fig.2

Análisis de la producción de la proteína L1Myc-His. Carriles 1 al 4, 5 μL de extractos celulares de E. coli Shuffle C3026/pETHPV16L1myc-His. Carril 5, 5 μL de extractos celulares de E. coli Shuffle C3026/pET28a (+). Carril 6, 3 μL del marcador de peso Broad Range Molecular Weight Markers (Promega) en kDa. A: análisis mediante SDS-PAGE al 10 % de acrilamida. B y C: Análisis mediante western blot con los anticuerpos monoclonales anti-L1 (MAB 885) 1: 50 000 y anti-Myc (CB9E10) 1: 2 000. De los resultados obtenidos se puede concluir que es posible expresar al gen l1 silvestre del virus del papiloma humano tipo 16 procedente de un aislado clínico cubano a niveles detectables en SDS-PAGE y western blot, lo cual constituye un reporte preliminar que brinda la posibilidad de contemplar a Escherichia coli Shuffle C3026 (DE3) como un posible hospedero para la producción de altos niveles de la proteína L1myc-6xHis en vista a la elaboración de un candidato vacunal.

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