Para obtener la construcción pETHPV16L1myc-His, al plasmidio pBADHPV16L1myc-His previamente obtenido en nuestro laboratorio y en el que no se detectó producción de la proteína L1myc-6xHis ( datos no mostrados), se le extrajo un fragmento de 2 472 pb que incluía al gen l1 del VPH16 y a la secuencia nucleotídica que codifica para el epítope myc y seis histidinas (etiqueta) con las enzimas de restricción NcoI y ScaI, y se ligó en el plasmidio pET28a(+) previamente digerido con HindIII rellenado con klenow y digerido con NcoI(Fig.1A). Dicha ligazón se transformó en E. coli Mach1 y los transformantes se seleccionaron mediante siembra en placas de agar LB suplementadas con kanamicina 100 μg/mL, y se incubaron a 37 °C durante 15 h.

Dicha transformación rindió 165 colonias, a cuatro de estas se le extrajo el plasmidio para análisis mediante doble digestión con las NcoI y Soy, y simple digestión con XbaI. La digestión realizada con las enzimas NcoI y XhoI rindió dos fragmentos de aproximadamente 2 500 pb correspondiente al inserto y otro poco mayor de 5 000 pb correspondiente al vector, mientras que la digestión con la enzima XbaI sólo rindió un fragmento de aproximadamente 8 000 pb, lo cual está en correspondencia con los tamaños esperados. Dichas digestiones evidenciaron la presencia del fragmento de 2 472 pb en los sitios NcoI y HindIII del plasmidio pET28a (+) (Fig.1B.). Luego el plasmidio procedente del clon 2 previamente analizado por restricción se transformó en E. coli Shuffle C3026, los transformantes se sembraron en placas de agar LB suplementadas con kanamicina 100 μg/mL , se incubaron durante 14 h a 28 °C y cuatro de estos se conservaron en LB-glicerol al 20 %(v/v).

Fig.1.

A: Estrategia de sub-clonaje del gen l1 de VPH16 en el plasmidio pET28a(+). B: Electroforesis en gel de agarosa al 0, 8 % de los plasmidios pETHPV16L1myc-His analizados mediante restricción. Carril 1, marcador de peso 1 kb DNa Step Ladder (Promega). Carril 2, plasmidio del clon1 sin digerir. Carriles 2 al 6, plasmidios de los clones 1 al 4 digerido con las enzimas NcoI y XhoI. Carriles 7 al 10 plasmidios de los clones 1 al 4 digerido con la enzima XbaI.

Para la evaluación de la producción de la proteína L1Myc-6xHis en E. coli SHuffle C3026 una colonia de cada clon conservado incluyendo un clon portador del plasmidio pET28a(+) se inocularon en 5 mL de caldo LB suplementado con kanamicina a 100 μg/mL durante 12 h a 27 °C en agitación (200 r/min). Seguidamente, este preinóculo se diluyó 100 veces en 5 mL de caldo LB suplementado con el mismo antibiótico, y las células se crecieron en las mismas condiciones hasta que la absorbancia a 600 nm (A₆₀₀) alcanzó el valor de 0,6. Luego la expresión del genl1 se indujo con 0, 4 mmol/L de Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) durante cuatro horas.

Las muestras se procesaron ajustándoles la A₆₀₀ a^6,5 en tampón fosfato de sodio (PBS1X) (109439, Merck, Alemania). Seguidamente se mezclaron 80 μL de las mismas con 20 μL de tampón para muestra 6 X (Tris-HCl 375 mmol/L pH ^6,8; bromofenol azul 0,03 % (m/v); glicerol 50 % (v/v); SDS 9 % (m/v) y β-mercaptoetanol 9 % (v/v)),12 se incubaron a 95 °C durante 10 min y se conservaron a -20 °C para análisis mediante SDS-PAGE al 10 % y western blot.

Los resultados obtenidos en el análisis del SDS-PAGE mostraron una proteína intensamente teñida observada en los carriles 1 al 4 (E. coli Shuffle C3026/pETHPV16L1Myc-His) que no se observó en el carril 5 (E. coli Shuffle C3026/pET28a) (Fig.2 A), lo cual indica que la proteína intensamente teñida pudiera corresponder a la proteína L1Myc-His. A su vez el rendimiento de la misma se estimó mediante densitometría con la herramienta bioinformática ImageJ 58d,⁹ constituyendo un 11-14 % respecto a las proteínas totales. En 1998, el grupo de Zhang obtuvo un 10-15 % de la proteína al expresarla fusionada en el extremo amino terminal a la señal de secreción pelB del vector pET22b.¹¹ De modo similar procedió el grupo de Jeong Cho en el 2007 fusionándola a la enzima glutatión-S-transferasa (GST) y a la proteína de unión a maltosa (PUM).¹³ Se conoce que la producción de la proteína L1 a partir del gen silvestre en E. coli no siempre ha sido posible lograrlo a niveles detectables en SDS-PAGE por lo que se ha necesitado fusionarlo en la región 5´ a genes que codifican para proteínas o pépticos de fácil traducción.¹¹ La proteína GST por lo general se ha utilizado con este fin, siendo el empleo de un gen con uso optimizado de codones la mejor opción.¹⁴ Los resultados obtenidos en nuestros experimentos mostraron que la producción de la proteína L1 del VPH16 no requirió de su fusión a proteínas de fácil traducción para hacerla detectable en SDS-PAGE a diferencia de los trabajos reportados por los grupos de Zang y de Ma.^{11,12,13,14,15} Aunque las estrategias de fusión en ocasiones han logrado incrementar los niveles de producción de la proteína recombinante y facilitan su posterior purificación no son rentables para un proceso de producción a escala industrial debido a que requeriría de grandes cantidades de enzima para separar la proteína de fusión de la proteína de interés.¹⁶

Igualmente, la identidad de la proteína L1Myc-His se verificó mediante western blot empleando el procedimiento previamente descrito por el grupo de Falero.¹⁷ Para lo cual se utilizaron los anticuerpos primarios anti-Myc (CB9E10, CIGB Sancti Spiritus, Cuba) diluido 1: 500 y anti-L1 (MAB 885, Merck USA) diluido 1: 50 000 en tampón PBS1XTween-20 0,05 % (PBST) y como secundario el anticuerpo de conejo anti-IgG de ratón conjugado con la enzima peroxidasa de rábano (CB10S0, CIGB Sancti Spiritus, Cuba) diluido 1:1 000 en PBST.

En la membrana de western blot, se observa una banda mayoritaria y otras de menor tamaño (Fig. 2. B y C), lo cual pudiera estar dado a causa del efecto combinado de la degradación proteolítica y terminaciones tempranas de la traducción,¹⁰ así como a la degradación proteolítica y a la presencia codones alternativos de inicio de la traducción en el genl1.15 Estos resultados confirman que la proteína expresada en E. coli Shuffle C3026/pETHPV16L1Myc-His corresponde a la proteína L1 de VPH 16 y que el epítope Myc y las seis histidinas se encontraban fusionados al extremo carboxilo terminal de la misma.

Fig.2

Análisis de la producción de la proteína L1Myc-His. Carriles 1 al 4, 5 μL de extractos celulares de E. coli Shuffle C3026/pETHPV16L1myc-His. Carril 5, 5 μL de extractos celulares de E. coli Shuffle C3026/pET28a (+). Carril 6, 3 μL del marcador de peso Broad Range Molecular Weight Markers (Promega) en kDa. A: análisis mediante SDS-PAGE al 10 % de acrilamida. B y C: Análisis mediante western blot con los anticuerpos monoclonales anti-L1 (MAB 885) 1: 50 000 y anti-Myc (CB9E10) 1: 2 000. De los resultados obtenidos se puede concluir que es posible expresar al gen l1 silvestre del virus del papiloma humano tipo 16 procedente de un aislado clínico cubano a niveles detectables en SDS-PAGE y western blot, lo cual constituye un reporte preliminar que brinda la posibilidad de contemplar a Escherichia coli Shuffle C3026 (DE3) como un posible hospedero para la producción de altos niveles de la proteína L1myc-6xHis en vista a la elaboración de un candidato vacunal.