INTRODUCCIÓN

La incidencia del adenocarcinoma esofágico (ADC) ha incrementado dramáticamente tanto en Estados Unidos como en Europa del este en las últimas décadas (Shaheen et al, 2000; Pera et al, 2005; Rubenstein et al, 2013). Las razones de este sustancial incremento aún son desconocidas, pero se han asociado al incremento en la incidencia de la enfermedad de reflujo gastro-esofágico (ERGE) y el esófago de Barrett (EB), reconocido como factor de riesgo fundamental en el desarrollo del ADC, a pesar de que los cambios moleculares implicados en la progresión de la ERGE a EB y al ADC aún no han sido completamente dilucidados (Chang et al, 2005). No obstante, lo que sí es conocido es que la evolución crónica de la ERGE representa el punto de inicio de la siguiente secuencia: ERGE, inflamación, EB, bajo grado de displasia, alto grado de displasia, carcinoma in situ y adenocarcinoma invasivo (Sikkema et al, 2010).

En este sentido, ha sido demostrado que la supresión de ácido en el tejido esofágico producto de la exposición del mismo al contenido duodenal que presenta características alcalinas constituye un factor fundamental en la génesis del EB y ADC (Orel y Vidmar, 2007; Kauer y Stein, 2010; Peng et al, 2011). Aunque la trasformación del tejido esofágico a EB forma parte de la progresión a la formación de ADC, este es considerado como un proceso adaptativo que ocurre como consecuencia de la resistencia a la apoptosis celular (Peters y Avosar, 2010), dependiendo de la severidad del daño (Miyashita et al, 2013).

Por otra parte, estudios moleculares sobre el proceso fisiopatológico de la esofagitis inducida por reflujo biliar han demostrado que los ácidos biliares (AB) activan la trascripción génica para la expresión de la enzima ciclooxigenasa-2 (COX-2) y la prostaglandina-E2 (PGE2) (Pizuelo et al, 2012), las cuales juegan un rol importante en los procesos inflamatorios (Hashimoto, 2012). Este hallazgo sustenta el hecho de que la administración de nimesulide (Oyama et al, 2007) y celecoxib (Zhang et al, 2012) (inhibidores específicos de la COX-2), e incluso la indometacina y la aspirina, a bajas dosis, (inhibidores inespecíficos de COX-1 y 2) (Esquivias et al, 2012; Selvan et al, 2012) ha resultado efectiva en la prevención de la formación de EB y adenocarcinoma en modelos experimentales de reflujo duodeno esofágico (RDE).

Independientemente de las causas que originan la ERGE, ya sea por reflujo gástrico, biliar o mixto, el tratamiento clásico son los antisecretores orientados al control de la sintomatología clínica, ya sea por reducir tanto la frecuencia como la acidez del contenido refluido. Sin embargo, la supresión del ácido mediante el uso de los inhibidores de la bomba de protones (IBP) (Kahrilas et al, 2008; Johnson et al, 2010; Pace et al, 2011; Yoshida et al, 2011), si bien mejora la sintomatología general de los pacientes con ERGE, no resulta eficaz en aquellos que presentan reflujo biliar (Kahrilas et al, 2011). Ejemplo de ello, lo constituyen fármacos como el pantoprazol y rabeprazol, (Duman et al, 2011; Duman et al, 2013) cuya ineficacia en este tipo de pacientes ha estado asociada a que secundariamente reducen el tono del esfínter inferior esofágico (Jankowski y Anderson, 2004). Además, ha sido reportado que estos IBP no favorecen la regresión de la formación de EB (Leedham y Jankowski, 2007; Sifrim y Zerbib, 2012).

El uso prolongado de los fármacos IBP es otro de los aspectos importantes que sugieren el fracaso de la terapia convencional de la ERGE debido a las reacciones adversas (Sifrim y Zerbib, 2012) que se presentan como la hipomagnesemia e hipomagnesuria (Hoorn et al, 2010; Thongon et al, 2011), el desarrollo de adenocarcinomas a causa del incremento de la gastrina (hipergastrinemia) infecciones entéricas por clostridiumdifficilerelacionadas con la supresión de ácido (Orlando et al, 2007; Garcia- Rodriguez et al, 2007), la ocurrencia de fracturas (Yang et al, 2006), complicaciones renales y respiratorias (Geevasinga et al 2006), así como la disminución de la biodisponibilidad de drogas dependientes del ácido gástrico (Silver-Matula et al, 2009). En este contexto, el reforzamiento con el uso de sustancias antioxidantes y citoprotectores gástricos, también han atenuado la esofagitis inducida por reflujo (Song et al, 2016). En consonancia con estos antecedentes, la búsqueda de nuevas alternativas terapéuticas para tratar la ERGE que sean eficaces y seguras constituye una problemática actual.

El D-002 es una mezcla de seis alcoholes alifáticos primarios de alto peso molecular obtenido de la cera de abejas (Apis mellifera), cuyo componente principal es el triacontanol, además del dotriacontanol, tetratriacontanol, tetracosanol, hexacosanol y octacosanol (Mas, 2001). El D-002 (25-200 mg/kg) administrado como dosis únicas y repetidas a ratas con esofagitis por RGE agudo y crónico ejerce un marcado efecto esófago-protector asociado a la disminución de las concentraciones de malondialdehído (MDA) y grupos sulfhídrilos (SH), marcadores de peroxidación lipídica y oxidación proteica, respectivamente, en tejido esofágico (Zamora et al, 2014; Zamora et al, 2015a). Por otra parte, el D-002 también mostró un efecto esófago-protector en el modelo de reflujo duodenal crónico, si bien resultó ineficaz en la esofagitis inducida por reflujo gastro-duodeno- esofágico (RGDE) (Zamora et al, 2015b). Teniendo en cuenta la eficacia del D-002 para prevenir el desarrollo de la esofagitis inducida por RDE demostrado macroscópicamente (Zamora et al, 2015b) y corroborado histológicamente (Noa et al, 2016) y el papel que juega el reflujo de tipo biliar en la progresión del daño esofágico a EB y la formación final de ADC, se considera como objetivo evaluar el efecto del D-002 sobre los cambios histológicos que ocurren durante la progresión de la esofagitis inducida por RDE crónico en ratas.

MATERIALES Y MÉTODOS

Animales

Se utilizaron ratas Sprague Dawley machos (250-300 g de peso corporal) provenientes del CENPALAB (Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio, Mayabeque, Cuba), las cuales fueron adaptadas durante siete días a las condiciones de laboratorio (temperatura de 20 a 25 0C, humedad relativa de 60 ± 10 %, ciclos de luz/oscuridad de 12 h) con libre acceso al agua y la comida.

Sustancias de estudio

El D-002 (lote: 030040109) fue obtenido en la Planta de Producción de Productos Naturales (CNIC, La Habana, Cuba), el Omeprazol (OMP) (lote: 0912027) y la Indometacina (lote: T15-184) ambos fueron suministrados por Laboratorios Novatec (La Habana, Cuba). El D-002, el OMP y la Indometacina se prepararon en forma de suspensión en goma acacia al 1 %.

Tratamientos y administración

Todos los tratamientos (vehículo, D-002, OMP e Indometacina) se administraron por vía oral (v.o) mediante entubación intragástrica (5 mL/kg) durante 16 semanas, comenzando 72 h después de inducido el RDE. Las ratas se distribuyeron en cinco grupos experimentales: un control negativo sin RDE (vehículo) y cuatro grupos a los cuales se les indujo el RDE: un grupo control positivo (vehículo), un grupo tratado con D-002 (200 mg/kg), y otros dos grupos tratados con Indometacina (2 mg/kg) y Omeprazol (20 mg/kg), como sustancias de referencia. Las dosis de D- 002 (Zamora et al, 2015a) y OMP (Zamora et al, 2015b) se seleccionaron teniendo en cuenta estudios previos de RDE mientras que la dosis de Indometacina se seleccionó según reportes de la literatura de su eficacia sobre la formación de ADC esofágico (Selvan et al, 2012) y cáncer colorectal (Brown et al, 2009) en roedores.

Inducción del reflujo duodeno esofágico

Los animales fueron sometidos a un período de ayuno de 24 h y se les retiró el agua entre las 6-8 h antes de la cirugía. Se les realizó la parotomía mediante una incisión en la línea media, previa anestesia con tiopental sódico (40 mg/kg), rasurado y desinfección del campo operatorio. De forma preventiva se administró una primera dosis de penicilina por vía intramuscular (150 000 UI/kg) antes de la cirugía y una segunda dosis 24 h después de la cirugía (Selvan et al, 2012). Posteriormente, se realizó la anastomosis del esófago con el duodeno, de forma término-terminal, con total gastrectomía para la inducción del RDE (Hashimoto, 2012).

Una vez concluida la cirugía, las ratas fueron mantenidas en ayuno durante 48 h con agua ad libitum y se les administró Dipirona (analgésico) 2 mg/kg por vía subcutánea, cada 24 h, durante las siguientes 72 h postquirúrgicas. Al término de las 16 semanas después de inducido el RDE y una vez concluido el tratamiento se les aplicó la eutanasia a los animales mediante sobredosis de anestésico (tiopental 100 mg/kg). Los esófagos fueron localizados y extraídos, se abrieron longitudinalmente y se cuantificó el área lesionada. Posteriormente, fueron conservados en formaldehido al 10 % para su posterior análisis histopatológico.

Mediciones a realizar

Se realizó el examen macroscópico del tejido esofágico bajo una lupa, y con una regla milimetrada se cuantificó el área total lesionada y se expresó en mm2 (Estêvâo-Costa et al, 1994).

El porciento de inhibición se calculó como sigue:

Donde:

ILE t = índice de lesiones del grupo tratado

ILE c = índice de lesiones del grupo control positivo

Análisis histopatológico del tejido esofágico

Los esófagos fueron lavados en solución salina (0,9 %), seguidamente fijados en disolución buffer de formaldehido (10 %) y embebidos en parafina. Posteriormente, se cortaron secciones del tejido que fueron teñidas con hematoxilina y eosina. Los tejidos fueron observados y analizados a ciegas, en un microscopio Carl Zeiss Primo Star, por un especialista en histopatología.

El Índice de Cambios Histológicos (ICH) se cuantificó teniendo en cuenta el puntaje descrito para la clasificación de los cambios histológicos que se producen en la progresión de la esofagitis crónica (Tabla 1). El valor del ICH es el resultado de la media de la sumatoria del puntaje de los cambios observados en la estructura del epitelio esofágico.

Análisis estadístico

La comparación entre grupos se realizó con el test paramétrico ensayo de Tukeys de comparaciones múltiples. A priori se estableció un nivel de significación a= 0,05 para la significación estadística. Los datos se procesaron con el paquete de programa GraphPadPrism para Windows (v. 5 Demo).

RESULTADOS Y DISCUSION

Los resultados obtenidos evidencian la eficacia del D-002 para reducir la extensión del daño esofágico, inducido por RDE crónico, sin provocar cambios en cuanto al daño histológico (tabla 2).

El grupo de animales designados como control positivo con RDE de 16 semanas de evolución, muestran un incremento significativo tanto del índice de lesiones esofágicas (ILE) como del ICH, con respecto al grupo control negativo, corroborando de esta forma la reproducibilidad del modelo experimental (Hashimoto, 2012; Selvan et al, 2012; Yoshida et al, 2011; Zamora et al, 2015a; Zamora et al, 2015b), bajo nuestras condiciones experimentales. Tal como se ha reportado, el RDE (16 semanas) desarrolla cambios histológicos en el tejido esofágico, tales como hiperplasia de la célula basal, metaplasia intestinal, displasia, adenocarcinoma y carcinoma escamoso, evaluados mediante el ICH (Selvan et al, 2012). Nuestros resultados, revelan que el 100 % de los animales del grupo control positivo desarrollaron en el tejido esofágico todos los cambios antes mencionados.

El tratamiento oral con D-002 a la dosis de 200 mg/kg redujo significativamente (40 % de inhibición) el ILE, en comparación con el grupo control positivo. Este resultado está en correspondencia con reportes anteriores, donde se demostró la acción esófago-protectora del D-002, en la esofagitis crónica inducida por el RDE (14 días de evolución) (Zamora et al, 2015b; Noa et al, 2016). Si bien, en cuanto al daño histológico en la esofagitis por RDE (16 semanas), la administración oral de D-002 lamentablemente no influyó sobre el ICH característicos de dicho modelo, a diferencia del estudio de esofagitis crónica inducida por el RDE (14 días) donde el D-002 revirtió el daño histológico (Noa et al, 2016).

Dentro de los procesos tumorogénicos y de metástasis de carcinomas, la COX-2 y la PGE2 juegan un papel fundamental mediante diferentes mecanismos. En este sentido ha sido demostrado que la expresión de COX 2 promueve la proliferación celular, mediante la activación de receptor del factor de crecimiento endotelial (RFCE) (Pai et al, 1995), la inhibición de la apoptosis mediante el incremento de la proteína Bcl-2 antiapoptótica (Tsujii y DuBais, 1995), y la supresión de la respuesta del sistema inmune (Sharman et al, 2003). Por otra parte, la COX-2 induce la angiogénesis, con la expresión del Factor de crecimiento de endotelio vascular (FCEV) () y facilita la metástasis mediante el incremento de la metaloproteínasas -2 (MMP-2) (Li et al, 2002; Tsujii et al, 1997). Por tanto, teóricamente, los antiinflamatorios no esteroidales (AINEs) y sustancias de origen natural (con acción sobre estos mediadores) pudieran ser candidatos como agente quimiopreventivo frente a la tumorogénesis, a través de la inhibición de la COX-2. En efecto, existen reportes del incremento de expresión de COX-2 y PGE2 en mucosa esofágica usando el modelo de reflujo Duodeno-gastro-esofágico y reflujo biliar (Zhang et al, 2001). Considerando, la influencia de la COX-2 dentro del proceso carcinogénico y que el D-002 ha demostrado inhibir dicha enzima (Pérez et al, 2014), nos plateamos como hipótesis de trabajo, que el D-002 pudiera influir sobre la progresión de la esofagitis hacia la formación de ADC, inducida por RDE. Sin embargo, nuestros resultados sobre el ICH no confirmaron dicha hipótesis, a pesar de evidenciar una reducción significativa del área esofágica superficial dañada (ILE). Considerando la primicia de este reporte, no descartamos la posibilidad de continuar profundizando en estos estudios con vistas a poder llegar a conclusiones más convincentes.

La administración de AINEs reduce el riesgo de cáncer en los órganos gastrointestinales incluyendo el esófago, estómago y colo-rectal (Brown et al, 2009; Farrow et al, 1998). Estudios preclínicos, previos, han sugerido que la indometacina y otros AINEs pueden poseer actividad anticancerígena (Thun et al, 2012), mientras que estudios in vitro han demostrado que la indometacina promueva la apoptosis de HCT116 línea de células de cáncer de colon (Kohli et al, 2004) y de células EC109 de línea celular de cáncer esofágico (Qin et al, 2015). Otro estudio in vivo ratificó que la aplicación de indometacina en forma de disolución disuelta en el agua de bebida de los animales con RDE, redujo a los cuatro meses de evolución el porcentaje de animales que desarrollaron metaplasia, displasia y adenocarcinoma esofágico en el modelo de RDE (Esquivias et al, 2012), asociado a una reducción de los niveles de PGE2.

Contradictoriamente, nuestros resultados no se corresponden con los anteriores, pues los animales que recibieron indometacina (2 mg/kg) por vía oral mediante gavage, si bien redujo significativamente el área esofágica dañada (35,6 %), no produjo cambios significativos en cuanto al desarrollo de los cambios histológicos de EB hacia ADC, ya que el 85 % de los animales presentaron ADC característicos de la esofagitis crónica inducida por RDE de 16 semanas de evolución (tabla 2), resultado que no se corresponde con los alcanzados por Esquivias et al. (2012).

De forma similar, el tratamiento con OMP (20 mg/kg), clásico IBP, capaz de reducir algunos componentes de los AB refluidos (Sital et al, 2006), acción que sustenta su uso como fármaco de referencia, redujo significativamente (50 % de inhibición) el ILE, respecto al grupo control positivo, sin que esto implicara cambios significativos en cuanto al ICH, a diferencia de lo evidenciado en el modelo de RDE de 14 días de evolución (Noa et al, 2016).

Los AB presentes en el contenido duodenal refluido hacia el esófago son cruciales en la transformación patológica de EB en ADC, ya que activan la proteína kinasa C que induce la transcripción génica para la expresión de la enzima ciclooxigenasa 2 (COX- 2) (Hashimoto, 2012). Considerando que la enzima ciclooxigenasa 2 (COX- 2), se encuentra involucrada en el desarrollo de la esofagitis (Sital et al, 2006; Piazuelo et al, 2012) inducida por RDE, se puede sugerir que la acción beneficiosa del D-002 pudiera estar, en parte, determinado por su efecto antinflamatorio 54 mediado por la inhibición de esta enzima (Sharman et al, 2003), afirmación que debe ser demostrada en estudios posteriores de RDE.

Sin embargo, los resultados histológicos no sustentan esta vía de acción del D-002 sobre la progresión del EB hacia ADC ya que el 63 % de los animales tratados con D-002 presentaron formación de carcinomas escamoso; no evidenciándose así la reversión de la progresión del EB hacia ADC por parte del tratamiento oral con D- 002. Este resultado nos sugiere que otros mecanismos involucrados en este proceso no son modificables por el D-002, si bien estudios posteriores deberán profundizar en este sentido. Hasta el momento, las evidencias indican que el D-002 es capaz de ejercer una protección sobre la mucosa esofágica frente a la esofagitis inducida por el RGE agudo y crónico (Zamora et al, 2014; Zamora et al, 2015a) y por el RDE crónico (14 días) (Zamora et al, 2015b). Sin embargo, no fue capaz de proteger la esofagitis inducida por el reflujo duodeno gastro-esofágico (RDGE) (Zamora et al, 2015b) donde el daño es potencialmente mayor dada la presencia de reflujo ácido y biliar (mixto) (Aak et al, 2008).

En correspondencia con estos resultados, el presente estudio demostró que el daño histológico inducido por el RDE durante 16 semanas, caracterizado por la formación de EB (metaplasia intestinal) como fase inicial de la progresión del tejido hacia la formación de ADC y carcinoma escamoso, fue de tal severidad que los mecanismos antiinflamatorios y antioxidantes del D-002, no fueron suficientes como para revertirlos. Sin embargo, el tratamiento con D-002 redujo significativamente la extensión del área esofágica lesionada (ILE), evaluada macroscópicamente, sin que existieran diferencias significativas con respecto a las dos sustancias de referencias empleadas en el estudio (OMP e indometacina).

Por lo tanto, consideramos que el D-002 es un producto natural, con efectos antioxidantes y antiinflamatorios, efectivo y eficaz contra los procesos inflamatorios esofágicos ya sea administrado solo o en combinación; independientemente de que el D-002 no haya evidenciado reversión del progreso del daño histológico de la esofagitis hacia la formación de ADC inducida por RDE evaluado a las 16 semanas, máxime si tenemos en cuenta que si demostró reducir la extensión del área dañada y que antecedentes previos han demostrado los beneficios del tratamiento con D-002 sobre la esofagitis.

CONCLUSIONES

La administración oral de D-002 puede ser utilizado como tratamiento a largo plazo en la esofagitis por reflujo duodenal, a pesar de no revertir la progresión de los cambios histológicos del tejido esofágico.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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