INTRODUCCIÓN

El cáncer de cuello uterino (CCU) es la tercera neoplasia maligna más frecuente en la población femenina a nivel mundial (Maleki, 2016; Lowy, 2016). Su incidencia es de aproximadamente 530 000 nuevos casos por año, de los cuales el 80% tiene lugar en países en vías de desarrollo (Bruni et al. 2017a). Aproximadamente el 99,7 % de los casos de CCU están asociados a la infección por el virus del papiloma humano (VPH). Además, la infección por el VPH es considerada la enfermedad de transmisión sexual más común en el mundo. Existen más de 200 tipos de VPH, de los cuales solo un pequeño grupo, considerado como de alto riesgo oncogénico, está asociado a otros tipos de cáncer (Maleki, 2016; Lowy, 2016). Estos genotipos son detectados en el 90 % de los casos de cáncer anal, 40 % de los de órganos genitales externos (vulva, vagina y pene) y al menos en el 20 % de los orofaríngeos (Herrero et al. 2015). Particularmente, los genotipos 16 y 18 son identificados como los de mayor prevalencia y responsables del 70% de los casos de CCU a nivel mundial (de Sanjose et al. 2010). Debido a la elevada carga de las enfermedades relacionadas con el VPH, la Organización Mundial de la Salud (OMS) las reconoce como problemas de la salud pública mundial y ha reiterado la recomendación de que la vacunación contra el VPH se incluya en los programas nacionales de inmunización (OMS, 2017).

Los VPH constituyen un grupo diverso de virus pertenecientes a la familia Papillomaviridae. Son pequeños, no envueltos, con un genoma de ADN bicatenario, de estructura icosaédrica compuesta por 72 capsómeros pentaméricos y agrupados en una organización triangular T=7. Los capsómeros están constituidos por dos proteínas estructurales: L2 y L1, esta última como componente mayoritario. Precisamente, las vacunas profilácticas contra el VPH se basan en la antigenicidad de la proteína L1 (Burk et al. 2009). Cuando esta proteína es producida en sistemas in vitro, tiene la capacidad de auto-ensamblarse, adquiriendo una conformación estructural y antigénica similar al virus nativo, pero no infestan al epitelio estratificado de la piel y mucosas en humanos. Tales estructuras se conocen con el nombre de partículas semejantes a virus (VLPs, del inglés virus-like particles) y han demostrado ser inmunogénicas, bien toleradas y protectoras durante los años de implementación (Lowy, 2016; Schwarz et al. 2017; Huh et al. 2017).

En la actualidad existen tres vacunas comerciales para prevenir la infección del VPH: Gardasil®, Gardasil®9 y Cervarix®, las cuales se obtienen en sistemas eucariontes y ofrecen cerca de un 100% de protección contra las infecciones reincidentes causadas por distintos tipos de VPH. Sin embargo, sus altos costos afectan su disponibilidad para las poblaciones de riesgo de países en vías de desarrollo (de Martel et al. 2017). Debido a esta situación, se han desarrollado nuevos candidatos vacunales, entre los que se encuentran los basados en las VLPs o los capsómeros, ensamblados a partir de la proteína L1 obtenida en sistemas bacterianos (Kumar et al. 2015; Gupta et al. 2017).

Escherichia coli es el sistema bacteriano más utilizado para la caracterización estructural de la proteína L1 del VPH. En la mayor parte de los estudios, las proteínas L1 de los genotipos 16 y 11 han sido obtenidas fusionadas a la glutatión- S-transferasa (GST), debido a que este tipo de fusión promueve el plegamiento y mayor solubilidad de las proteínas recombinantes en E. coli (Chen et al. 2001; Hanslip et al. 2006; Bang et al. 2016; Bishop et al. 2007). Particularmente, la expresión del gen L1 del tipo 18 del VPH (VPH-18) solo ha sido abordada en dos trabajos y en cepas de E. coli con genotipo deficiente de proteasas. Seo et al. (2009) la obtuvieron fusionada a GST en E. coli BL21(DE3), mientras que Gu y cols. (2017) la produjeron con una deleción de cuatro residuos de aminoácidos por el extremo amino en E. coli ER2556. Este último estudio forma parte del proyecto de la compañía Xiamen Innovax Biotech (Xiamen, China) encaminado al desarrollo de una vacuna bivalente contra los genotipos 16 y 18 (Gu et al. 2017). Este candidato vacunal actualmente se encuentra cursando un ensayo clínico fase 3 de eficacia y es el candidato más avanzado hasta el momento (ClinicalTrials.gov NCT01735006).

Una de las ventajas de utilizar a E. coli como sistema hospedero es la gran variedad de cepas disponibles, mejoradas genéticamente, con el propósito de alcanzar altos rendimientos y elevada calidad de las proteínas recombinantes. Entre ellas destaca E. coli Origami (Novagen, EE.UU.), cuyo citoplasma fue ingenierizado a través de una doble mutación en los genes del sistema tiorredoxina - glutarredoxina para promover la formación de puentes disulfuro en el citoplasma (Berkmen, 2012; Rosano y Ceccarelli, 2014). E. coli Rosetta, con su uso de codones modificado para suministrar seis ARNt para codones raros, también ha sido útil para la expresión de genes con una representación significativa de codones empleados con baja frecuencia en E. coli (Guevara-Hernández et al. 2013).

En Cuba, el CCU representa la cuarta causa de muerte por tumores malignos en las mujeres y es el de mayor incidencia de muerte por cáncer en mujeres en edades comprendidas entre los 15 y 44 años de edad (Bruni et al. 2017b). En estudios epidemiológicos moleculares se ha identificado la circulación de genotipos oncogénicos de VPH en muestras poblacionales en La Habana, Cuba (Soto et al. 2007; Ríos et al. 2010). En los trabajos más recientes han estudiado 519 mujeres entre 15 y 59 años con citología negativa previa (Soto et al. 2016a), 322 mujeres mayores de 30 años con citología positiva (Soto et al. 2014), 56 hombres seropositivos a VIH (Limia et al. 2017) y 63 pacientes con tumores colorrectales (Soto et al. 2016b). Dichos estudios han encontrado una frecuencia elevada de infección por el VPH, por encima de 50%, en las muestras anogenitales, donde los genotipos oncogénicos 16, 18, 31, 45, 52 y 58 fueron los más frecuentes. Además, la carga viral de HPV 16, 18 y 58 se asoció con el incremento de la severidad de las lesiones cervicales (Soto et al, 2017). En concordancia con los resultados obtenidos, los estudios sustentan la introducción de la vacunación preventiva contra el VPH en la población adolescente cubana, lo cual no ha sido posible debido al elevado precio de las vacunas. Por esta razón se hace necesario la identificación de alternativas que faciliten a largo plazo la disponibilidad de vacunas contra el VPH en Cuba.

Teniendo en consideración que en Cuba el VPH-18 se encuentra entre los tres genotipos de mayor prevalencia y que no existen informes previos de la producción de la proteína L1 del genotipo 18 del VPH en cepas de E. coli genéticamente mejoradas, en este trabajo nos propusimos como objetivo: Evaluar la expresión del gen L1 del VPH-18, clonado a partir de ADN total de una muestra clínica cubana, en las cepas de E. coli BL21(DE3), Origami(DE3) y Rosetta(DE3)pLysS.

MATERIALES Y MÉTODOS

Materiales

Las diferentes cepas de E. coli y plasmidios utilizados en este trabajo se presentan en la Tabla 1.

Medios de cultivo

Para el crecimiento de las cepas de E. coli se utilizaron los medio complejos Luria- Bertani (LB, Sambrook et al. 1989) y Terrific Broth (TB; Studier, 2005). Cuando fue necesario, los medios de cultivo se suplementaron con kanamicina a 100 μg/mL.

Enzimas, anticuerpos y reactivos

Todas las enzimas de modificación-restricción se adquirieron de Promega (EE.UU.). Se utilizó el anticuerpo monoclonal anti-Histidina (anti-His), producido en ratón y conjugado a la peroxidasa de rábano (A7058, Sigma, EE.UU., diluido 1: 2 000), el anticuerpo monoclonal anti-VPH-16 L1 de ratón (clon CamVir-1, Merck, EE. UU., diluido 1:15 000) y como secundario el anticuerpo de conejo anti-IgG de ratón conjugado con la enzima peroxidasa de rábano (CB10S0, CIGB Sancti Spiritus, Cuba, diluido 1:1000).

MÉTODOS

Métodos de Biología Molecular

La preparación y transformación de las células competentes de E. coli, el pesquisaje de los transformantes y las reacciones de digestión y modificación de ADN se realizaron según procedimientos descritos por Sambrook et al. (1989).

Análisis de secuencia del gen L1 del VPH-18

Los análisis del uso de codones en la secuencia nucleotídica del gen L1 del VPH-18 se realizaron con las herramientas bioinformáticas ATGme (http://atgme.org/; Daniel et al. 2015) y E. coli Codon Usage Analyzer 2.1 (http://www.faculty.ucr.edu/~mmaduro/codonusage/usage.htm; (Henaut y Danchin, 1996). La secuencia aminoacídica deducida a partir de la secuencia nucleotídica se analizó mediante el paquete bioinformático Vector NTI suite 6000 (InforMax, Inc. EE.UU).

Para estimar la velocidad de inicio de la traducción de la construcción genética se utilizó el algoritmo de ingeniería reversa del calculador bioinformático RBS Calculator (https://salislab.net/software/. Salis et al. 2009).

Subclonaje del gen L1 del VPH-18 en el vector de expresión pET-28a

El gen L1, de 1521 pb, se extrajo del pGEM-T Easy-HPV-18L1 (Tabla 1) por digestión con las enzimas NdeI y BglII y se ligó al vector pET-28a, previamente digerido con las mismas enzimas. Posteriormente la mezcla de ligazón se transformó en células competentes de E. coli Match-1. El ADN plasmídico de los transformantes se purificó mediante el estuche Wizard® Plus SV Minipreps DNA purification system (Promega, EE.UU.). Tres de los clones recombinantes seleccionados se transformaron inicialmente en células competentes de E. coli BL21(DE3). Posteriormente, el derivado del pET28a se introdujo en E. coli Rosetta(DE3)pLysS y E. coli Origami DE3 (Tabla 1). Cuatro de los transformantes derivados de cada cepa se conservaron en LB-glicerol a -70°C hasta el análisis de la expresión génica.

Cultivo de E. coli para la inducción de la expresión del gen L1

Los transformantes se inocularon en preinóculos de 5 mL de medio TB y se mantuvieron durante la noche a 30 ºC y 220 rev min-1 en una zaranda orbital termostatada (New Brunswick Scientific Co. Inc. EE. UU.). Para los estudios de expresión, 100 μL de cada precultivo se inocularon en 5 mL de medio TB y se incubaron a 30 ºC y 220 rev min-1 hasta alcanzar 0,6 - 0,8 unidades de DO600, momento en el cual se adicionó IPTG a una concentración de 0,1 mmol/L por 4 h. Culminado el tiempo de inducción, se centrifugó 1 mL de las células y el precipitado celular se conservó a -20 °C hasta su análisis. Para homogenizar los extractos celulares se adicionó un volumen de tampón PBS (Sambrook et al. 1989) a la biomasa para alcanzar una DO600 final de 6,5.

Procedimientos utilizados en el trabajo con proteínas

Las electroforesis desnaturalizantes en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) se realizaron según Laemmli (1970), utilizando geles al 10 % de acrilamida. En los ensayos de inmunodetección, las muestras separadas electroforéticamente se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Protran Whatman GmbH, Alemania) empleando un sistema de transferencia húmedo (Bio-Rad, EE.UU.). Posteriormente, las membranas se incubaron en solución de bloqueo (leche descremada al 5 % (m/v) en solución de PBS) durante 30 min y se incubaron con los anticuerpos durante 2 h a temperatura ambiente (TA). Finalmente, las membranas lavadas, se revelaron con 3,3´-diaminobencidina al 0,0125 % (m/v) y H2O2 al 0,1 % (v/v) en solución amortiguadora Tris-HCl pH 7,6.

Las imágenes de cada gel o membrana se capturaron mediante un sistema de escáner Canon Image Runner 1023N (Japón). El análisis de densitometría de imágenes para la estimación del peso molecular o de las cantidades producidas de la banda correspondiente a la proteína de interés se realizó mediante el programa Gel Analyzer 2010 (Lazar et al. 2010).

Procedimiento para evaluar la solubilidad de la proteína recombinante

Los precipitados celulares correspondientes a 1 mL de cultivo se resuspendieron en 57 μL de una solución tamponada compuesta por sacarosa 10 % (m/v) y Tris-HCI 50 mmol/L pH 8. Posteriormente se adicionó 19 μL de lisozima y se incubó por 15 min a TA. A continuación se añadió 76 μL de Tritón X-100 0,2 % (v/v), EDTA 50 mmol/L y Tris-HCl 50 mmol/L pH 8, se homogenizó y se incubó por 5 min a TA. La mezcla se sometió a 3 ciclos de congelación-descongelación, seguido de centrifugación a 13 000 r/min durante 5 min. El sedimento obtenido se lavó con una solución de EDTA 25 mmol/L y Tris HCl 20 mmol/L pH 8 y se centrifugó a 13 000 r/min durante 5 min y la fracción insoluble se resuspendió en 167 μL de la misma solución.

Detección de cuerpos de inclusión en E. coli recombinante por microscopía electrónica de transmisión (TEM)

Las células de E. coli se fijaron en glutaraldehído 2 % en tampón fosfato de sodio 0,1 M, pH 7,2 durante una noche; se post-fijaron en tetróxido de osmio 1 % por dos horas; se deshidrataron en disoluciones seriadas de acetona y se incluyeron en resina Spurr. Se obtuvieron cortes ultrafinos, los cuales se contrastaron con acetato de uranilo y citrato de plomo y luego se observaron con un microscopio electrónico de transmisión Jeol JEM 1011 (JEOL, Japón) a 20 000 X.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Subclonaje del gen L1 del VPH-18 en el plasmidio pET28a

Para evaluar la expresión del gen L1 del VPH-18, aislado de una muestra clínica de una paciente diagnosticada con CCU por infección por este genotipo, en E. coli se seleccionó al promotor T7lac. Este promotor híbrido ha sido utilizado satisfactoriamente para dirigir la expresión de los genes L1 del VPH-16 (Zhang et al. 1998; Wei et al. 2009) y del VPH-11 en E. coli (Yan et al. 2009). La estimación teórica de la velocidad de inicio de la traducción del gen L1 insertado en el pET28a, que permite la fusión del extremo 5’ del gen L1 a una región de 20 codones codificantes para un fragmento de la proteína principal de la cápsida del fago T7 e incluye una secuencia codificadora de una etiqueta de seis histidinas, mediante la herramienta RBS Calculator fue 28 855,1 ua; valor que se considera adecuado para obtener elevados niveles de síntesis proteica (Speer, 2018). Teniendo en cuenta este resultado teórico y con la finalidad de promover que las maquinarias de transcripción y traducción se encontrasen con secuencias 5´ y amino compatibles con una síntesis eficiente del ARNm y de la proteína recombinante, respectivamente, se obtuvo una construcción plasmídica con el gen L1 insertado en el vector pET-28a, la cual se denominó pET28a-HPV-18 L1-tag (Fig. 1A). El plasmidio obtenido codifica para una proteína L1 fusionada por su extremo amino a una etiqueta de seis histidinas (VPH-18 L1-tag).

En la Figura 1B se muestran los resultados representativos de la digestión de un clon del plasmidio pET28a-HPV-18L1-tag con las enzimas BamH I, Nco I, Pst I y Kpn I. La digestión con la enzima Nco I dio lugar a dos bandas, las cuales se corresponden con los fragmentos de 6177 y 681 pb, que identifican a un sitio Nco I interno al gen L1 y otro externo (Fig. 1B, carril 2). Al digerir el plasmidio de interés con las enzimas BamH I y Kpn I, se obtuvieron dos bandas, que se corresponden con los fragmentos esperados de 6194 y 664 pb (Fig. 1B, carril 3). En la digestión con la enzima Pst I se obtuvieron tres bandas, que se corresponden con los fragmentos de 5862, 555 y 441 pb, que identifican a los tres sitios de corte Pst I internos al gen L1 (Fig. 1B, carril 4). De acuerdo al análisis realizado con el Vector NTI suite 6000 (InforMax, Inc. EE.UU.), la proteína VPH-18 L1-tag tiene una talla molecular teórica de 58,8 kDa y debe poseer un total de 527 aa.

Expresión del gen L1 del VPH-18, fusionado a una secuencia codificadora de una cola de histidinas, en E. coli BL21(DE3)

El plasmidio pET28a-HPV-18 L1-tag se introdujo inicialmente en E. coli BL21 (DE3). Al realizar la inducción de la proteína recombinante con IPTG, una banda intensa de ~ 57 kDa se detectó en los extractos celulares de los transformantes con el plasmidio pET28a-HPV-18 L1-tag (Fig. 2A, carriles 2 al 4). Paralelamente, se determinó que la talla molecular de las bandas inducidas observadas por SDS- PAGE coincidieron con la banda inmunoreactiva de mayor talla detectada mediante Western blot con el anticuerpo CamVir-1, lo cual confirmó la identidad de la proteína L1 del VPH-18 evaluada (Fig. 2B, carriles 2 al 4). La presencia de la secuencia blanco de seis histidinas, fusionada al extremo amino de la proteína L1, también fue detectada mediante inmunoreacción con un anticuerpo anti-His (Fig. 2C, carriles 2 al 4). Como era de esperar, no se detectó ninguna banda inmunoreactiva en el extracto celular de la cepa transformada con el vector en contacto con el inductor (Fig. 2 B y 2C, carril 1).

Durante la producción de las proteínas recombinantes en E. coli, uno de los principales retos es obtener la proteína en forma soluble y funcional, por lo que a continuación se evaluó la solubilidad de la proteína L1 del VPH-18, fusionada a la cola de histidinas, cuando fue inducida a bajas concentraciones de IPTG (0,1 mM) en E. coli BL21(DE3) [pET28a-HPV-18 L1-tag]. De acuerdo a los resultados obtenidos por Western blot con el anticuerpo anti-His, solamente se detectaron bandas inmunorreactivas en la fracción insoluble y mayoritariamente una banda de aproximadamente 57 kDa, valor cercano al peso molecular esperado de la proteína VPH-18 L1-tag (58,8 kDa) (Fig.3, carril 3). Estos resultados sugirieron que probablemente la proteína se encontraba formando agregados insolubles o depositada en cuerpos de inclusión (CI).

El análisis de las células de E. coli BL21(DE3) [pET28a-HPV-18 L1-tag] mediante TEM reveló la presencia de CI (Fig.4), lo cual sugiere que la proteína L1 del VPH 18 se deposita en estas estructuras intracelulares. La agregación de la proteína L1 del VPH en los CI de bacterias se ha estudiado fundamentalmente para la proteína L1 del genotipo 16 (Zhang et al. 1998; Kelsall y Kulski, 1995; Nardelli-Haefliger et al. 1997; Ma et al. 2007) y se ha evaluado su posterior extracción, renaturalización y purificación mediante cromatografías de intercambio iónico (Zhang et al. 1998; Kelsall y Kulski, 1995) o IMAC (del inglés, Immobilized Metal Affinity Chromatography) a partir de E. coli (Choe et al. 2003; Di Bonito et al. 2006; Lai y Middelberg, 2002). En los trabajos informados por Zhang et al (1998) y Lai y Middelberg (2002), que purifican la proteína L1 mediante cromatografías de intercambio catiónico e IMAC, respectivamente, la proteína L1 purificada fue capaz de auto-ensamblarse en capsómeros y VLPs. Las VLPs obtenidas fueron reconocidas por el anticuerpo monoclonal H16 V5, que solo reconoce las del genotipo 16 nativas, sugiriendo la presencia de epítopos neutralizantes dominantes.

Producción de la proteína L1 del VPH-18 por cepas hospederas de E. coli

Teniendo en consideración que el gen L1 del VPH-18, del aislado clínico cubano, contiene 14 codones que codifican para residuos de cisteína, potencialmente capaces de interactuar por medio de enlaces disulfuro (Ishii et al. 2003), en este trabajo se seleccionó a E. coli Origami como hospedero para evaluar la producción de la proteína L1, dado que esta cepa posee una doble mutación en los genes del sistema tiorredoxina - glutarredoxina para promover la formación de puentes disulfuro en su citoplasma. Particularmente, la cepa FÅ113 (trxB, gor, ahpC*) utilizada ha sido satisfactoriamente empleada para producir varias proteínas con puentes disulfuros en dicho compartimento (Kumano-Kuramochi et al. 2007, Drees et al. 2008, Xu et al. 2008).

La cepa E. coli Rosetta también se seleccionó para evaluar la obtención de la proteína L1 del VPH-18, dado que al examinar el uso de codones en la secuencia nucleotídica del gen L1 del VPH-18, mediante el empleo del programa bioinformático ATGme, se detectaron un total de 122 codones raros y 13 codones muy raros; lo que representa aproximadamente un 24 % de la secuencia del gen. En particular, se detectaron 15 agrupamientos de codones raros, dos de ellos ubicados hacia el extremo 5´ del gen. Estos resultados se sustentaron con otra herramienta bioinformática: E. coli Codon Usage Analyzer 2.1. Este último análisis indicó la presencia de 90 codones raros, lo que representa aproximadamente un 18 % de la secuencia total. Además, se identificaron 10 agrupamientos de codones raros. Ambas herramientas permitieron identificar simultáneamente a 49 codones empleados con una frecuencia baja en E. coli, que representa un 9,6 % aproximadamente respecto a la secuencia total.

Considerando el análisis anterior, el plasmidio pET28a-HPV-18 L1-tag se introdujo en las dos cepas de E. coli seleccionadas y la inducción de la expresión del gen L1 del VPH-18 se llevó a cabo en el mismo medio de cultivo y en las mismas condiciones en que anteriormente se evaluó la producción de la proteína L1 en E. coli BL21 (DE3). En dichas condiciones, E. coli BL21 produjo al menos dos veces mayor cantidad de la proteína L1 del VPH-18 que la producida por E. coli Origami (DE3) (Fig. 5, carriles 1vs 7), de acuerdo a análisis densitométrico del Western blot. E. coli Rosetta (DE3) pLysS produjo la menor cantidad de proteína L1 recombinante, solamente detectable por Western blot (Figura 5, carril 4), a pesar de que esta cepa tiene la ventaja de expresar seis ARNts para los codones: AUA, AGG, AGA, CUA, CCC y GGA, todos representados en la secuencia del gen L1 evaluado. La cepa E. coli Rosetta (DE3) pLysS ha sido un hospedero útil para la expresión de genes L1 de VPH alfas de especies cutáneas, con deleciones por ambos extremos (Senger et al. 2010) y también de los genes L1 del VPH-16 y 18 (Liu et al. 2013), pero cuando estos han sido clonados en el sistema de plasmidios pGEX para obtener las proteínas L1 fusionadas a la secuencia blanco GST. Esta estrategia permitió la obtención de las proteínas L1 mayormente en la fracción soluble del citoplasma. Sin embargo, en el presente trabajo no se siguió una estrategia de fusión a la secuencia blanco GST dado nuestro interés en evitar posibles complicaciones potenciales relacionadas con el corte de la secuencia blanco GST y su posterior purificación. Además, se ha informado sobre la formación de agregados mayormente insolubles de la proteína L1, posterior a la remoción de la etiqueta GST en E. coli (Senger et al. 2010).

En este estudio, la proteína VPH-18 L1 se detectó solamente en la fracción insoluble de Rosetta (DE3) pLysS, (Fig. 5, carril 6), de forma similar a su expresión en E. coli BL21 (DE3). Se ha especulado que la agregación de las proteínas recombinantes en cepas de E. coli que tienen su codon-bias ajustado puede deberse a la suplementación de los ARNts de codones raros, lo cual puede provocar la eliminación de pausas de traducción necesarias para el plegamiento y estabilidad de la proteína de interés (Rosano y Ceccarelli, 2009). Como perspectiva futura queda abierta la posibilidad de evaluar las potencialidades de un gen L1 del VPH-18 de origen sintético, con uso armonizado de codones, para la obtención de la proteína de interés con mayores rendimientos. No obstante, Chen et al. (2016) no detectaron expresión de un gen L1 del VPH-16 con uso optimizado de codones para E. coli, el cual se clonó en el plasmidio pET-28a, fusionado a las secuencias codificadoras de la cola de histidina y de la proteína principal de la cápsida del fagoT7.

De acuerdo a los análisis densitométricos realizados a las membranas de Western blot, E. coli Origami (DE3) produjo dos veces cantidades menores de la proteína L1 que las producidas por E. coli BL21 (DE3). La cepa Origami fue seleccionada para evaluar su capacidad de catalizar la formación de los puentes disulfuros en el citoplasma, bajo condiciones de inducción de la expresión y temperatura, que pudieran favorecer la obtención soluble de la proteína L1, considerando que recientemente Bang et al (2016) utilizaron diez veces mayor concentración del inductor IPTG y temperatura de 37 °C y obtuvieron la proteína L1 del VPH-16 en la fracción insoluble de E. coli Origami. Existe el consenso que bajos niveles del inductor y temperaturas reducidas durante la inducción puede promover la solubilidad de las proteínas recombinantes en E. coli (Gopal y Kumar, 2013; Gupta y Shukla, 2016) requisito necesario para que la cepa Origami pueda catalizar la formación de los puentes disulfuro de la proteína (Berkmen, 2012). A su vez, los enlances disulfuros son requeridos para el plegamiento y la estabilidad de los dominios de la proteína de interés y en ocasiones son importantes para la solubilidad de la proteína (Drees et al. 2008).

De forma similar a E. coli BL21 (DE3) y E. coli Rosetta (DE3) pLysS, la proteína VPH-18 L1-tag se detectó depositada en la fracción insoluble de E. coli Origami (DE3) (Fig. 5, carril 3); por lo que considerando los niveles de expresión de la proteína VPH-18 L1-tag, E. coli BL21 (DE3) es el hospedero más atractivo para su producción. Estos resultados fueron similares a los informados por autores que utilizaron genes ricos en codones codificantes para cisteínas y con uso optimizado de codones para E. coli, como Bang y cols (2016) en el que la cepa más productora de la proteína L1 del VPH-16 fue E. coli BL21(DE3), o la proteína reteplasa, también mejor producida por E. coli BL21 (Fathi-Roudsari et al. 2016).

En experimentos futuros se evaluará el efecto de condiciones de solubilización más suaves, que puedan favorecer el proceso de purificación de la proteína en estado funcional, a partir de los CI producidos en el citoplasma ingenierizado de E. coli Origami (DE3) pET28a-HPV-18 L1-tag, respecto a los de E. coli BL21. Se ha informado sobre la presencia de estructuras plegadas y variantes semejantes a la nativa entre los intermediarios y agregados amiloides de algunas proteínas en CI en E. coli (García-Fruitós et al. 2005, Peternel et al. 2008, Rinas et al. 2017) lo cual ha permitido utilizar condiciones de solubilización menos agresivas, que han conducido a mayores recobrados de las proteínas funcionales a partir de los CI (Singh y Panda, 2005; Singh et al. 2015). Hasta nuestro conocimiento, un estudio comparativo de este tipo no se ha realizado a partir de los CI aislados de ambas cepas y por ello, nuestro grupo evalúa esta alternativa.

CONCLUSIONES

En este trabajo, un gen L1 del VPH-18, aislado de una muestra cervical de una paciente cubana, se expresó en E. coli cuando el promotor T7lac dirigió su expresión génica. E. coli BL21 fue la cepa hospedero que produjo mayores cantidades de la proteína L1 del VPH-18, al menos 2 veces más que las producidas por E. coliOrigami (DE3). E. coli Rosetta (DE3) pLysS produjo los menores niveles de la proteína L1 del VPH-18, inferiores al límite de detección de la técnica de SDS-PAGE convencional. Hasta nuestro conocimiento, no existen informes previos de la expresión de un gen L1 nativo del VPH-18, fusionado a una secuencia codificadora de una etiqueta de seis histidinas, por cepas ingenierizadas de E. coli. En las tres cepas estudiadas, la proteína L1 se detectó en la fracción insoluble del citoplasma y particularmente el análisis de las células de E. coli BL21(DE3) mediante TEM sugirió la agregación de la proteína L1 del VPH-18 en cuerpos de inclusión Considerando los trabajos previos que informan sobre la purificación y caracterización satisfactoria de la proteína L1 del VPH-16 a partir de CI de E. coli, en el futuro será necesario establecer las condiciones de extracción y purificación de la proteína L1 del VPH-18 a partir de la cepa de E. coli que ofrezca las condiciones de solubilización más favorables para la conservación de la actividad del producto final.

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