Las diferentes cepas de E. coli y plasmidios utilizados en este trabajo se presentan en la Tabla 1.

Tabla 1
Cepas de E. coli y plasmidios utilizados.

Nota: CamR, AmpR y KnR: confiere resistencia a cloranfenicol, ampicilina y kanamicina, respectivamente.

Para el crecimiento de las cepas de E. coli se utilizaron los medio complejos Luria- Bertani (LB, Sambrook et al. 1989) y Terrific Broth (TB; Studier, 2005). Cuando fue necesario, los medios de cultivo se suplementaron con kanamicina a 100 μg/mL.

Todas las enzimas de modificación-restricción se adquirieron de Promega (EE.UU.). Se utilizó el anticuerpo monoclonal anti-Histidina (anti-His), producido en ratón y conjugado a la peroxidasa de rábano (A7058, Sigma, EE.UU., diluido 1: 2 000), el anticuerpo monoclonal anti-VPH-16 L1 de ratón (clon CamVir-1, Merck, EE. UU., diluido 1:15 000) y como secundario el anticuerpo de conejo anti-IgG de ratón conjugado con la enzima peroxidasa de rábano (CB10S0, CIGB Sancti Spiritus, Cuba, diluido 1:1000).

La preparación y transformación de las células competentes de E. coli, el pesquisaje de los transformantes y las reacciones de digestión y modificación de ADN se realizaron según procedimientos descritos por Sambrook et al. (1989).

Los análisis del uso de codones en la secuencia nucleotídica del gen L1 del VPH-18 se realizaron con las herramientas bioinformáticas ATGme (http://atgme.org/; Daniel et al. 2015) y E. coli Codon Usage Analyzer 2.1 (http://www.faculty.ucr.edu/~mmaduro/codonusage/usage.htm; (Henaut y Danchin, 1996). La secuencia aminoacídica deducida a partir de la secuencia nucleotídica se analizó mediante el paquete bioinformático Vector NTI suite 6000 (InforMax, Inc. EE.UU).

Para estimar la velocidad de inicio de la traducción de la construcción genética se utilizó el algoritmo de ingeniería reversa del calculador bioinformático RBS Calculator (https://salislab.net/software/. Salis et al. 2009).

El gen L1, de 1521 pb, se extrajo del pGEM-T Easy-HPV-18L1 (Tabla 1) por digestión con las enzimas NdeI y BglII y se ligó al vector pET-28a, previamente digerido con las mismas enzimas. Posteriormente la mezcla de ligazón se transformó en células competentes de E. coli Match-1. El ADN plasmídico de los transformantes se purificó mediante el estuche Wizard® Plus SV Minipreps DNA purification system (Promega, EE.UU.). Tres de los clones recombinantes seleccionados se transformaron inicialmente en células competentes de E. coli BL21(DE3). Posteriormente, el derivado del pET28a se introdujo en E. coli Rosetta(DE3)pLysS y E. coli Origami DE3 (Tabla 1). Cuatro de los transformantes derivados de cada cepa se conservaron en LB-glicerol a -70°C hasta el análisis de la expresión génica.

Los transformantes se inocularon en preinóculos de 5 mL de medio TB y se mantuvieron durante la noche a 30 ºC y 220 rev min-1 en una zaranda orbital termostatada (New Brunswick Scientific Co. Inc. EE. UU.). Para los estudios de expresión, 100 μL de cada precultivo se inocularon en 5 mL de medio TB y se incubaron a 30 ºC y 220 rev min-1 hasta alcanzar 0,6 - 0,8 unidades de DO600, momento en el cual se adicionó IPTG a una concentración de 0,1 mmol/L por 4 h. Culminado el tiempo de inducción, se centrifugó 1 mL de las células y el precipitado celular se conservó a -20 °C hasta su análisis. Para homogenizar los extractos celulares se adicionó un volumen de tampón PBS (Sambrook et al. 1989) a la biomasa para alcanzar una DO600 final de 6,5.

Las electroforesis desnaturalizantes en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) se realizaron según Laemmli (1970), utilizando geles al 10 % de acrilamida. En los ensayos de inmunodetección, las muestras separadas electroforéticamente se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Protran Whatman GmbH, Alemania) empleando un sistema de transferencia húmedo (Bio-Rad, EE.UU.). Posteriormente, las membranas se incubaron en solución de bloqueo (leche descremada al 5 % (m/v) en solución de PBS) durante 30 min y se incubaron con los anticuerpos durante 2 h a temperatura ambiente (TA). Finalmente, las membranas lavadas, se revelaron con 3,3´-diaminobencidina al 0,0125 % (m/v) y H2O2 al 0,1 % (v/v) en solución amortiguadora Tris-HCl pH 7,6.

Las imágenes de cada gel o membrana se capturaron mediante un sistema de escáner Canon Image Runner 1023N (Japón). El análisis de densitometría de imágenes para la estimación del peso molecular o de las cantidades producidas de la banda correspondiente a la proteína de interés se realizó mediante el programa Gel Analyzer 2010 (Lazar et al. 2010).

Los precipitados celulares correspondientes a 1 mL de cultivo se resuspendieron en 57 μL de una solución tamponada compuesta por sacarosa 10 % (m/v) y Tris-HCI 50 mmol/L pH 8. Posteriormente se adicionó 19 μL de lisozima y se incubó por 15 min a TA. A continuación se añadió 76 μL de Tritón X-100 0,2 % (v/v), EDTA 50 mmol/L y Tris-HCl 50 mmol/L pH 8, se homogenizó y se incubó por 5 min a TA. La mezcla se sometió a 3 ciclos de congelación-descongelación, seguido de centrifugación a 13 000 r/min durante 5 min. El sedimento obtenido se lavó con una solución de EDTA 25 mmol/L y Tris HCl 20 mmol/L pH 8 y se centrifugó a 13 000 r/min durante 5 min y la fracción insoluble se resuspendió en 167 μL de la misma solución.

Las células de E. coli se fijaron en glutaraldehído 2 % en tampón fosfato de sodio 0,1 M, pH 7,2 durante una noche; se post-fijaron en tetróxido de osmio 1 % por dos horas; se deshidrataron en disoluciones seriadas de acetona y se incluyeron en resina Spurr. Se obtuvieron cortes ultrafinos, los cuales se contrastaron con acetato de uranilo y citrato de plomo y luego se observaron con un microscopio electrónico de transmisión Jeol JEM 1011 (JEOL, Japón) a 20 000 X.

Para evaluar la expresión del gen L1 del VPH-18, aislado de una muestra clínica de una paciente diagnosticada con CCU por infección por este genotipo, en E. coli se seleccionó al promotor T7lac. Este promotor híbrido ha sido utilizado satisfactoriamente para dirigir la expresión de los genes L1 del VPH-16 (Zhang et al. 1998; Wei et al. 2009) y del VPH-11 en E. coli (Yan et al. 2009). La estimación teórica de la velocidad de inicio de la traducción del gen L1 insertado en el pET28a, que permite la fusión del extremo 5’ del gen L1 a una región de 20 codones codificantes para un fragmento de la proteína principal de la cápsida del fago T7 e incluye una secuencia codificadora de una etiqueta de seis histidinas, mediante la herramienta RBS Calculator fue 28 855,1 ua; valor que se considera adecuado para obtener elevados niveles de síntesis proteica (Speer, 2018). Teniendo en cuenta este resultado teórico y con la finalidad de promover que las maquinarias de transcripción y traducción se encontrasen con secuencias 5´ y amino compatibles con una síntesis eficiente del ARNm y de la proteína recombinante, respectivamente, se obtuvo una construcción plasmídica con el gen L1 insertado en el vector pET-28a, la cual se denominó pET28a-HPV-18 L1-tag (Fig. 1A). El plasmidio obtenido codifica para una proteína L1 fusionada por su extremo amino a una etiqueta de seis histidinas (VPH-18 L1-tag).

Fig. 1
Mapa físico del plasmidio pET28a-HPV-18L1-tag (A) y electroforesis en gel de agarosa (1 %) del plasmidio nativo y analizado por restricción (B). En (B) se aplicaron las muestras siguientes: M: Patrón de peso molecular Standard 100 pb DNA Ladder (Serva, Alemania); 1: pET28a-HPV-18L1-tag nativo; 2, 3 y 4: pET28a-HPV -18L1-tag digerido con las enzimas NcoI, BamHI-KpnI y PstI, respectivamente. Abreviaturas; Kan r: gen de resistencia a kanamicina, HPV18L1: gen L1 del VPH- 18 procedente de un aislado clínico cubano, His-tag: región codificante para una cola de 6 histidinas.

En la Figura 1B se muestran los resultados representativos de la digestión de un clon del plasmidio pET28a-HPV-18L1-tag con las enzimas BamH I, Nco I, Pst I y Kpn I. La digestión con la enzima Nco I dio lugar a dos bandas, las cuales se corresponden con los fragmentos de 6177 y 681 pb, que identifican a un sitio Nco I interno al gen L1 y otro externo (Fig. 1B, carril 2). Al digerir el plasmidio de interés con las enzimas BamH I y Kpn I, se obtuvieron dos bandas, que se corresponden con los fragmentos esperados de 6194 y 664 pb (Fig. 1B, carril 3). En la digestión con la enzima Pst I se obtuvieron tres bandas, que se corresponden con los fragmentos de 5862, 555 y 441 pb, que identifican a los tres sitios de corte Pst I internos al gen L1 (Fig. 1B, carril 4). De acuerdo al análisis realizado con el Vector NTI suite 6000 (InforMax, Inc. EE.UU.), la proteína VPH-18 L1-tag tiene una talla molecular teórica de 58,8 kDa y debe poseer un total de 527 aa.

El plasmidio pET28a-HPV-18 L1-tag se introdujo inicialmente en E. coli BL21 (DE3). Al realizar la inducción de la proteína recombinante con IPTG, una banda intensa de ~ 57 kDa se detectó en los extractos celulares de los transformantes con el plasmidio pET28a-HPV-18 L1-tag (Fig. 2A, carriles 2 al 4). Paralelamente, se determinó que la talla molecular de las bandas inducidas observadas por SDS- PAGE coincidieron con la banda inmunoreactiva de mayor talla detectada mediante Western blot con el anticuerpo CamVir-1, lo cual confirmó la identidad de la proteína L1 del VPH-18 evaluada (Fig. 2B, carriles 2 al 4). La presencia de la secuencia blanco de seis histidinas, fusionada al extremo amino de la proteína L1, también fue detectada mediante inmunoreacción con un anticuerpo anti-His (Fig. 2C, carriles 2 al 4). Como era de esperar, no se detectó ninguna banda inmunoreactiva en el extracto celular de la cepa transformada con el vector en contacto con el inductor (Fig. 2 B y 2C, carril 1).

Fig. 2
Análisis de la expresión del gen L1 del VPH-18, fusionado a una secuencia codificadora de seis histidinas, mediante la inducción con 0,1 mmolL-1 de IPTG por 4 horas en E. coliBL21(DE3). (A): Análisis por SDS-PAGE al 10%, (B): Inmunodetección con el anticuerpo CamVir-1, (C) Inmunodetección con un anticuerpo monoclonal anti-His. Se aplicaron 15 μl de cada lisado celular. 1: pET28a; 2, 3 y 4: clones 1, 2 y 3 del pET28a-HPV-18L1-tag, respectivamente; M: Patrón de peso molecular Broad Range Protein Molecular Weight Markers (Promega, EEUU.).

Durante la producción de las proteínas recombinantes en E. coli, uno de los principales retos es obtener la proteína en forma soluble y funcional, por lo que a continuación se evaluó la solubilidad de la proteína L1 del VPH-18, fusionada a la cola de histidinas, cuando fue inducida a bajas concentraciones de IPTG (0,1 mM) en E. coli BL21(DE3) [pET28a-HPV-18 L1-tag]. De acuerdo a los resultados obtenidos por Western blot con el anticuerpo anti-His, solamente se detectaron bandas inmunorreactivas en la fracción insoluble y mayoritariamente una banda de aproximadamente 57 kDa, valor cercano al peso molecular esperado de la proteína VPH-18 L1-tag (58,8 kDa) (Fig.3, carril 3). Estos resultados sugirieron que probablemente la proteína se encontraba formando agregados insolubles o depositada en cuerpos de inclusión (CI).

Fig. 3
Análisis mediante Western blot de la solubilidad de la proteína L1-tag obtenida en E. coli BL21(DE3) [pET28a-HPV-18 L1-tag]. Se aplicaron 15 μl de cada muestra. Carriles: 1. Fracción Total; 2. Fracción Soluble; 3. Fracción Insoluble; M. Patrón de peso molecular Broad Range Protein Molecular Weight Markers (Promega, EEUU.) revelado con Rojo Ponceau. Para la inmunodeteción de la proteína de interés se utilizó un anticuerpo monoclonal anti-His (Sigma).

El análisis de las células de E. coli BL21(DE3) [pET28a-HPV-18 L1-tag] mediante TEM reveló la presencia de CI (Fig.4), lo cual sugiere que la proteína L1 del VPH 18 se deposita en estas estructuras intracelulares. La agregación de la proteína L1 del VPH en los CI de bacterias se ha estudiado fundamentalmente para la proteína L1 del genotipo 16 (Zhang et al. 1998; Kelsall y Kulski, 1995; Nardelli-Haefliger et al. 1997; Ma et al. 2007) y se ha evaluado su posterior extracción, renaturalización y purificación mediante cromatografías de intercambio iónico (Zhang et al. 1998; Kelsall y Kulski, 1995) o IMAC (del inglés, Immobilized Metal Affinity Chromatography) a partir de E. coli (Choe et al. 2003; Di Bonito et al. 2006; Lai y Middelberg, 2002). En los trabajos informados por Zhang et al (1998) y Lai y Middelberg (2002), que purifican la proteína L1 mediante cromatografías de intercambio catiónico e IMAC, respectivamente, la proteína L1 purificada fue capaz de auto-ensamblarse en capsómeros y VLPs. Las VLPs obtenidas fueron reconocidas por el anticuerpo monoclonal H16 V5, que solo reconoce las del genotipo 16 nativas, sugiriendo la presencia de epítopos neutralizantes dominantes.

Fig. 4.
Cortes ultrafinos de células de E. coli BL21(DE3) [pET28a-HPV-18 L1-tag], cultivadas en medio TB e inducidas con 0,1 mmol L-1 de IPTG, observados mediante Microscopia Electrónica de Transmisión. Las flechas indican los cuerpos de inclusión.

Teniendo en consideración que el gen L1 del VPH-18, del aislado clínico cubano, contiene 14 codones que codifican para residuos de cisteína, potencialmente capaces de interactuar por medio de enlaces disulfuro (Ishii et al. 2003), en este trabajo se seleccionó a E. coli Origami como hospedero para evaluar la producción de la proteína L1, dado que esta cepa posee una doble mutación en los genes del sistema tiorredoxina - glutarredoxina para promover la formación de puentes disulfuro en su citoplasma. Particularmente, la cepa FÅ113 (trxB, gor, ahpC*) utilizada ha sido satisfactoriamente empleada para producir varias proteínas con puentes disulfuros en dicho compartimento (Kumano-Kuramochi et al. 2007, Drees et al. 2008, Xu et al. 2008).

La cepa E. coli Rosetta también se seleccionó para evaluar la obtención de la proteína L1 del VPH-18, dado que al examinar el uso de codones en la secuencia nucleotídica del gen L1 del VPH-18, mediante el empleo del programa bioinformático ATGme, se detectaron un total de 122 codones raros y 13 codones muy raros; lo que representa aproximadamente un 24 % de la secuencia del gen. En particular, se detectaron 15 agrupamientos de codones raros, dos de ellos ubicados hacia el extremo 5´ del gen. Estos resultados se sustentaron con otra herramienta bioinformática: E. coli Codon Usage Analyzer 2.1. Este último análisis indicó la presencia de 90 codones raros, lo que representa aproximadamente un 18 % de la secuencia total. Además, se identificaron 10 agrupamientos de codones raros. Ambas herramientas permitieron identificar simultáneamente a 49 codones empleados con una frecuencia baja en E. coli, que representa un 9,6 % aproximadamente respecto a la secuencia total.

Considerando el análisis anterior, el plasmidio pET28a-HPV-18 L1-tag se introdujo en las dos cepas de E. coli seleccionadas y la inducción de la expresión del gen L1 del VPH-18 se llevó a cabo en el mismo medio de cultivo y en las mismas condiciones en que anteriormente se evaluó la producción de la proteína L1 en E. coli BL21 (DE3). En dichas condiciones, E. coli BL21 produjo al menos dos veces mayor cantidad de la proteína L1 del VPH-18 que la producida por E. coli Origami (DE3) (Fig. 5, carriles 1vs 7), de acuerdo a análisis densitométrico del Western blot. E. coli Rosetta (DE3) pLysS produjo la menor cantidad de proteína L1 recombinante, solamente detectable por Western blot (Figura 5, carril 4), a pesar de que esta cepa tiene la ventaja de expresar seis ARNts para los codones: AUA, AGG, AGA, CUA, CCC y GGA, todos representados en la secuencia del gen L1 evaluado. La cepa E. coli Rosetta (DE3) pLysS ha sido un hospedero útil para la expresión de genes L1 de VPH alfas de especies cutáneas, con deleciones por ambos extremos (Senger et al. 2010) y también de los genes L1 del VPH-16 y 18 (Liu et al. 2013), pero cuando estos han sido clonados en el sistema de plasmidios pGEX para obtener las proteínas L1 fusionadas a la secuencia blanco GST. Esta estrategia permitió la obtención de las proteínas L1 mayormente en la fracción soluble del citoplasma. Sin embargo, en el presente trabajo no se siguió una estrategia de fusión a la secuencia blanco GST dado nuestro interés en evitar posibles complicaciones potenciales relacionadas con el corte de la secuencia blanco GST y su posterior purificación. Además, se ha informado sobre la formación de agregados mayormente insolubles de la proteína L1, posterior a la remoción de la etiqueta GST en E. coli (Senger et al. 2010).

En este estudio, la proteína VPH-18 L1 se detectó solamente en la fracción insoluble de Rosetta (DE3) pLysS, (Fig. 5, carril 6), de forma similar a su expresión en E. coli BL21 (DE3). Se ha especulado que la agregación de las proteínas recombinantes en cepas de E. coli que tienen su codon-bias ajustado puede deberse a la suplementación de los ARNts de codones raros, lo cual puede provocar la eliminación de pausas de traducción necesarias para el plegamiento y estabilidad de la proteína de interés (Rosano y Ceccarelli, 2009). Como perspectiva futura queda abierta la posibilidad de evaluar las potencialidades de un gen L1 del VPH-18 de origen sintético, con uso armonizado de codones, para la obtención de la proteína de interés con mayores rendimientos. No obstante, Chen et al. (2016) no detectaron expresión de un gen L1 del VPH-16 con uso optimizado de codones para E. coli, el cual se clonó en el plasmidio pET-28a, fusionado a las secuencias codificadoras de la cola de histidina y de la proteína principal de la cápsida del fagoT7.

Fig. 5
Análisis representativo mediante Western blot de la producción de la proteína L1 del VPH-18 en tres cepas de E. coli transformadas con el plasmidio pET28a-HPV-18 L1-tag. Se aplicaron 15 μl de cada muestra. 1: E. coli Origami (DE3) Fracción total; 2: E. coli Origami (DE3) Fracción soluble; 3; E. coli Origami (DE3) Fracción insoluble; 4; E. coli Rosetta (DE3) pLysS Fracción total; 5: E. coli

De acuerdo a los análisis densitométricos realizados a las membranas de Western blot, E. coli Origami (DE3) produjo dos veces cantidades menores de la proteína L1 que las producidas por E. coli BL21 (DE3). La cepa Origami fue seleccionada para evaluar su capacidad de catalizar la formación de los puentes disulfuros en el citoplasma, bajo condiciones de inducción de la expresión y temperatura, que pudieran favorecer la obtención soluble de la proteína L1, considerando que recientemente Bang et al (2016) utilizaron diez veces mayor concentración del inductor IPTG y temperatura de 37 °C y obtuvieron la proteína L1 del VPH-16 en la fracción insoluble de E. coli Origami. Existe el consenso que bajos niveles del inductor y temperaturas reducidas durante la inducción puede promover la solubilidad de las proteínas recombinantes en E. coli (Gopal y Kumar, 2013; Gupta y Shukla, 2016) requisito necesario para que la cepa Origami pueda catalizar la formación de los puentes disulfuro de la proteína (Berkmen, 2012). A su vez, los enlances disulfuros son requeridos para el plegamiento y la estabilidad de los dominios de la proteína de interés y en ocasiones son importantes para la solubilidad de la proteína (Drees et al. 2008).

De forma similar a E. coli BL21 (DE3) y E. coli Rosetta (DE3) pLysS, la proteína VPH-18 L1-tag se detectó depositada en la fracción insoluble de E. coli Origami (DE3) (Fig. 5, carril 3); por lo que considerando los niveles de expresión de la proteína VPH-18 L1-tag, E. coli BL21 (DE3) es el hospedero más atractivo para su producción. Estos resultados fueron similares a los informados por autores que utilizaron genes ricos en codones codificantes para cisteínas y con uso optimizado de codones para E. coli, como Bang y cols (2016) en el que la cepa más productora de la proteína L1 del VPH-16 fue E. coli BL21(DE3), o la proteína reteplasa, también mejor producida por E. coli BL21 (Fathi-Roudsari et al. 2016).

En experimentos futuros se evaluará el efecto de condiciones de solubilización más suaves, que puedan favorecer el proceso de purificación de la proteína en estado funcional, a partir de los CI producidos en el citoplasma ingenierizado de E. coli Origami (DE3) pET28a-HPV-18 L1-tag, respecto a los de E. coli BL21. Se ha informado sobre la presencia de estructuras plegadas y variantes semejantes a la nativa entre los intermediarios y agregados amiloides de algunas proteínas en CI en E. coli (García-Fruitós et al. 2005, Peternel et al. 2008, Rinas et al. 2017) lo cual ha permitido utilizar condiciones de solubilización menos agresivas, que han conducido a mayores recobrados de las proteínas funcionales a partir de los CI (Singh y Panda, 2005; Singh et al. 2015). Hasta nuestro conocimiento, un estudio comparativo de este tipo no se ha realizado a partir de los CI aislados de ambas cepas y por ello, nuestro grupo evalúa esta alternativa.