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INTRODUCCIÓN

El café (Coffea arabica) es un cultivo permanente, se siembra y empieza a producir después de tres a cuatro años. Su producción se da una vez al año, durante lo que se llama ciclo cafetalero; la época de corte depende de la zona y la altura. No obstante, como muchos otros cultivos, el café necesita un cuidado responsable y mejorado, debido a que es una plantación propensa al ataque de plagas y enfermedades (Instituto del Café de Costa Rica, Centro de Investigaciones en Café (CICAFE), 2011).

Existen dos especies principales que se cultivan y producen en la actualidad: el grano de café arábica, que abarca entre el 75 % y el 80 % de la producción mundial; y el grano Robusta, que representa alrededor del 30 %, más resistente a plagas y sabor inferior, pero con mayor contenido de cafeína (Capa, 2015).

La sustitución de productos químicos en la agricultura por biopreparados es un paso de avance en el establecimiento de una agricultura libre de cosechas envenenadas, por lo que una de las principales tácticas del manejo integrado es la producción y uso local de bioplaguicidas, así como el uso de alternativas naturales para el control fitosanitario. Ambos factores constituyen, además, un elemento importante en el ahorro de importaciones, línea a seguir en las estrategias del año 2019 para el desarrollo económico del país.

La aparición de daños persistentes por alto grado de infestación en el cultivo del café (Coffea sp) en fase de vivero, provocado por Fusarium oxysporum, causa pérdidas de gran valor que encarecen la producción de posturas. De ahí que el objetivo de esta investigación fue evaluar el efecto de extractos vegetales de nim, pulsiana, salvia y Trichoderma harzianum frente a Fusarium oxysporum, aislado de café (Coffea sp), en condiciones in vitro.

MATERIALES Y MÉTODOS

El presente trabajo abarcó un período de un año, desde octubre de 2017 hasta octubre de 2018. Comprendió dos etapas, la primera relacionada con la identificación y caracterización de Fusarium oxysporum y una segunda etapa correspondiente a la evaluación in vitro del efecto de extractos vegetales de nim (Azadirachta indica A. Juss), pulsiana (Melia azederach Lin), salvia (Salvia officinalis L) y cepas certificadas de Trichoderma harzianum, frente al patógeno fungoso Fusarium oxysporum.

Identificación y caracterización de Fusarium sp.

Del elevado número de muestras recibidas en el laboratorio, el 99 % reflejaba el mismo síntoma. Por esa razón se decidió realizar una inspección técnica a varios viveros de café en la provincia. Todos reflejaron el mismo síntoma en sus posturas. Para la toma de muestras en condiciones de campo se escogió el vivero San Enrique del municipio Songo La Maya, Santiago de Cuba, que presenta un total de 140 000 posturas de café (Coffea sp) de la variedad Isla F 6-14. El 70 % presentó afectación en la base del tallo. Se procedió a la toma al azar de diferentes plantas, que fueron colocadas en bolsas de nailon transparentes selladas. En todas las bolsas se describieron los datos necesarios para su análisis en el laboratorio: procedencia, cultivo, variedad, parte de la planta, fase fenológica, tipo de suelo, sistema de riego, tratamientos realizados y sus dosis; así como la persona que tomó la muestra y fecha en que se realizó. Luego fueron trasladas al Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal para su análisis y diagnóstico.

Las muestras, previamente lavadas con agua corriente, fueron sometidas a un proceso de desinfección, tal y como está establecido.

Simultáneamente se procedió a la elección del material, que se fragmentó en porciones más pequeñas de 2 x 2 mm asépticamente. Estas porciones fueron sembradas en placas petri de 9 cm de diámetro, preparadas con medio de cultivo agar-agua para evitar algún tipo de contaminación. Las placas se incubaron a temperatura de 26 ± 20C de 24-72 horas hasta observarse el desarrollo de colonias. Se tomaron discos de los márgenes de estas colonias y se colocaron en el medio requerido Papa Dextrosa Agar (PDA) pH 6.5, como antibiótico fue utilizado el cloranfenicol a una concentración de 50 ppm. Se incubó a temperatura 26 ± 20C durante 7 días hasta lograr la cepa purificada. Las colonias desarrolladas en el medio de cultivo se observaron con el microscopio estereoscópico para determinar características culturales y con el microscopio óptico para la identificación del patógeno. Se realizaron 150 mediciones de conidios, comparadas con las propias claves de Centre for Agricultural Bioscience International (CABI) (2018).

Del aislamiento obtenido se realizaron cultivos monoconidiales; una sola espora de Fusarium oxysporum se obtuvo por el método de dilución en placas y estriando placas. Para ambos métodos se colectó un pequeño raspado de hifas esporulativas de cultivos crecidos en placas con Papa Dextrosa Agar (PDA) en 10 mL de agua destilada estéril en tubos de ensayo. Para la suspensión de esporas inicial se prepararon diferentes diluciones. (Pocasangre et al., 2014).

Los medios de cultivos utilizados agua-agar y PDA se prepararon previamente, cumpliendo los requisitos establecidos en la preparación de medios de cultivo y soluciones.

Se añadió 1 mL de cada una de las diluciones en agar- agua, posteriormente durante una noche se incubaron las placas con la tapa hacia arriba a 25 °C. A la mañana siguiente, bajo el microscopio, se localizaron en las placas conidios germinados y se transfirieron con un escalpelo esterilizado conidios aislados del agar-agua a placas nuevas de 90 mm con PDA (Pocasangre et al., 2014).

Obtención de extractos

El material vegetal nim (Azadirachta indica A. Juss), pulsiana (Melia azederach, Lin), salvia (Salvia officinalis L) se colectó en horas tempranas de la mañana en el municipio Santiago de Cuba. El secado de las hojas se efectuó en una estufa a 350C, luego se molió de forma manual y se tamizó el tamaño de las partículas a 2.5 mm.

Se tomaron 25 g de masa seca en un matraz aforado, añadiendo 100 mL de agua destilada estéril. El contenido fue agitado en zaranda durante 15 min cada 12 h y se mantuvo en maceración por 24 h en la oscuridad. Transcurrido este tiempo se decantó el líquido y se filtró con papel de filtro estéril. Las soluciones madres de los extractos se esterilizaron a través de filtro bacteriológico de membrana, de tamaño de poro de 0.1 µ. A partir de esa solución madre se prepararon diluciones a 0.6 %, 1.25 % y 1.9 %.

Una vez obtenidos los extractos, se procedió a la evaluación in vitro de estos y del entomopatógeno Trichoderma harzianum frente a Fusarium oxysporum. Esta evaluación fue realizada en la sección de Micología del Laboratorio Provincial Sanidad Vegetal; para ello se utilizó la cepa de Fusarium oxysporum, aislada de posturas de vivero de café caracterizadas en condiciones de laboratorio. La cepa de Trichoderma harzianum utilizada fue suministrada por el Departamento de Entomopatógenos de la provincia Santiago de Cuba, con una concentración de 2.5 x 109 conidios/mL, con el cumplimiento de los parámetros de calidad.

Los tratamientos consistieron en la utilización de tres concentraciones a 0.6 %, 1.25 % y 1.9 %, un control relativo Trichoderma harzianum y un control absoluto (medio de cultivo sin productos). El medio Papa Dextrosa Agar (PDA), luego de ser ajustado su pH a 5.8, fue esterilizado en autoclave a 1210 C y 1.2 atmósferas durante 20 minutos. En el flujo laminar se le adicionaron las alícuotas correspondientes de los extractos para obtener las disoluciones deseadas, ajustadas a un volumen final de 50 mL, el cual fue vertido a razón de 10 mL por placa. Para determinar la velocidad de crecimiento se midió el diámetro diario de cada colonia.

Se determinó el Porcentaje de Inhibición de Crecimiento Radial (PICR) mediante la fórmula de Samaniego et al. (1989), citada por (Bernal et al. 2004).

Porcentaje de Inhibición de Crecimiento Radial: PICR = (R1 – R2) / R1 x 100

R1 y R2: radios mayor y menor, respectivamente, de crecimiento radial del patógeno.

El experimento se organizó bajo un diseño experimental completamente aleatorizado. Se realizaron tres experimentos con cinco tratamientos cada uno y uno con siete tratamientos, para un total de cuatro experimentos. En cada uno de ellos se establecieron dos testigos (absoluto y relativo), se hicieron siete observaciones por tratamientos y tres réplicas. Para conformar el cuarto experimento se tomaron los mejores tratamientos de los tres experimentos anteriores, manteniendo los controles.

Experimento 1

1. 1. 1. Nim 0,6 % de concentración

   2. Nim 1,25 % de concentración

   3. Nim 1,9 % de concentración

   4. Trichoderma harzianum (control relativo)

   5. Testigo absoluto

Experimento 2

1. 1. 1- Pulsiana 0,6 % de concentración

   2- Pulsiana 1,25 % de concentración

   3- Pulsiana 1,9 % de concentración

   4- Trichoderma harzianum (control relativo)

   5- Testigo absoluto

Experimento 3

1. 1. 1- Salvia 0,6 % de concentración

   2- Salvia 1,25 % de concentración

   3- Salvia 1,9 % de concentración

   4- Trichoderma harzianum (control relativo)

   5- Testigo absoluto

Experimento 4

1. 1. 1. Nim 0,6 % de concentración

   2. Nim 1,25 % de concentración

   3. Nim 1,9 % de concentración

   4. Pulsiana 1,9 % de concentración

   5. Salvia 1,9 % de concentración

   6. Trichoderma harzianum (control relativo)

   7. Testigo absoluto

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los primeros síntomas de Fusarium oxysporum en el cultivo del café (Coffea arabica var Isla F6-14) se manifestaron como necrosis en la base de los tallos, que muestran una mancha café oscuro con fisuras longitudinales que provocan un fácil desprendimiento de la epidermis de la raíz. Esto induce a un marchitamiento de las posturas y luego a la muerte de la planta. (Figura 1).

Al realizar el proceso de identificación descrito anteriormente, se logró el cultivo de colonias con crecimiento muy rápido en medio de cultivo PDA, con micelio aéreo algodonoso, de color blanco a violáceo. Al microscopio estereoscopio fueron observables conidióforos primarios, que surgen lateralmente de las hifas en el micelio aéreo, simples y ramificados; los secundarios, irregulares y verticilados. Células conidiógenas monolocales, subcilíndricas, muy cortas, de 8 – 14 x 2.5 -3.0 μm; abundantes microconidios, que son esporas hialinas formadas en falsas cabezas de 0 - 2 septo, de 4.0 - 24 x 2.0 - 4.5μm, desarrolladas sobre fiálides laterales o conidióforos poco ramificados.

Los macroconidios son de pared delgada, fusiformes, largas y moderadamente curvadas en forma de hoz; poseen de 3 - 5 septos longitudinales con célula basal elongada y célula apical atenuada de 18 - 62 x 2.2 - 6.0 μm. Clamidiosporas abundantes formadas en hifas y conidios, intercaladas de 7.0 - 11 μm, globosas, de pared ornamentada, dispuestas en pares y cortas cadenas; características que coinciden con lo descrito por Estupiñán y Ossa, (2007).

Evaluación in vitro del efecto de extractos vegetales y Trichoderma harzianum frente a las poblaciones de Fusarium oxysporum

Efecto del extracto de nim (Azadirachta indica)

El análisis biométrico arrojó que los tratamientos nim-Trichoderma-testigo presentan diferencias estadísticas significativas. Para el caso de las tres concentraciones de nim no se observan diferencias entre ellas, aunque biológicamente a mayor concentración existe una disminución en el crecimiento micelial de las colonias de Fusarium oxysporum. Con ello se describe el efecto de los tratamientos en las condiciones en que se desarrolló la investigación.

Los resultados expuestos en la tabla 1 permiten correlacionar la actividad antifúngica de las diferentes concentraciones de nim y Trichoderma harzianum. Es interesante notar que el menor diámetro de crecimiento de colonia, al utilizar las tres concentraciones de nim, lo obtuvo la del 1.9 %.

Los resultados obtenidos confirman lo mencionado por León (2009), quien expuso una síntesis de diferentes investigaciones realizadas por diversos autores, los cuales demostraron la importancia del extracto de la hoja de nim como fungicida al utilizarlo en pruebas in vitro contra Fusarium oxysporum en el cultivo de la pera.

Villa-Martínez et al. (2015), con el uso de extractos vegetales extraídos del nim y la utilización de cepas de Trichoderma spp, reflejan la inhibición de colonias de Fusarium oxysporum. En su investigación los extractos acuosos de todas las especies vegetales se destacaron con una eficacia mayor del 60 %.

También investigaciones realizadas en Cienfuegos por González et al. (2016) demuestran la actividad antifúngica de extracto de nim a diferentes concentraciones para el control de Fusarium spp aislado de semillas.

Para Trichoderma harzianum mientras mayor sea su diámetro de crecimiento, mayor efecto antagonista tendrá sobre el patógeno. En este experimento se mantuvo en aumento hasta los siete días, lo que demuestra que el patógeno dejó de crecer mientras que el hongo antagonista ocupó el total de la placa, lo cual refleja la competencia por el espacio y los nutrientes.

La colonización de los sustratos y su rápido crecimiento constituyen características significativas de Trichoderma spp., las que lo hacen un buen competidor por el espacio, fundamentalmente en condiciones in vitro (Saravanakumar et al., 2017).

De igual manera en el análisis del Porcentaje de Inhibición de Crecimiento Radial, a partir de los cinco días, se encontró un índice superior al 70 %. El PICR en la concentración de 1.9 % alcanza un 90 %, donde a medida que aumenta la concentración la velocidad de crecimiento se hace menor.

Este resultado se asemeja a los obtenidos por Villarreal (2007), que analizó el PICR de Colletotrichum gloeosporioides en investigaciones in vitro, para ver su comportamiento frente a diferentes concentraciones de extracto de nim, en las cuales a medida que aumentaba la concentración mayor fue el Porcentaje de Inhibición de Crecimiento Radial, con un 80 % a 1.9 % de concentración del extracto.

Efecto del extracto vegetal de pulsiana (Melia azederach)

En la tabla 2 se observa una diferencia estadísticamente significativa entre las variables mostradas, para el caso de las concentraciones de 0.6 % y 1.25 % del extracto vegetal de pulsiana no existió diferencia significativa entre ellas.

El experimento mostró biológicamente una disminución del crecimiento micelial del Fusarium oxysporum a medida que se aumenta la concentración del extracto vegetal de pulsiana, contrario al testigo absoluto. Son pocas las investigaciones in vitro realizadas con pulsiana para el control de Fusarium spp, aunque se han realizado algunos estudios de su efecto fungicida en otras especies de hongos.

En pruebas in vitro realizadas por Pérez et al. (2011) para ver el comportamiento de Collletotrichum gloeosporioides con diferentes dosis de extracto de pulsiana, estos autores señalan que los posibles responsables del efecto antifúngico del extracto y sus fracciones puedan deberse a los metabolitos secundarios presentes en la planta, tales como alcaloides, saponina, taninos y antocianinas y a compuestos como los limonoides (azadiractina), pertenecientes al grupo de los tetranotriterpenos, obtenidos a partir de Melia azederach.

Se muestra para este caso que a mayor concentración utilizada existió un menor crecimiento radial de la colonia del patógeno; por tanto, una mayor inhibición de este. En las dos primeras concentraciones el PICR está entre 60 % - 70 %, para 1.9 % alcanza un 80 % de inhibición de crecimiento.

Efecto del extracto vegetal de salvia (Salvia officinalis)

La tabla 3 refleja los resultados estadísticos obtenidos con las concentraciones de salvia analizadas, así como con el control relativo Trichoderma harzianum y el testigo absoluto, donde existieron diferencias estadísticas significativas entre ellas; no así entre las concentraciones 0.6 % y 1.25 %, por lo que a mayor concentración mayor actividad antifúngica. De la misma manera se refleja la actividad antifúngica de Trichoderma harzianum como control relativo, con significación estadística entre ellos.

Vázquez (2009) hacen referencia a la actividad como antiséptico de la hoja de salvia, que también posee acción antibacteriana y fungicida contra fitopatógenos debido principalmente a su aceite esencial y acción antiviral. Esto se debe a su riqueza en compuestos diterpénicos, que poseen gran cantidad de esencia rica en alcanfor, cineol y otras sustancias aromáticas, además de contener taninos y ciertas sustancias amargas.

Las hojas de la salvia (Salvia officinalis L.), según lo planteado por Martínez (2013), contienen de 1 a 2,8 % de aceite esenciales. Sus antecedentes farmacológicos indican que se pueden utilizar para tratar los hongos que habitualmente atacan a las naranjas, que llevan a la descomposición de estas frutas. Este aspecto explica los resultados obtenidos.

En análisis realizado por Martínez et al. (2013) con extracto de salvia, se obtuvieron resultados parecidos a los observados anteriormente. Estos demostraron el efecto inhibitorio de extracto de salvia en pruebas in vitro sobre las cepas de patógenos fungosos que causan podredumbre al cultivo de cítrico, como son Aspergillus níger, Penicillium digitatum y Penicillium italicum.

Gimeno (2016) en su estudio in vitro con diferentes extractos utiliza la salvia, de la cual verifica su contenido de fenoles y capacidad antioxidante y demuestra una inhibición del crecimiento fúngico, aunque a concentraciones elevadas, más notable entre 10 – 20 %.

De igual manera a medida que aumenta la concentración del extracto, la velocidad de crecimiento de F. oxysporum disminuye. En el análisis del Porcentaje de Inhibición de Crecimiento Radial, a partir de los cinco días, se encontró un índice de un 55 %, el PICR en la concentración de 1.9 % alcanza un 60 %.

Efecto del extracto vegetal de nim (Azadirachta indica), pulsiana (Melia azederach), salvia (Salvia officinalis) y Trichoderma harzianum

En la tabla 4 se analiza el efecto de las mejores concentraciones de nim, pulsiana, salvia, Trichoderma harzianium y testigos sobre el crecimiento micelial de Fusarium oxysgorum. Se aprecia que existen diferencias estadísticamente significativas de los extractos vegetales en relación con el testigo. Se muestra que de los tres extractos analizados la mayor acción inhibitoria para la cepa de Fusarium oxysporum la obtuvo el extracto de nim en todas sus concentraciones, al igual que el comportamiento con T. harzianum.

En cuanto a la concentración de 1.9 % de pulsiana y salvia, entre ellas no se muestran diferencias estadísticamente significativas con Trichoderma harzianum, aunque se evidencia biológicamente que con la concentración de pulsiana el diámetro de la colonia del patógeno es ligeramente menor.

Los resultados obtenidos con Trichoderma harzianum evidencian sus diferentes mecanismos de acción, tales como competencia por el sustrato, micoparasitismo y la antibiosis frente a cepas de diferentes patógenos fungosos. Reyes et al. (2007) corroboran a través de sus experimentos la efectividad antagónica y micoparasítica de Trichoderma para el control de Pyricularia grisea y Rhizoctonia solani aislados de arroz.

Según Herrera et al. (2017) las especies de Trichoderma han sido identificadas como los agentes potenciales de biocontrol de patógenos fungosos de muchas plantas. Lo anterior ha sido citado también por Kuzmanovska et al. (2018).

Resultados recientes obtenidos por Cusi & Vanessa (2018) afirman el efecto antagonista de Trichoderma, al demostrar en pruebas in vitro frente a Fusarium oxysporum aislado de cebolla su alta capacidad antagónica y un alcance de PICR de un 97,4 %.

Como se ha explicado anteriormente, el extracto acuoso del nim tiene una acción inhibidora marcada sobre Fusarium oxysporum en condiciones in vitro. Estos resultados confirman los obtenidos por Águila et al. (2011), que alcanzaron con el extracto de nim una respuesta positiva frente al hongo Macrophomina phaseolina, con efectividades superiores al 60 % en todos los momentos evaluados.

CONCLUSIONES

1. 1. 1- El patógeno fungoso identificado y caracterizado en posturas de café var Isla F6 - 14 correspondió a Fusarium oxysporum.

   2- El mayor PICR lo obtuvo el extracto de nim en todas sus concentraciones, unido a T. harzianum; seguido por las mayores concentraciones de pulsiana y salvia.

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