Introducción

Saccharomyces fragilis se describe como una levadura homotálica, hemiascomicética y la producción de varias enzimas, entre ellas la beta-galactosidasa ( Llorente et al., 2000 ; Dagbagli & Goksungur, 2008 ). La principal característica común de S. fragilis es la capacidad de asimilar la lactosa y utilizar este azúcar como fuente de carbono. La larga historia de asociación segura con productos alimenticios ayudó a S. fragilis a lograr GRAS (generalmente considerado como seguro) y QPS (presunción calificada de seguridad) en los Estados Unidos y la Unión Europea, respectivamente. Esta designación significa que hay pocas restricciones en la aplicación y aumenta en gran medida su potencial en el sector de la biotecnología ( Fukuhara, 2006 ; Schaffrath y Breunig, 2000). S. fragilis, ha sido más ampliamente adoptado por la industria, principalmente porque posee

Rasgos que son deseables para aplicaciones de biotecnología. Estos incluyen la capacidad de asimilar azúcares, a saber, lactosa e inulina; una tasa de crecimiento extremadamente rápida, con tiempos de generación típicos de aproximadamente 70 min; Termotolerancia, con capacidad de crecimiento hasta 52ºC. y una alta capacidad secretora ( Fonseca, Heinzle, Wittmann y Gombert, 2008 ).

La beta-galactosidasa es una entre otras enzimas con potencial industrial utilizado en la hidrólisis de la lactosa en el suero de leche y queso, generando alimentos con bajos niveles de lactosa, cuyo resultado es una mejor solubilidad y digestibilidad de la leche y los productos lácteos, lo que los hace ideales para los consumidores. intolerante a este azúcar ( Husain, 2010). Para detectar la actividad de la enzima, se usan comúnmente dos sustratos diferentes. X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-bD-galactopiranósido) se emplea para la detección in vivo de la actividad enzimática en las placas ya que entra fácilmente en las células. Sin embargo, X-Gal no es adecuado para mediciones cuantitativas. Para este propósito, se debe utilizar ONPG (o-nitrofenil-bD-galacto piranósido), que a su vez tiene la desventaja de no poder entrar en las células intactas. Por lo tanto, las células deben ser permeabilizadas antes de la determinación de la actividad enzimática ( Kippert, 1995 ).

La beta-galactosidasa de las células de levadura es una enzima intracelular y es necesario el uso de técnicas para obtenerla. Se pueden usar métodos fisicoquímicos y enzimas, pero no son adecuados, ya que los tratamientos drásticos aplicados pueden conducir a la degradación del compuesto de interés ( Coelho, Salgado y Ribeiro, 2008 ; Panesar, Panesar, Singh y Bera, 2007 ).

Las técnicas de permeabilización celular a menudo son útiles para muchas aplicaciones relacionadas con la tecnología de enzimas. Por ejemplo, los procedimientos de permeabilización suelen ser rápidos y no destruyen las enzimas celulares. Por lo tanto, la cantidad total de una enzima asociada con una célula puede analizarse después de la permeabilización. Se han desarrollado varios métodos de permeabilización para levaduras, como el uso de detergentes, disolventes orgánicos y desecación ( Becker, Caldwell y Zachgo, 1996 ). La permeabilización celular está influenciada por varias condiciones operativas que deben optimizarse. Sin embargo, el método de optimización tradicional en el que el nivel de un parámetro varía en un tiempo dentro de un cierto rango, mientras se mantienen constantes las otras variables, generalmente requiere mucho tiempo y requiere un gran número de pruebas (Sen y Swaminathan, 1997 ), y no refleja los efectos de interacción entre las variables y, en consecuencia, no representa el efecto neto de los diversos factores sobre la actividad de la enzima ( Dagbagli y Goksungur, 2008 ). Estos inconvenientes pueden superarse mediante el uso de diseños factoriales experimentales estadísticos, y los datos experimentales de las respuestas generalmente se ajustan a las funciones polinomiales de segundo orden mediante la metodología de superficie de respuesta (RSM).

Este estudio tuvo como objetivo evaluar la permeabilización celular de Saccharomyces fragilis IZ 275 en diferentes condiciones de tiempo, temperatura y concentración de etanol utilizando el diseño de Box-Behnken y la metodología de superficie de respuesta.

material y métodos

Microorganismo

La cepa SF IZ 275 del Centro de Investigación y Graduación de Ciencia y Tecnología Lecheras, Universidade Norte do Paraná (UNOPAR) se obtuvo de la Fundación Andre Tosello - Colección de Cultura Tropical. Los cultivos de reserva se mantuvieron a 4ºC en tubos de ensayo de agar PDA (Agar Dextrosa Patata).

Preparación del inóculo

La cepa SF IZ 275 se cultivó inicialmente en un tubo de ensayo de agar PDA y se incubó a 35ºC durante 24 h. Luego se transfirieron tres colonias de bucle a matraces Erlenmeyer de 250 ml separados que contenían 50 ml de extracto de malta (15 g L-1). Los matraces se incubaron a 35ºC y se agitaron a 150 rpm durante 24 h. La densidad óptica (OD) se determinó a una longitud de onda de 570 nm utilizando un espectrofotómetro y la OD se ajustó a 0,6.

Obtención de células SF IZ 275 y permeabilización.

La cepa SF IZ 275 se utilizó como inóculo para la producción de beta-galactosidasa utilizando suero de queso como medio. El suero de queso obtenido de una cooperativa de productos lácteos local se desproteinizó añadiendo ácido láctico a pH 4,6 y calentando a 90 ° C durante 30 min. Luego se filtró a través del papel de filtro Whatman nº 1 para eliminar la proteína coagulada y se ajustó a pH 5.0 con solución de NaOH (50%). Luego se pasteurizó a 65 ° C durante 30 min. El suero de queso pasteurizado se inoculó con un inóculo al 10% (a densidad óptica, OD670 nm = 0,6) de SF IZ 275 y se incubó a 35 ° C, 150 rpm durante 24 h. Las células se recogieron de 5 ml de medio de fermentación mediante centrifugación a 5000 rpm durante 20 minutos y se lavaron con una solución de tampón fosfato 0,1 M (pH 6,8). La concentración de biomasa se monitorizó espectrofotométricamente con un espectrofotómetro Femto 700 Plus (Sao Paulo, Brasil).

La permeabilización celular se realizó en matraces Erlenmeyer de 25 ml, cada uno con 5 ml de la suspensión reactiva que consiste en 5 mg (peso seco) de células SF IZ 275 en tampón fosfato de potasio 0,1 M (pH 6,8) y etanol según el diseño experimental (Tabla 1 ). Los matraces se incubaron en un agitador orbital a 150 rpm a una temperatura y durante un tiempo, según el diseño anterior. El sobrenadante se eliminó mediante centrifugación a 5000 rpm durante 5 minutos y las células se lavaron dos veces con el mismo tampón. El sedimento final se resuspendió en 1 ml de tampón de fosfato potásico 0,1 M (pH 6,8) y la actividad enzimática de las células permeabilizadas se determinó como se describe más adelante.

Actividad beta-galactosidasa

La determinación de la actividad de beta-galactosidasa se realizó de acuerdo con Inchaurrondo, Yautorno y Voget (1994) . La actividad de beta-galactosidasa se ensayó utilizando el sustrato cromogénico ONPG (o-nitrofenil-β-galactopiranósido).

La muestra de 50 ml de suspensión celular permeabilizada (0,05 mg) se mezcló con 2 ml de ONPG 1,25 mM en tampón de fosfato de potasio 0,1 M (pH 6,6) y se incubó durante 5 minutos a 37 ° C. La reacción se suspendió mediante la adición de 0,5 ml de carbonato de sodio 1M. El ONPG liberado se midió espectrofotométricamente a 420 nm. Una unidad de actividad de beta-galactosidasa (U) se define como la cantidad de enzima que hidroliza 1 minuto de sustrato (ONPG) por minuto en las condiciones del ensayo. Todas las pruebas de actividad se realizaron por triplicado y se expresaron como valores medios.

Diseño experimental

La permeabilización de las células SF IZ 275 para la alta actividad de la beta-galactosidasa se realizó mediante un diseño y análisis factorial mediante el método de la superficie de respuesta. Las condiciones controladas para la concentración de etanol, la temperatura y el tiempo de incubación se analizaron de acuerdo con el factor 3 de 3 factores (-1; 0; +1) Box-Behnken Design (Montgomery, 2005) con tres repeticiones en el punto central que resumen 15 ejecuciones experimentales ( Tabla 1).

El modelo matemático para la función de respuesta (y = actividad de beta-galactosidasa) se expresó como:

donde b0 es los coeficientes estimados en la superficie de respuesta y Xi Xj son variables reales en la variable dependiente. El análisis estadístico del modelo matemático se realizó con ANOVA (p <0.05) y el análisis de regresión con Statistica 6.0. Se generó superficie de respuesta para evaluar la respuesta.

Estabilidad de almacenamiento

Se estudió la capacidad de las células permeabilizadas tratadas con etanol para retener la actividad de beta-galactosidasa durante el almacenamiento. Una suspensión de 1 g de células (peso húmedo) en 20 ml de tampón de potasio 0,1 M (pH 7,0) se almacenó a 4ºC. A intervalos diarios durante 9 días, se separó un volumen predeterminado de suspensión por centrifugación y se determinó la actividad de beta-galactosidasa en las células separadas.

Resultados y discusión

La optimización de las condiciones de permeabilización celular se llevó a cabo para encontrar los valores óptimos de las variables independientes (concentración de etanol, temperatura y tiempo de tratamiento), que darían la máxima actividad de beta-galactosidasa. Sobre la base del Diseño Box-Benhken (BBD), se determinaron los niveles experimentales de actividad de beta-galactosidasa en cada conjunto de condiciones y se compararon con los niveles predichos correspondientes sugeridos (Tabla 1). El valor experimental máximo para la actividad de beta-galactosida se fue de 2.12 U mg -1 , mientras que el valor de respuesta pronosticada fue de 2.06 U mg -1 .Se alcanzó aproximadamente el 97% de la validez, lo que indica que el modelo ejerció una predicción adecuada sobre la actividad de la enzima. La estrecha correlación entre los datos experimentales y predichos indica la idoneidad del diseño experimental. La actividad máxima de beta-galactosidasa (2.12 U mg -1 ) se logró en las siguientes condiciones, etanol 35% (vv -1 ), 15ºC y 20 min (Tabla 1) .

Con base en los resultados para obtener una alta actividad de beta-galactosidasa de las células permeabilizadas de SF IZ 275, el efecto de los términos lineales de la concentración de etanol fue significativo (p <0.05), lo que indica el establecimiento de la concentración para el límite de diseño más alto (35% ). Los términos lineales y cuadráticos de la temperatura y el tiempo no fueron significativos (p> 0.05), lo que indica que la temperatura y el tiempo establecidos para el límite de rango más pequeño, 15 - 25ºC y 15 - 20 min, respectivamente, demostraron ser suficientes para el proceso.

análisis estadístico

El polinomio de segundo grado propuesto se ajustó a los datos utilizando regresiones lineales múltiples para determinar las condiciones óptimas de permeabilización celular que dieron como resultado la actividad máxima de beta-galactosidasa. Los efectos del etanol, la temperatura y el tiempo se evaluaron cuantitativamente utilizando curvas de superficie de respuesta. Al aplicar el análisis de regresión múltiple en los datos experimentales, se encontró que el siguiente polinomio de segundo grado representa la relación entre las variables independientes probadas (Ecuación 2).

Los niveles predichos de actividad de beta-galactosidasa usando la Ecuación (2) se dan en la Tabla 1 junto con los datos experimentales. La importancia del ajuste del polinomio de segundo orden para la actividad de beta-galactosidasa se evaluó mediante el análisis de varianza (ANOVA) con los resultados mostrados en las Tablas 2.

El coeficiente de determinación (R 2 ) del modelo fue de 0,89648 (Tabla 2), que indicó que el modelo representó adecuadamente la relación real entre las variables en consideración. Un valor de R 2 de 0,89648 significa que el modelo explicó el 89,6% de la variabilidad, que es aceptable para el sistema biológico y solo el 10,4% se debió al azar. El coeficiente de variación (CV) obtenido fue de 12.95%. El Coeficiente de variación (CV) indica el grado de precisión con el que se realizaron los tratamientos. Un valor bajo de CV sugiere una alta confiabilidad del experimento (Mason, Gunst y Hess, 1989).

Los resultados obtenidos después de llevar a cabo ANOVA se presentan en la Tabla 2. Valores de 'Prob. > F 'menos de 0.05 indica que los términos del modelo son significativos. Los valores superiores a 0.10 indican que los términos del modelo no son significativos. El valor F de 'Falta de ajuste' de 2.02396 implica que hay una falta de ajuste insignificante. El valor de 'Falta de ajuste' (Prob> F) de 0.347587 implica que solo hay un 34.75% de probabilidad de que el valor F de 'Falta de ajuste' pueda ocurrir debido al ruido.

Optimización de la permeabilización de células Saccharomyces fragillis IZ275

Para optimizar las variables que influyen en la actividad de la beta-galactosidasa de células SF IZ 275 permeabilizadas, se generaron gráficos de superficie de respuesta a partir del modelo de regresión. Las superficies de respuesta tridimensional para la actividad de beta-galactosidasa: concentración de etanol, temperatura y tiempo se representaron gráficamente (Figura 1).

La Figura 1a muestra los efectos de la temperatura y la concentración de etanol sobre la actividad de la beta-galactosidasa. La permeabilización con baja concentración de etanol y baja temperatura del proceso mostró la actividad enzimática más baja. La actividad de beta-galactosidasa fue mayor en el rango de temperatura de 15 a 25ºC y la concentración de etanol hasta ca. 35%. Panesar et al. (2007), mostraron que las condiciones de proceso óptimas para la permeabilización celular de Kluyveromyces marxianus NCIM 3465 fueron 50% (v v-1) de concentración de etanol, temperatura de 25ºC y tiempo de tratamiento de 15 min.

Figura 11b representa la gráfica de la superficie de respuesta en función del tiempo frente a la concentración de etanol. El cambio de tiempo no afecta significativamente la curvatura de la superficie. De una representación gráfica hay una dependencia de la actividad de beta-galactosidasa en la concentración de agente permeabilizante (etanol 32 - 35%). Se obtuvo una permeabilización máxima de 2.816 mmol de L-1ONP min-1 g-1 tratando las células con 75% (vv-1) de etanol a 20 ° C durante 15 min. ( De Faria et al., 2013 ). La Figura 1c muestra una alta efectividad de permeabilización dentro del rango de tiempo y temperatura estudiados, mientras que por debajo y por encima de estos rangos se puede observar una disminución significativa de la actividad. Esto confirma que el rango de estas variables se eligió correctamente y fue suficiente para el proceso.

En este estudio también quedó claro que el efecto de la concentración de etanol sobre la actividad de la beta-galactosidasa era más importante que la temperatura y el tiempo. En un estudio preliminar realizado por nuestro grupo, se demostró que dentro del rango de temperatura y tiempo analizados a diferentes concentraciones de etanol 50, 75 y 100%, había una alta actividad de beta-galactosidasa sin diferencias significativas.

Trawczynska y Wójcik (2015) definieron las condiciones óptimas de operación para la permeabilización de las células de levadura al 53% de la concentración de etanol, temperatura de 14.8ºC y tiempo de tratamiento de 40 min. El uso de células de levadura completas como biocatalizadores es una alternativa muy prometedora y ha ganado mucho interés en los últimos años ( Yu et al., 2007 ).

Las células completas de SF IZ 275 no mostraron actividad de beta-galactosidasa. El mecanismo de liberación de enzimas no ha sido completamente estudiado. Sin embargo, no se cree que la lisis de la pared celular sea el modo de solubilización de enzimas. Quizás el solvente extraiga un componente lipídico de la membrana celular de la levadura, permitiendo la filtración de proteínas intracelulares o periplásmicas. Se ha informado un procedimiento similar que utiliza concentraciones más bajas de disolvente (<20%) para la medición de la enzima intracelular in situ (Wendorff y Amundson, 1971). En este caso, ninguna enzima intracelular se filtra, las moléculas de sustrato de peso molecular más bien pequeño se difunden hacia la célula.

La validez de los resultados pronosticados por el modelo de regresión se confirmó realizando experimentos repetidos en condiciones óptimas de permeabilización (es decir, concentración de etanol; 35% - v v-1, temperatura; 15ºC y tiempo; 20 min.).

Los resultados obtenidos de tres repeticiones demostraron que el promedio de la actividad máxima de beta-galactosidasa (2.12 U mg-1) obtenida fue cercano al valor predicho (2.06 U mg-1). La excelente correlación entre los valores predichos y medidos de estos experimentos indica la validez del modelo de respuesta.

La estadística R2 indica el porcentaje de la variabilidad de los parámetros de optimización, que se explica en el modelo. Los gráficos de superficie de respuesta se utilizaron para determinar el nivel óptimo de las variables significativas para la actividad máxima de beta-galactosidasa de células de levadura permeabilizadas.

La aplicación del diseño de Box-Behnken en la actividad enzimática por SF IZ 275, se presentó como progreso en la predicción de las condiciones para la permeabilización celular. La superficie de respuesta demostró ser una herramienta poderosa para la optimización de bioprocesos que se convierte en un modelo matemático que predice la ubicación del rango óptimo. La actividad enzimática máxima de 2.12 U mg-1 se alcanzó a una concentración de etanol del 35% (vv-1), 15ºC y 20 min. El proceso de permeación se puede utilizar para otros estudios que requieren células permeabilizadas para obtener otros metabolitos de interés.

Estabilidad de almacenamiento

Las células de levadura después de la permeabilización en condiciones óptimas se han probado con respecto al mantenimiento de la actividad enzimática durante el almacenamiento. Las células mostraron una pérdida del 78% de la actividad enzimática cuando se almacenaron en tampón fosfato pH 6.8 a 5 ºC, durante un período de 9 días (Figura 2)

Según los resultados, se puede observar que hubo una disminución significativa en la actividad de la enzima entre el día 1 (2.61 U mg-1) y los días 2 y 3 (1.76 y 1.70 U mg-1, respectivamente) de almacenamiento. Después del día 3 hubo una disminución significativa restante hasta el día 9 (0.57 U mg-1).

Conclusión

El alcohol etílico puede mejorar efectivamente la permeabilidad de las células SF IZ 275. La optimización estadística de la permeabilización de la membrana celular por etanol se ha llevado a cabo con éxito utilizando RSM basado en el diseño factorial de Box-Behnken. El modelo matemático propuesto con parámetros estimados describe bien el proceso de permeabilización. Las condiciones operativas óptimas para que el proceso de permeabilización alcance la actividad enzimática máxima fueron una concentración de etanol del 35%, una temperatura de 15ºC y una duración del proceso de 20 minutos. Bajo estas condiciones de las variables de proceso, se encontró que el valor predicho de la actividad enzimática máxima era de 10.59 U mg-1. El hecho de que las células SF IZ 275 permeabilizadas con alcohol etanol retuvieran la actividad de la enzima durante un cierto período, lo que sugiere que estas células permeabilizadas podrían usarse como fuente de biocatalizador para diferentes aplicaciones. Además, el uso de células permeabilizadas puede ayudar a superar los problemas y costos asociados con la extracción y purificación de enzimas a partir de células de levadura y en el desarrollo de una tecnología de bajo costo para aplicaciones biotecnológicas.

Expresiones de gratitud

Los autores desean agradecer a la Coordinación de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Brasil por el apoyo financiero, y KROTON / UNOPAR para la escuela y la maestría.

Referencias

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Author notes

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