La cepa SF IZ 275 del Centro de Investigación y Graduación de Ciencia y Tecnología Lecheras, Universidade Norte do Paraná (UNOPAR) se obtuvo de la Fundación Andre Tosello - Colección de Cultura Tropical. Los cultivos de reserva se mantuvieron a 4ºC en tubos de ensayo de agar PDA (Agar Dextrosa Patata).

La cepa SF IZ 275 se cultivó inicialmente en un tubo de ensayo de agar PDA y se incubó a 35ºC durante 24 h. Luego se transfirieron tres colonias de bucle a matraces Erlenmeyer de 250 ml separados que contenían 50 ml de extracto de malta (15 g L-1). Los matraces se incubaron a 35ºC y se agitaron a 150 rpm durante 24 h. La densidad óptica (OD) se determinó a una longitud de onda de 570 nm utilizando un espectrofotómetro y la OD se ajustó a 0,6.

La cepa SF IZ 275 se utilizó como inóculo para la producción de beta-galactosidasa utilizando suero de queso como medio. El suero de queso obtenido de una cooperativa de productos lácteos local se desproteinizó añadiendo ácido láctico a pH 4,6 y calentando a 90 ° C durante 30 min. Luego se filtró a través del papel de filtro Whatman nº 1 para eliminar la proteína coagulada y se ajustó a pH 5.0 con solución de NaOH (50%). Luego se pasteurizó a 65 ° C durante 30 min. El suero de queso pasteurizado se inoculó con un inóculo al 10% (a densidad óptica, OD670 nm = 0,6) de SF IZ 275 y se incubó a 35 ° C, 150 rpm durante 24 h. Las células se recogieron de 5 ml de medio de fermentación mediante centrifugación a 5000 rpm durante 20 minutos y se lavaron con una solución de tampón fosfato 0,1 M (pH 6,8). La concentración de biomasa se monitorizó espectrofotométricamente con un espectrofotómetro Femto 700 Plus (Sao Paulo, Brasil).

La permeabilización celular se realizó en matraces Erlenmeyer de 25 ml, cada uno con 5 ml de la suspensión reactiva que consiste en 5 mg (peso seco) de células SF IZ 275 en tampón fosfato de potasio 0,1 M (pH 6,8) y etanol según el diseño experimental (Tabla 1 ). Los matraces se incubaron en un agitador orbital a 150 rpm a una temperatura y durante un tiempo, según el diseño anterior. El sobrenadante se eliminó mediante centrifugación a 5000 rpm durante 5 minutos y las células se lavaron dos veces con el mismo tampón. El sedimento final se resuspendió en 1 ml de tampón de fosfato potásico 0,1 M (pH 6,8) y la actividad enzimática de las células permeabilizadas se determinó como se describe más adelante.

La determinación de la actividad de beta-galactosidasa se realizó de acuerdo con Inchaurrondo, Yautorno y Voget (1994) . La actividad de beta-galactosidasa se ensayó utilizando el sustrato cromogénico ONPG (o-nitrofenil-β-galactopiranósido).

La muestra de 50 ml de suspensión celular permeabilizada (0,05 mg) se mezcló con 2 ml de ONPG 1,25 mM en tampón de fosfato de potasio 0,1 M (pH 6,6) y se incubó durante 5 minutos a 37 ° C. La reacción se suspendió mediante la adición de 0,5 ml de carbonato de sodio 1M. El ONPG liberado se midió espectrofotométricamente a 420 nm. Una unidad de actividad de beta-galactosidasa (U) se define como la cantidad de enzima que hidroliza 1 minuto de sustrato (ONPG) por minuto en las condiciones del ensayo. Todas las pruebas de actividad se realizaron por triplicado y se expresaron como valores medios.

La permeabilización de las células SF IZ 275 para la alta actividad de la beta-galactosidasa se realizó mediante un diseño y análisis factorial mediante el método de la superficie de respuesta. Las condiciones controladas para la concentración de etanol, la temperatura y el tiempo de incubación se analizaron de acuerdo con el factor 3 de 3 factores (-1; 0; +1) Box-Behnken Design (Montgomery, 2005) con tres repeticiones en el punto central que resumen 15 ejecuciones experimentales ( Tabla 1).

El modelo matemático para la función de respuesta (y = actividad de beta-galactosidasa) se expresó como:

Equation (1)

donde b0 es los coeficientes estimados en la superficie de respuesta y Xi Xj son variables reales en la variable dependiente. El análisis estadístico del modelo matemático se realizó con ANOVA (p <0.05) y el análisis de regresión con Statistica 6.0. Se generó superficie de respuesta para evaluar la respuesta.

Se estudió la capacidad de las células permeabilizadas tratadas con etanol para retener la actividad de beta-galactosidasa durante el almacenamiento. Una suspensión de 1 g de células (peso húmedo) en 20 ml de tampón de potasio 0,1 M (pH 7,0) se almacenó a 4ºC. A intervalos diarios durante 9 días, se separó un volumen predeterminado de suspensión por centrifugación y se determinó la actividad de beta-galactosidasa en las células separadas.

El polinomio de segundo grado propuesto se ajustó a los datos utilizando regresiones lineales múltiples para determinar las condiciones óptimas de permeabilización celular que dieron como resultado la actividad máxima de beta-galactosidasa. Los efectos del etanol, la temperatura y el tiempo se evaluaron cuantitativamente utilizando curvas de superficie de respuesta. Al aplicar el análisis de regresión múltiple en los datos experimentales, se encontró que el siguiente polinomio de segundo grado representa la relación entre las variables independientes probadas (Ecuación 2).

Los niveles predichos de actividad de beta-galactosidasa usando la Ecuación (2) se dan en la Tabla 1 junto con los datos experimentales. La importancia del ajuste del polinomio de segundo orden para la actividad de beta-galactosidasa se evaluó mediante el análisis de varianza (ANOVA) con los resultados mostrados en las Tablas 2.

El coeficiente de determinación (R 2 ) del modelo fue de 0,89648 (Tabla 2), que indicó que el modelo representó adecuadamente la relación real entre las variables en consideración. Un valor de R 2 de 0,89648 significa que el modelo explicó el 89,6% de la variabilidad, que es aceptable para el sistema biológico y solo el 10,4% se debió al azar. El coeficiente de variación (CV) obtenido fue de 12.95%. El Coeficiente de variación (CV) indica el grado de precisión con el que se realizaron los tratamientos. Un valor bajo de CV sugiere una alta confiabilidad del experimento (Mason, Gunst y Hess, 1989).

Los resultados obtenidos después de llevar a cabo ANOVA se presentan en la Tabla 2. Valores de 'Prob. > F 'menos de 0.05 indica que los términos del modelo son significativos. Los valores superiores a 0.10 indican que los términos del modelo no son significativos. El valor F de 'Falta de ajuste' de 2.02396 implica que hay una falta de ajuste insignificante. El valor de 'Falta de ajuste' (Prob> F) de 0.347587 implica que solo hay un 34.75% de probabilidad de que el valor F de 'Falta de ajuste' pueda ocurrir debido al ruido.

Para optimizar las variables que influyen en la actividad de la beta-galactosidasa de células SF IZ 275 permeabilizadas, se generaron gráficos de superficie de respuesta a partir del modelo de regresión. Las superficies de respuesta tridimensional para la actividad de beta-galactosidasa: concentración de etanol, temperatura y tiempo se representaron gráficamente (Figura 1).

La Figura 1a muestra los efectos de la temperatura y la concentración de etanol sobre la actividad de la beta-galactosidasa. La permeabilización con baja concentración de etanol y baja temperatura del proceso mostró la actividad enzimática más baja. La actividad de beta-galactosidasa fue mayor en el rango de temperatura de 15 a 25ºC y la concentración de etanol hasta ca. 35%. Panesar et al. (2007), mostraron que las condiciones de proceso óptimas para la permeabilización celular de Kluyveromyces marxianus NCIM 3465 fueron 50% (v v-1) de concentración de etanol, temperatura de 25ºC y tiempo de tratamiento de 15 min.

Equation (2)

Tabla 2
Análisis de varianza (ANOVA) para la actividad de beta-galactosidasa de Saccharomyces fragillis IZ 275 permeabilizada por modelo cuadrático.

* Significativo p < 0,05. R cuadrado - 0,896; R cuadrado ajustado - 0.710; Desviación estándar - 1.209; CV% - 12.95.

Figura 11b representa la gráfica de la superficie de respuesta en función del tiempo frente a la concentración de etanol. El cambio de tiempo no afecta significativamente la curvatura de la superficie. De una representación gráfica hay una dependencia de la actividad de beta-galactosidasa en la concentración de agente permeabilizante (etanol 32 - 35%). Se obtuvo una permeabilización máxima de 2.816 mmol de L-1ONP min-1 g-1 tratando las células con 75% (vv-1) de etanol a 20 ° C durante 15 min. ( De Faria et al., 2013 ). La Figura 1c muestra una alta efectividad de permeabilización dentro del rango de tiempo y temperatura estudiados, mientras que por debajo y por encima de estos rangos se puede observar una disminución significativa de la actividad. Esto confirma que el rango de estas variables se eligió correctamente y fue suficiente para el proceso.

En este estudio también quedó claro que el efecto de la concentración de etanol sobre la actividad de la beta-galactosidasa era más importante que la temperatura y el tiempo. En un estudio preliminar realizado por nuestro grupo, se demostró que dentro del rango de temperatura y tiempo analizados a diferentes concentraciones de etanol 50, 75 y 100%, había una alta actividad de beta-galactosidasa sin diferencias significativas.

Trawczynska y Wójcik (2015) definieron las condiciones óptimas de operación para la permeabilización de las células de levadura al 53% de la concentración de etanol, temperatura de 14.8ºC y tiempo de tratamiento de 40 min. El uso de células de levadura completas como biocatalizadores es una alternativa muy prometedora y ha ganado mucho interés en los últimos años ( Yu et al., 2007 ).

Las células completas de SF IZ 275 no mostraron actividad de beta-galactosidasa. El mecanismo de liberación de enzimas no ha sido completamente estudiado. Sin embargo, no se cree que la lisis de la pared celular sea el modo de solubilización de enzimas. Quizás el solvente extraiga un componente lipídico de la membrana celular de la levadura, permitiendo la filtración de proteínas intracelulares o periplásmicas. Se ha informado un procedimiento similar que utiliza concentraciones más bajas de disolvente (<20%) para la medición de la enzima intracelular in situ (Wendorff y Amundson, 1971). En este caso, ninguna enzima intracelular se filtra, las moléculas de sustrato de peso molecular más bien pequeño se difunden hacia la célula.

La validez de los resultados pronosticados por el modelo de regresión se confirmó realizando experimentos repetidos en condiciones óptimas de permeabilización (es decir, concentración de etanol; 35% - v v-1, temperatura; 15ºC y tiempo; 20 min.).

Figura 1
Gráfico de la superficie de respuesta que representa el efecto de a) temperatura y concentración de etanol, b) tiempo y concentración de etanol, c) tiempo y temperatura sobre la actividad beta-galactosidasa (U mg -1 ) de células de Saccharomyces fragilis IZ 275 permeabilizadas.
Fuente: Autores.

Figura 1 (Cont.)
Gráfico de la superficie de respuesta que representa el efecto de a) temperatura y concentración de etanol, b) tiempo y concentración de etanol, c) tiempo y temperatura sobre la actividad beta-galactosidasa (U mg -1 ) de células de Saccharomyces fragilis IZ 275 permeabilizadas.
Fuente: Autores.

Figura 1 (Cont.)
Gráfico de la superficie de respuesta que representa el efecto de a) temperatura y concentración de etanol, b) tiempo y concentración de etanol, c) tiempo y temperatura sobre la actividad beta-galactosidasa (U mg -1 ) de células de Saccharomyces fragilis IZ 275 permeabilizadas.
Fuente: Autores.

Los resultados obtenidos de tres repeticiones demostraron que el promedio de la actividad máxima de beta-galactosidasa (2.12 U mg-1) obtenida fue cercano al valor predicho (2.06 U mg-1). La excelente correlación entre los valores predichos y medidos de estos experimentos indica la validez del modelo de respuesta.

La estadística R2 indica el porcentaje de la variabilidad de los parámetros de optimización, que se explica en el modelo. Los gráficos de superficie de respuesta se utilizaron para determinar el nivel óptimo de las variables significativas para la actividad máxima de beta-galactosidasa de células de levadura permeabilizadas.

La aplicación del diseño de Box-Behnken en la actividad enzimática por SF IZ 275, se presentó como progreso en la predicción de las condiciones para la permeabilización celular. La superficie de respuesta demostró ser una herramienta poderosa para la optimización de bioprocesos que se convierte en un modelo matemático que predice la ubicación del rango óptimo. La actividad enzimática máxima de 2.12 U mg-1 se alcanzó a una concentración de etanol del 35% (vv-1), 15ºC y 20 min. El proceso de permeación se puede utilizar para otros estudios que requieren células permeabilizadas para obtener otros metabolitos de interés.

Las células de levadura después de la permeabilización en condiciones óptimas se han probado con respecto al mantenimiento de la actividad enzimática durante el almacenamiento. Las células mostraron una pérdida del 78% de la actividad enzimática cuando se almacenaron en tampón fosfato pH 6.8 a 5 ºC, durante un período de 9 días (Figura 2)

Figure 2
Storage stability of the beta-galactosidase activity.
Source: Authors.

Según los resultados, se puede observar que hubo una disminución significativa en la actividad de la enzima entre el día 1 (2.61 U mg-1) y los días 2 y 3 (1.76 y 1.70 U mg-1, respectivamente) de almacenamiento. Después del día 3 hubo una disminución significativa restante hasta el día 9 (0.57 U mg-1).

lrodrigomorioka@gmail.com