Con la participación activa de personas integrantes de las comunidades cercanas a los bosques estudiados, se delimitaron tres parcelas rectangulares de 500 m. en las plantaciones, dentro de las cuales se realizó un censo árbol por árbol, con el propósito de establecer el número total de árboles presentes, la cantidad de árboles con síntomas de enfermedad, árboles muertos y árboles aparentemente sanos. Para el cálculo se empleó la ecuación [1] usada por Belezaca, et al. (2018):

[1]

La severidad de la enfermedad, se estimó mediante una escala arbitraria de cinco categorías, propuesta por Salas-Rodríguez, et al. (2016) y Barros y Turpo (2020), que consideró las diferencias morfológicas visibles de ramas, hojas y fuste, y contrastó con árboles sanos (ver Tabla 2). Además, se realizó una descripción detallada de la sintomatología de la enfermedad, considerando diferencias morfológicas externas e internas entre árboles enfermos y sanos.

Tabla 2
Escala arbitraria de cinco categorías para evaluar la severidad de la enfermedad de pudrición del fuste en G. arborea

Elaboración propia, 2020, con base en Salas-Rodríguez, et al. (2016) y Barros y Turpo (2020).

En las parcelas de todas las plantaciones estudiadas, se muestrearon 3 árboles (7±0,5%) con síntomas de enfermedad, y apearon mediante un corte con motosierra sobre el nivel del suelo. Para detectar evidencias de los lugares de ingreso y diseminación del o los fitopatógenos en tejidos internos de árboles enfermos, se inspeccionó las heridas naturales y de origen antropogénico (poda de ramas, cortes de machete, entre otros) mediante cortes tangenciales y transversales en el fuste (cada 70 cm). En estas labores participaron activamente personas de las comunidades cercanas a los bosques estudiados.

Secciones de madera con evidencia de necrosis, se recolectaron, guardaron en bolsas plásticas, rotularon (fecha de recolección, procedencia, número de árbol, edad de la plantación, entre otros) y trasladaron al Laboratorio de Microbiología Ambiental y Vegetal de la Universidad Técnica Estatal de Quevedo (UTEQ), para su análisis fitopatológico.

En el laboratorio, los tejidos necróticos fueron acondicionados y analizados mediante tres estrategias metodológicas, y las evaluaciones se realizaron en conjunto con la participación de personas seleccionadas por las comunidades vinculadas al estudio:

a. Cámara húmeda: Tejidos necrosados se introdujeron en bolsas plásticas conteniendo papel humedecido, e incubaron durante 96 horas a temperatura constante (24±2.C). Luego de la incubación y con ayuda de un estereomicroscopio, los tejidos se analizaron en busca de signos (micelio, cuerpos fructíferos, entre otros) presentes (Belezaca, Suárez y Vera, 2011;Belezaca, et al., 2018). Cuando se detectaron signos de microorganismos creciendo en la madera, estos se trasladaron al medio de cultivo papa-dextrosa-agar (PDA), más 0,2 ml de una mezcla de antibióticos (50 µg/ml de penicilina y 25 µg/ml de estreptomicina), bajo condiciones de asepsia (Parkinson, 1994; Suryanarayanan, 2013).

b. Siembra en sándwiches de zanahoria: Para estimular la manifestación, de microorganismos fungosos de difícil expresión inicial en medio de cultivo PDA, se realizaron siembras con segmentos de tejidos necrosados de aproximadamente 2 x 2 x 0,5 cm (largo, ancho y espesor) entre dos rodajas de zanahoria, apretados con cinta de papel, formando una especie de sándwiches (Piveta, et al., 2016; Belezaca, et al., 2018).

Por cada árbol enfermo muestreado se formaron 10 sándwiches, e introdujeron en recipientes plásticos estériles (1.000 cm.), cerraron e incubaron durante 120 horas (5 días). Después de la incubación y con asistencia de un estereomicroscopio, los sándwiches se analizaron en busca de signos (micelio, cuerpos fructíferos, entre otros) presentes sobre la zanahoria, y cuando fueron detectados, se trasladaron a medio de cultivo PDA + antibióticos, bajo condiciones de asepsia (Parkinson, 1994; Belezaca, et al., 2018).

c. Siembras directas en medio de cultivo PDA: Con un cuchillo afilado se cortaron segmentos de madera de aproximadamente 0,5 x 0,5 cm, a partir de tejidos necróticos internos de cada árbol enfermo muestreado, y sembraron cuatro pedacitos de madera necrótica en cinco placas de Petri conteniendo 10 ml de medio de cultivo PDA + 0,2 ml de una mezcla de antibióticos (50 µg/ml de penicilina y 25 µg/ml de estreptomicina) (Parkinson, 1994; Massimo, et al., 2015; Belezaca, et al., 2018), y dejó incubar durante 96 horas a 24±2.C. Pasado este tiempo, los hongos desarrollados en el medio de cultivo se identificaron con la ayuda de claves taxonómicas (Von Arx, 1981;Barnett y Hunter, 1987; Hanlin, 1992; Raja, et al., 2017).

Los datos obtenidos a nivel de campo y laboratorio, se analizaron empleando herramientas de estadística descriptiva. Para establecer si existían o no diferencia estadísticas significativas en la presencia (número de colonias) de hongos aislados, los datos se sometieron a un análisis de varianza (ANOVA) con un nivel de significancia de 95% (P < 0.05), previa comprobación de los supuestos de normalidad y homocedasticidad de varianzas. Posteriormente, se aplicó la prueba LSD (mínima diferencia significativa), con un nivel de significancia del 95% (P < 0.05). Para el efecto se empleó el paquete estadístico SYTAT 11 versión para Windows.

Los árboles de G. arborea en estadios iniciales de la enfermedad, muestran una leve clorosis, y pérdida de turgencia en hojas de los extremos de ramas superiores, con características de marchitamiento. Considerando el bloqueo vascular y avance gradual de la enfermedad, los ápices de crecimiento se secan y progresivamente las ramas mueren completamente. En árboles enfermos el vigor disminuye significativamente, en comparación a árboles vecinos sanos, debido principalmente a la marchitez del área fotosintética. Una vez comprometida el área foliar, los árboles enfermos como mecanismo de supervivencia emiten numerosos brotes epicormicos en el fuste, estimulados por la necesidad de realizar fotosíntesis. Sin embargo, como el taponamiento vascular continúa impidiendo el flujo y reflujo de sustancias nutricionales, finalmente el árbol muere (ver Figura I).

Figura I:
Evolución de la enfermedad de marchitez vascular y pudrición del fuste en árboles de melina

Elaboración propia, 2020. Nota: A = Primeros síntomas caracterizados por clorosis (marchitamiento) en las hojas producto del taponamiento vascular. B = Generación de múltiples brotes epicormicos en el fuste. C = Muerte del sistema foliar del árbol.

En árboles enfermos, es común observar la presencia de fluidos de tonalidad oscura, liberados desde heridas de origen antropogénico (heridas de podas, raleos, heridas naturales, entre otras), tal como se puede observar en la Figura II. De acuerdo a las observaciones y experiencias de los grupos sociales que viven cerca de los bosques, generalmente, en los árboles enfermos no se observa la presencia de insectos barrenadores de corteza y/o madera.

Figura II:
Presencia de fluidos de color oscuro emanados desde heridas

Elaboración propia, 2020. Nota: A = Heridas en el fuste causadas por malas prácticas de raleo. B y C= Heridas de podas no protegidas en el fuste. D = Herida natural por partidura de la corteza en la parte baja del fuste.

Esta enfermedad presenta una sintomatología compleja, similar a la reportada en otras especies forestales de importancia económica de la región, como en Schizolobium parahybum (Geldenhuis, et al., 2004;Belezaca, et al., 2011), Acrocarpus fraxinifolius (Belezaca, et al., 2012), que destruyeron plantaciones enteras entre las décadas de 1990 y 2000; Tectona grandis (Belezaca, et al., 2018), cuya enfermedad apareció a principios de la década pasada y continua eliminado miles de árboles en el THE, hasta el presente.

Al realizar cortes transversales en la base de los árboles (5 – 10 cm sobre el nivel del suelo), en la mayoría de los casos no se observaron síntomas de necrosis o taponamiento de los tejidos vasculares (ver Figura III).

Figura III:
Cortes transversales en la base de árboles de melina enfermos (5 – 10 cm sobre el nivel del suelo) muestran lignificación alrededor de la medula, pero ausencia de necrosis y daños vasculares

Elaboración propia, 2020. Nota: A = árbol de 2 años de edad. B = árbol de 3.5 años de edad, C = árbol de 5 años de edad.

De igual manera, cortes transversales y longitudinales por sobre los 50 cm del nivel del suelo, evidencian los daños ocasionados por él o los patógenos en tejidos vasculares, necrosamiento y taponamiento de vasos conductores, que impiden el normal flujo y reflujo de soluciones nutritivas y fotoasimilados (ver Figura IV).

Figura IV:
Daños vasculares detectados mediante cortes transversal y longitudinal en árboles de melina enfermos (sobre los 50 cm del nivel del suelo), evidenciando necrosis en la albura, duramen, y taponamiento de tejidos vasculares

Elaboración propia, 2020.

Para establecer la forma de ingreso del o los fitopatógenos en tejidos xilemáticos de los árboles, se analizaron heridas naturales y de origen antropogénico. Resultó evidente que el ingreso del o los fitopatógenos, ocurre principalmente por heridas mecánicas de origen antropogénico, como podas de ramas y cortes accidentales durante las actividades de control de arvenses.

Se detectó que la mayor parte de heridas estaban cicatrizadas, sin embargo, enmascaraban el ingreso previo del patógeno, quien bajo la corteza estaba diseminado tanto en sentido radial, ascendente y descendente, colonizando la madera de albura y duramen, ocasionado necrosamiento y taponamiento de los tejidos vasculares, que finalmente, culminan con la muerte del árbol. En algunas ocasiones las heridas no se encuentran cicatrizadas, sino expuestas, desde donde emanan constantemente fluidos de color café con olor a materia orgánica en descomposición (ver Figura V).

Figura V:
Heridas mecánicas cicatrizadas y no cicatrizadas, como sitios de ingreso y diseminación del o los fitopatógenos asociados a la enfermedad de marchitez vascular y pudrición del fuste en árboles de melina

Elaboración propia, 2020.

Las observaciones a nivel de campo, dan cuenta que él o los fitopatógenos ingresan a los árboles de melina por heridas mecánicas, generadas mediante podas de ramas, y lesiones por herramientas afiladas (machetes) durante labores culturales, como limpieza de arvenses. Sin embargo, no hay que descartar factores abióticos como el viento, que pueden generar microlesiones por torceduras en el fuste, empleándolas como puertas de ingreso, y colonizadas fácilmente por hongos fitopatógenos (Kamgan, et al., 2010;Agler, et al., 2016).

No obstante, el comportamiento detectado en los árboles de G. arborea frente a la enfermedad no es uniforme; generalmente, la manifestación de los síntomas iniciales es difícil de detectar, puesto que la clorosis y pérdida de turgencia sucede cuando los tejidos xilemáticos y basculares de los árboles, están irremediablemente comprometidos y necrosados, tanto en sentido radial como tangencial, impidiendo el normal flujo de sabia (Valverde-Otárola, Arias-Aguilar y Castillo, 2018). La defoliación, muerte de yemas de crecimiento y secamiento de ramas, son observables en estados avanzados de la enfermedad. Es común la presencia de heridas de origen natural y/o antropogénicas en el fuste, con abundante exudación de fluidos de color café oscuro, con un fuerte olor a materia orgánica en descomposición.

Es de destacar, la resiliencia que presentan varios árboles de melina, que al momento de ser evaluados no muestran ningún síntoma visible de enfermedad, sin embargo, al ser apeados y cortados transversal y longitudinalmente en el fuste, los tejidos internos están completamente necrosados en todas direcciones, lo cual dificulta identificar árboles en estadios iniciales de la enfermedad.

Por otra parte, observaciones a nivel de campo, dan cuenta de la existencia de árboles a quienes la enfermedad parece no ejercer mayores daños, lo que hace sospechar la presencia de individuos con aceptables niveles de tolerancia/resistencia frente a la enfermedad. Este comportamiento obedecería a la variabilidad genética, propia de individuos obtenidos a partir de semillas de libre polinización (Bräutigam, et al., 2013;Inza, et al., 2018), que pueden ser aprovechados en futuros programas de mejoramiento genético de la especie.

Desde la introducción de G. arborea en los sistemas de producción del THE a mediados de la década de 1980, no se habían reportado problemas fitosanitarios serios, pero en la última década debido al aumento de la superficie plantada con esta especie forestal, los problemas fitosanitarios son recurrentes como lo mencionan Saltos (2019) así como Macías (2019). Este comportamiento y la presencia de la enfermedad de “marchitez vascular y pudrición del fuste”, podrían estar relacionados con la masificación de plantaciones, aumento de la superficie plantada, susceptibilidad de la especie, el clima, y el impacto de las actividades antropogénicas a nivel global. Factores que, desde el punto de vista de la Patología Forestal, predisponen a los árboles a enfermarse (Haas, et al., 2011; Bostock, Pye y Roubtsova, 2014;Hughes, et al., 2015), generando un desconcierto socioeconómico.

En la plantación de 2 años de edad, se detectaron en promedio 10 árboles enfermos, y 2 árboles muertos por parcela (500 m.), lo que permitió inferir la existencia de 200 árboles enfermos y 40 árboles muertos por ha^-1. En las parcelas de la plantación de 3,5 años, en promedio se encontraron 3 árboles enfermos y ningún árbol muerto, dando como resultado 60 árboles enfermos y cero árboles muertos por ha^-1. Mientras que, en la plantación de 5 años, se hallaron 4 árboles enfermos, y 2 árboles muertos en promedio por parcela, cuyos resultados representaron 80 árboles enfermos, y 40 árboles muertos por ha^-1. Estos resultados muestran que la incidencia de la enfermedad fue del 17,9%, 7,9%, y 8,5% para las plantaciones de melina de 2; 3,5 y 5 años, respectivamente (ver Tabla 3).

Tabla 3
Número de árboles aparentemente sanos, enfermos, muertos por ha-1, e incidencia de la enfermedad de muerte regresiva y marchitez vascular en tres plantaciones de G. arborea de diferentes edades en el Trópico Húmedo Ecuatoriano

Elaboración propia, 2020. Nota: Valores representan el promedio de tres repeticiones con su respectivo error estándar.

La mayor parte de árboles enfermos presentes en la plantación de 2 años, se encasillaron en las escalas 2 y 4, lo cual indica que el 9,52% de los árboles se encontraron con presencia de la enfermedad, en estado de progreso medio, y el 7,14% estaban muertos en pie (escala 5). Mientras que, en la plantación de 3,5 años, los árboles enfermos se ubicaron en escala 2 con el 7,14%. En la plantación de 5 años, se detectaron árboles con diferentes niveles de la enfermedad encasillados en la escala 2, 3, 4 y 5, con 8,51%; 4,25%; 2,13% y 6,38%; respectivamente (ver Tabla 4).

Tabla 4
Severidad de la enfermedad de marchitez vascular y pudrición del fuste por ha-1, en plantaciones de G. arborea de 2; 3,5 y 5 años de edad

Elaboración propia, 2020.

La incidencia de la enfermedad detectada en las tres plantaciones, podría considerarse alta, y es una alerta sobre los daños que puede generar a la industria nacional de la melina, si no se consideran estrategias adecuadas de prevención y manejo de la enfermedad. Si bien, se encontraron árboles enfermos en todos los niveles de la escala propuesta, la mayor parte de los mismos se detectaron en estado inicial de la enfermedad, pero es cuestión de tiempo para que la sintomatología progrese y los árboles pasen a niveles superiores de la escala.

El incremento diamétrico y altura de los árboles de melina, estuvo determinado por la edad de las plantaciones evaluadas. Los diámetros y alturas promedio se incrementaron con la edad, tal como se puede apreciar en la Tabla 5.

Tabla 5
Diámetros y alturas (máximos, medios y mínimos) obtenidos en tres plantaciones de G. arborea de 2; 3,5 y 5 años de edad, afectadas por la enfermedad de marchitez vascular y pudrición del fuste en el Trópico Húmedo Ecuatoriano

Elaboración propia, 2020. Nota: Valores representan el promedio de tres parcelas con su respectivo error estándar.

En el 33% de los tejidos leñosos necrosados incubados en cámara húmeda, se detectó la presencia de ascocarpos globosos de color negro, de morfología peritecial, que cubrían las áreas necróticas de la madera. Sándwiches de zanahoria, conteniendo tejidos necrosados, luego de la incubación mostraron presencia de micelio y peritecios en el 55% de los árboles enfermos.

Las siembras de pequeñas secciones de madera necrosada en medio de cultivo PDA, generaron colonias fúngicas color negro y presencia de peritecios globosos, con varios apéndices (fimbrias) en el extremo del cuello, mostrando acumulación de masas esféricas de ascosporas color amarillo pálido. Colonias puras del hongo, repicadas en medio de cultivo PDA, generaron peritecios jóvenes hialinos a las 72 horas, que van tornándose oscuros cuando maduran, hasta volverse completamente negros.

Los peritecios presentan una base globosa, cuello alargado con longitudes entre 800-900 µm, presencia de fimbrias en el extremo superior del cuello rodeando al ostiolo. Sobre las fimbrias, se agrupan masas de apariencia hialina o cremosa, constituidas por ascosporas maduras liberadas por lisis de las ascas al interior del peritecio. Las ascosporas, son unicelulares (no septadas), hialinas, tienen forma elíptica, con apariencia de sombrero, y dimensiones de 4-8 x 2-5 µm. Estas características permitieron identificar al hongo como Ceratocystis fimbriata Ellis & Halst. Además, se aislaron colonias fúngicas de color blanco y apariencia algodonosa, que mediante claves taxonómicas morfológicas se identificaron como Fusarium spp.

Asimismo, se detectaron diferencias estadísticas significativas en el número de colonias fúngicas aisladas en medio de cultivo PDA, desde tejidos necrosados de árboles enfermos. Fusarium spp., mostró mayor número de colonias, mientras que C. fimbriata, tuvo menor presencia. En la plantación de dos años de edad (F=7,05; P=0.001), se obtuvieron en promedio 15 colonias de Fusarium spp. y 5 de C. fimbriata, mientras que en árboles de 3,5 años (F=19.3; P=0.000) se obtuvo 17 y 3 colonias; y en árboles de 5 años (F=17.4; P=0.000) 6 y 14 colonias de Fusarium spp. y C. fimbriata, respectivamente (ver Tabla 6).

Tabla 6
Número de colonias de C. fimbriata y Fusarium spp. aisladas desde árboles enfermos en tres plantaciones de G. arbórea

Elaboración propia, 2020 Nota: Valores corresponden al promedio de colonias obtenidas por cada árbol, con su respectivo error estándar.

La presencia de hongos fitopatógenos como Fusarium spp. y C. fimbriata, asociados a árboles enfermos de G. arborea, demuestra el riesgo que enfrentan las plantaciones de esta especie forestal en el THE, debido a que ambos microorganismos son altamente patogénicos en varias especies vegetales leñosas a nivel global. Existen evidencias que Fusarium spp. ocasiona daños en plantaciones de Gmelina arborea en Costa Rica (Arguedas-Gamboa, 2004; Murillo-Gamboa, et al., 2016), y en Pinus radiata en España (Hernández-Escribano, et al., 2018). Mientras que C. fimbriata está asociado a enfermedades en Theobroma cacao en Latinoamérica (Harrington, 2013), A. fraxinifolius y Tectona grandis en Ecuador (Belezaca, et al., 2012;Belezaca, et al., 2018), y Eucaliptus spp. en Brasil (Ferreira, et al., 2011).

Tomando en cuenta los hallazgos encontrados, así como los beneficios de tipo social que arrojan las plantaciones de melina para la producción de madera, sobre todo en renglones tales como creación de empleos y futuros efectos en el desarrollo económico del país, resulta sumamente conveniente establecer alianzas estratégicas entre la academia y la sociedad, específicamente con comunidades aledañas a estas plantaciones, logrando la motivación en el “desarrollo de actitudes ambientales con la problemática de su entorno local” (Yangali, et al., 2021, p.387), con el fin de lograr el control y saneamiento de estas enfermedades forestales en detrimento de la estabilidad laboral, que conlleva a una mejor calidad de vida, así como en función del desarrollo forestal ecuatoriano.