Nuevas variantes genéticas asociadas a miocardiopatía dilatada adquirida. Hacia un nuevo panel poligénico predisponente

New Genetic Variants Associated with Acquired Dilated Cardiomyopathy. Towards a New Predisposing Polygenic Panel

MARIO B. PRINCIPATO^MTSAC mbprincipato@yahoo.com.ar

Hospital General de Agudos JM Ramos Mejía, Argentina

ANALÍA G. PAOLUCCI

Hospital General de Agudos JM Ramos Mejía, Argentina

ROCÍO DEL CIELO VILLA FERNÁNDEZ

Hospital General de Agudos JM Ramos Mejía, Argentina

M. VICTORIA CARVELLI^MTSAC

Hospital General de Agudos JM Ramos Mejía, Argentina

PAOLA SETTEPASSI

Hospital General de Agudos JM Ramos Mejía, Argentina

ALEJANDRO TOMATTI

Hospital General de Agudos JM Ramos Mejía, Argentina

M ALEJANDRA VON WUFFEN

Hospital General de Agudos JM Ramos Mejía, Argentina

MANUEL LAGO

Hospital General de Agudos JM Ramos Mejía, Argentina

JUSTO CARBAJALES^MTSAC

Hospital General de Agudos JM Ramos Mejía, Argentina

La insuficiencia cardíaca con fracción de eyección ventricular izquierda reducida (FEVIr) representa una de las patologías con mayor mortalidad. Entre sus principales etiologías se destaca la miocardiopatía dilatada (MCD). Los predictores del desarrollo y pronóstico de la MCD están sujetos a continua investigación. A pesar de los avances en el entendimiento de los mecanismos fisiopatológicos subyacentes, las razones por las cuales ciertas condiciones predisponen a la evolución hacia la miocardiopatía dilatada aún no se comprenden completamente. (1)

Se han identificado alteraciones genotípicas (familiares) responsables de un pequeño grupo de casos con el fenotipo de dilatación ventricular.

Un aspecto notable es que la misma noxa puede generar efectos variables entre distintos pacientes. Esto sugiere la posible existencia de una predisposición genética que influiría en una evolución clínica diferenciada. En este contexto, los polimorfismos de nucleótido único (SNPs) podrían desempeñar un papel clave en la variabilidad de la respuesta de los pacientes ante una misma noxa.

Para investigar la existencia de variantes genéticas asociadas con la predisposición a la MCD utilizamos la enfermedad de Chagas como modelo. (2)

La enfermedad de Chagas es responsable de la MCD con mayor morbilidad y mortalidad. Presenta dos fases clínicas: una aguda, que suele ser asintomática en el 95 % de los pacientes, y una fase crónica, con un período de latencia prolongado de 10-30 años. En este grupo, entre el 25% y el 30% de los individuos, desarrollan signos o síntomas de afectación cardíaca (miocardiopatía chagásica). (3)

La miocardiopatía chagásica crónica (MCC) se ha considerado como la causa más frecuente de miocardiopatía no isquémica en Argentina. Sin embargo, no existe consenso sobre los indicadores de riesgo para el desarrollo de esta afección y otros eventos cardiovasculares, independientemente del efecto de los factores de riesgo tradicionales. (4)

El objetivo de nuestro estudio fue determinar las variantes genéticas relacionadas con la presencia de MCD realizando un análisis de asociación con SNPs.

Estudio unicéntrico prospectivo que incluyó pacientes desde junio de 2016 hasta enero de 2020.

Se incluyeron pacientes de 21 a 80 años, seropositivos para enfermedad de Chagas con MCD, provenientes de las provincias del noroeste argentino y sur de Bolivia, y otros serológicamente positivos de edad similar, procedentes de las mismas áreas geográficas sin MCD, como grupo control.

Todos debían contar con una antigüedad conocida por el paciente de la infección de más de 20 años certificada por médico tratante, análisis serológico y abandono del área endémicas por más de 20 años. Los pacientes debían tener una FEVI medida dentro de los 12 meses previos a su inclusión, ≤ 35% o ≥ 50%.

Se excluyeron pacientes que rechazaron firmar el consentimiento informado, aquellos con patologías conocidas graves (excluida la cardiovascular) que generen una expectativa de vida menor a un año, y aquellos que estuvieran participando en protocolos de investigación en los 30 días previos a la toma de la muestra. También se rechazaron aquellos en los que no se podía asegurar su contacto personal o telefónico, aquellos con abuso de alcohol o drogas en los últimos 6 meses, con clínica y laboratorio de insuficiencia hepática (valor de transaminasas x3 y bilirrubina total >2 mg/dL), con FEVI entre 36% y 49 % (el objetivo fue separar los grupos evitando el cruce de pacientes), y los que recibían drogas de conocida acción sobre los parámetros cardiovasculares (inmunosupresores, nitratos, estrógenos). También se excluyó a los pacientes con enfermedad coronaria en etapa aguda o crónica, con indicación de revascularización o con angioplastia coronaria o cirugía de revascularización miocárdica en los 6 meses anteriores, pacientes con insuficiencia renal (creatinina sérica >2,5 gr / dL), con enfermedad pulmonar obstructiva grave, con MCD de otras etiologías (ej.: artritis reumatoidea, diabetes, hipertensión arterial), con enfermedades valvulares significativas (excepto las secundarias a dilatación del anillo valvular mitral y/o tricuspídeo), con marcapasos con estimulación mayor al 50%, o con patologías autoinmunes (lupus, esclerodermia, hepatitis C, etc.).

Los pacientes que cumplieron con los criterios de inclusión y no presentaron criterios de exclusión fueron divididos en 2 grupos:

• Grupo 1: pacientes con FEVI ≤ 35%.

• Grupo 2: individuos con FEVI ≥ 50%.

Luego de la firma del consentimiento informado se les realizó una historia clínica y examen físico completos, acorde con su patología de base y los procedimientos diagnósticos y pronósticos correspondientes.

Se efectuó un ecocardiograma para confirmar el valor de FEVI y un ECG de 12 derivaciones. Según los resultados del ECG, los pacientes se clasificaron en dos grupos: con trastornos de la conducción intraventricular (TCIV), cuando tenían uno o más de los siguientes criterios: bloqueo de rama derecha, bloqueo de rama izquierda, hemibloqueo anterior izquierdo y hemibloqueo posterior izquierdo; o sin TCIV.

Los pacientes fueron codificados con un sistema alfanumérico para garantizar la identidad de los grupos.

Personal capacitado realizó una toma de sangre de 10 mL para la determinación genómica. La muestra fue colocada en tubos con presencia de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) según normas ISO para evitar su coagulación, y conservada a -20ºC hasta su procesamiento. Esta muestra fue procesada para la obtención del ácido desoxirribonucleico (ADN) correspondiente, en un centro especializado de nuestro país, quedando muestras de seguridad.

El ADN se envió vía un courier autorizado por legislación internacional a tal fin al laboratorio internacional Xenética Cardiovascular, Instituto de Investigación Sanitaria de Santiago, laboratorio nº1, Complexo Hospitalario Universitario de Santiago de Compostela, donde se realizó el genotipado y su análisis (Tabla 1). El laboratorio permaneció ciego respecto a qué grupo pertenecían los pacientes. Esto era solamente conocido por el equipo estadístico al momento del análisis.

Se preparó un panel de SNPs de genes relacionados con:

• El proceso de contracción y relajación ventricular (TTN, BAG3, MTSS1). (5,6,7)

• El metabolismo miocárdico (PPARGC1A, SIRT1, AKT1 mTOR, AMPK, PRKAA2).

• El receptor adrenérgico beta 1 (ADRB1). (8,9,10,11)

• El receptor colinérgico muscarínico 2 (CHRM2).

• El receptor de angiotensina II tipo 1 (AGTR1B).

• El péptido natriurético auricular (NPPA).

• Reguladores del ciclo celular (CDKN1A, RYR2)

• Estructura sarcomérica (ATP2A2, DSP, JUP)

• Energía celular (PRKAB2, PRKAB1)

• Actividad mitocondrial (SOD 2)

• Apoptosis (AKT1)

• Regulador de la hipoxia celular (HIF1A)

• Cadena respiratoria (LDHA, lactato deshidrogenasa (LDH))

• Óxido Nítrico (NOS1, NOS2P3)

• Factores de crecimiento e inflamación (SH2B3)

Se utilizó la base internacional The Genome Aggregation Database (GnomAD) eligiendo SNPs con una frecuencia del 10 % al 40 % en la población incorporada a esta base de datos.

Finalmente se seleccionaron 68 SNPs para su análisis, los cuales se hallan detallados en la tabla S1.

La tecnología utilizada fue iPLEX Gold. Se realizó el script en SNPassoc para evaluar si cumplían el estado de equilibrio H-W toda la población.

Se evaluó la asociación entre estos dos fenotipos, como variables binomiales codificadas como SI = 1 y NO = 0, con los SNPs codificados como una variable ordinal según la siguiente convención: 0 para homocigotos del alelo tipo salvaje, 2 para homocigotas del alelo alternativo y 1 para los heterocigotos.

Para la evaluación de la relación entre los diferentes SNPs en estudio y la presencia de una FEVI reducida, se utilizaron diversos modelos de inteligencia artificial para aprendizaje supervisado. Se evaluó el desempeño de 1) Regresión Logística, 2) Máquinas de Vectores de Soporte, 3) Redes neuronales artificiales, 4) Naive Bayes, 5) Árboles de decisión y 6) Random Forest, con la colaboración del equipo de Inteligencia Artificial de genomIT.

La evaluación del desempeño de los distintos modelos para la predicción de la FEVI reducida, se efectuó mediante la técnica de validación cruzada, cross-validation, utilizando la métrica F1 como medida de precisión para seleccionar el mejor modelo.

Para la evaluación de la relación entre cada SNP y la presencia de TCIV se evaluó un modelo de regresión logística univariado con la presencia de FEVI reducida y TCIV como desenlaces y cada SNP como predictor. Se seleccionaron los SNPs con un p valor asociado < 0,05, para la evaluación de su efecto mediante un modelo de regresión logística multivariado, seleccionando aquellos SNPs con un valor p < 0,05, a través de la estrategia backward selection con el método stepwise regression. La magnitud de la asociación entre cada SNP y el desenlace en estudio se expresó como el Odds Ratio y su respectivo intervalo de confianza del 95 % (IC95%). La performance predictiva del modelo fue evaluada usando el área bajo la curva. El mismo procedimiento se aplicó con la utilización de regresión logística de los SNPs con FEVI reducida.

Los análisis se efectuaron con el software R ® (versión 4.1.1, R Development Core Team/R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria).

Se generó además, un Manhattan plot con los diferentes modelos de herencia para todos los SNPs analizando el nivel nominal de significancia y el nivel de Bonferroni.

Consideraciones éticas: El estudio fue desarrollado según los principios de la Declaración de Helsinki y aprobado por el Comité de Docencia e Investigación de la institución.

Se estudiaron 182 pacientes con serología positiva para Chagas oriundos del sur de Bolivia y Noroeste de Argentina.

La mediana de edad de la población fue de 62 años. El 39,6 % fueron hombres. Cincuenta y siete de ellos (31 %), presentaron FEVIr y 95 (53 %) presentaron algún TCIV (Tabla 1).

Tabla 1
Características basales

DM: diabetes mellitus; FEVI: fracción de eyección ventricular izquierda; HTA: hipertensión arterial; IC: insuficiencia cardíaca Las variables cuantitativas se presentan como media y desviación estándar, las cualitativas como frecuencia y porcentaje. Las variables cualitativas se presentan como frecuencia y porcentaje, las cuantitativas como media y desviación estándar

Entre los diferentes modelos de clasificación supervisada evaluados, el modelo que utiliza 7 K folds y un clasificador de Regresión Logística obtuvo una puntuación de F1 = 0,85, y fue el mejor modelo obtenido, por lo que se reportan los resultados obtenidos con el mismo.

El análisis univariado de la relación entre cada SNP (en el eje horizontal) y la presencia de una FEVI reducida y TCIV respectivamente efectuado mediante regresión logística se presenta en las Figuras 1 A y 1 B

Figuras 1
A y B: El eje vertical expresa los valores de p para cada SNP, la línea roja marca el nivel de significación p = 0,05 y los puntos en rojo, corresponden a los SNP que presentaron un valor p < 0,05.

SNP: polimorfismo de nucleótido único; TCIV: trastorno de conducción intraventricular

Se realizó un análisis multivariado en el cual se evidencio la asociación con el fenotipo de FEVI reducida y TCIV. (Figuras 2 A y B, Tablas 2 y 3).

Se observó que las variantes rs2076300, rs61772962 y rs7071853 fueron predictores independientes de reducción de la FEVI. Mientras que, para la presencia de bloqueos, el único predictor fue el SNP rs72840788, como se indicó en el análisis univariado.

Figuras 2
A y B. Odds Ratio e IC 95% intervalos de confianza del 95 % para los SNP predictores de A) FEVI reducida y B) fenotipo TCIV.

FEVI: fracción de eyección ventricular izquierda; IC 95%: intervalo de confianza del 95%; SNP: polimorfismo de nucleótido único; TCIV: trastorno de conducción intraventricular

Tabla 2:
Análisis multivariado. Odds Ratio e IC 95% y valor p para cada uno de los tres SNP asociados independientemente a una FEVI reducida.

FEVI: fracción de eyección ventricular izquierda IC 95%: intervalo de confianza del 95% SNP: polimorfismo de nucleótido único

Tabla 3:
Odds Ratio e IC 95% y valor p para el único SNP asociado a la presencia de trastornos de conducción intraventricular

IC 95%: intervalo de confianza del 95% SNP: polimorfismo de nucleótido único

En cada uno de los tres SNPs que resultaron predictores de MCD, se analizó la proporción de variantes homocigota salvaje, heterocigota y homocigota del alelo alternativo de cada uno, según la presencia de una FEVI reducida o no y de TCIV. (Figuras 3 A, B y C, Figura 4)

Se evidencia el desempeño predictivo del modelo para la presencia de FEVI reducida mediante el área bajo la curva ROC (0,662) y su IC 95 % (0,580 - 0,745) (Figura 5)

Figura 3
proporción de las variantes homocigota salvaje (0), heterocigota (1) y homocigota del alelo alternativo (2) del SNP rs2076300(3 A), del rs61772962 (3 B) y del rs7071853 (3 C), según la presencia de una FEVI reducida o preservada FEVI: fracción de eyección ventricular izquierda; SNP: polimorfismo de nucleótido único; 0: homocigotos del alelo tipo salvaje 1: heterocigotos 2: homocigotos del alelo alternativo

Figura 4
proporción de las variantes homocigota salvaje, heterocigota y homocigota del alelo alternativo del SNP rs72840788, según la presencia de TCIV.

SNP: polimorfismo de nucleótido único 0: homocigotos del alelo tipo salvaje 1: heterocigotos

Figura 5
Desempeño predictivo del modelo para la presencia de FEVI reducida mediante el área bajo la curva ROC (0,662) y su IC 95 % (0,580-0,745).

ABC: área bajo la curva; FEVI: fracción de eyección ventricular izquierda; IC 95%: intervalo de confianza del 95%;

Respecto del desempeño de la red neuronal para la predicción de FEVI reducida con los tres SNP identificados, el mejor modelo fue el de una red neuronal con 2 capas ocultas de 6 y 3 neuronas respectivamente, con una tasa de error (proporción de fallas de predicción) de 0,33 y una tasa de exactitud (proporción de aciertos de predicción) de 0,67. (Figura 6)

Figura 6:
red neuronal para evaluar el poder predictivo de FEVI reducida de los tres SNP identificados

FEVI: fracción de eyección ventricular izquierda SNP: polimorfismo de nucleótido único

En este modelo de derivación, en un conjunto de pacientes con serología positiva para Chagas, se identificaron 3 SNPs predictores de reducción de la FEVI (rs2076300, rs61772962 y rs7071853) y uno predictor de trastornos de conducción (SNP rs72840788).

Al intentar confirmar estos resultados con otros métodos estadísticos usando el “umbral de Bonferroni” los resultados no pudieron ser reproducibles, debido al tamaño de la muestra utilizada. Esto refuerza que se debe continuar en esta línea de análisis, incrementando el número de pacientes. Es fundamental continuar explorando la hipótesis de que, incluso en ausencia de antecedentes familiares de MCD y de variantes patogénicas en estudios genéticos, pueden existir polimorfismos que predispongan al desarrollo de dilatación ventricular frente a factores desencadenantes.

Este enfoque resultaría muy útil en el futuro, no solo para identificar con premura los pacientes predispuestos a presentar MCD e IC, sino también para anticiparse en el tratamiento, pudiendo así mejorar tanto la morbilidad como la mortalidad de nuestros pacientes. Creemos que esto podría abrir nuevas perspectivas en farmacogenómica aplicada a la IC.

Este estudio busca ser un punto de partida que promueva futuras investigaciones y estrategias. Su intención es establecer una línea de investigación que, al incorporar un mayor número de pacientes y continuar con el análisis, permita alcanzar un mayor poder estadístico.