Qualidade microbiológica do leite humano pasteurizado de um Banco de Leite Paulista

Microbiological quality of pasteurized human milk from a Milk Bank of São Paulo

Calidad microbiológica de la leche humana pasteurizada de un banco de leche paulista

Claudete de Oliveira

niversidade Federal de São Carlos, Brazil

Luís Carlos Lopes-Júnior

Universidade Federal do Espírito Santo, Brazil

Cristina Paiva de Sousa

niversidade Federal de São Carlos, Brazil

A literatura científica é bastante consistente ao ratificar o Leite Humano (LH) como sendo a principal fonte alimentar em recém-nascidos e lactentes.^(1-4) Dentre os benefícios desta prática destaca-se o aumento da sobrevivência, por meio da promoção da saúde e do desenvolvimento infantil, além dos benefícios biológicos e psicossociais para o desenvolvimento do bebê.^(1,5-7) No LH, além de anticorpos, encontram-se outros fatores com atividade antimicrobiana e imunomoduladora, como enzimas, citocinas, componentes do sistema complemento, oligossacarídeos, nucleotídeos, lipídeos e hormônios, que contribuem para a imunidade e maturação do sistema imunológico do neonato.^(8-11)

Estudiosos da área de aleitamento materno e LH apontam que em situações de vulnerabilidades incluindo a prematuridade, internações recorrentes dos recém-nascidos em unidades neonatais, bem como doenças da mãe, ou baixa produção láctea, podem gerar dificuldades no estabelecimento e na manutenção do aleitamento materno.^(7,12,13) Nessas situações, o uso do LH doado se transpõe como uma eficiente opção para nutrição dos recém-nascidos em condições especiais^(2,5) e uma forma de manutenção da produção de leite pelas nutrizes doadoras.^(5,14)Recente revisão sistemática que objetivou identificar as atividades dos Bancos de Leite Humano (BLH) evidenciou que as respectivas ações neles desenvolvidas repercutem positivamente na promoção da saúde materno infantil, representando uma estratégia importante de promoção ao aleitamento e de apoio a amamentação dos bebês que não podem mamar diretamente no peito.⁽¹⁵⁾Os autores também apontaram que pesquisas sobre os BLH como promotores da saúde materno infantil são escassas e mais estudos são necessários para subsidiar estratégias de saúde pública em prol da amamentação.⁽¹⁵⁾

Para tanto, a existência e a operacionalização dos BLH enquanto serviço especializado é crucial para desencadear ações de promoção, proteção e apoio ao aleitamento materno bem como pela execução de atividades de coleta do LH, processamento, controle de qualidade e distribuição.^(16,17)Nesse sentido, o processo da qualidade do leite humano ordenhado (LHO) abrange desde a ordenha até sua administração e é resultante das condições higiênico sanitárias adequadas. Tal processo é definido por intermédio da avaliação conjunta de múltiplos parâmetros incluindo as características nutricionais, imunológicas, químicas e microbiológicas, a fim de proporcionar a verificação da segurança do produto final.^(16,18)

As etapas que envolvem os procedimentos para a coleta de LHO evidenciam riscos de contaminação e, portanto, necessitam ser criteriosamente monitoradas.^(16,19-23) É de responsabilidade do BLH o fornecimento de LHO invulnerável, inócuo, e que cumpra a sua função como alimento, já que a pasteurização inativa 95% dos agentes patogênicos.^(16,20-23)Em adição, sua qualidade é circunscrita pelo controle de inspeção em teste físico-químico e microbiológico até a liberação do produto final, sendo que as condições higiênicas sanitárias é o parâmetro aceito para viabilizar sua qualidade microbiológica.^(20-20)

As causas de elevação de microrganismos no LH podem estar relacionadas às técnicas inadequadas de coleta, as condições de higiene da doadora e dos utensílios e a manutenção do leite fora da cadeia de frio. O crescimento de bactérias no LH produz acidificação e fermentação o que pode levar a diminuição dos componentes nutricionais e imunológicos devido à utilização de nutrientes do leite pela microbiota contaminante e diminuição dos fatores imunoprotetores.^(24-27)

Uma vez que o LH é um excelente meio de cultura e não dispõe de obstáculo para a flora microbiana que está associada com a disponibilidade e a qualidade do alimento, é de suma importância para a saúde materno infantil que as boas práticas no processo de manipulação sejam asseguradas para garantir a sua qualidade.^{(17,22,24,27)}Dado a relevância do tema, somado a indefensabilidade materno infantil no consumo do LH distribuído por BLH, é que esta pesquisa se faz pertinente.

Embora existam dois estudos prévios, contudo, ambos abordaram a gestão do processo de trabalho das atividades assistenciais e de processamento de leite humano do BLH sob investigação nessa pesquisa com foco na melhoria da qualidade.^(28,29) No entanto, ainda permanecem desconhecidas a avaliação e a qualidade microbiológica do leite humano pasteurizado do referido BLH. Somado a isso, uma das diferenças deste estudo é que avaliamos o crescimento microbiano em diferentes tipos de temperatura, permitindo a associação da temperatura com o ambiente, armazenamento, com a degradação do leite, dentre outros parâmetros. Nesse contexto, o presente estudo objetivou avaliar a qualidade microbiológica do leite humano pasteurizado proveniente de um Banco de Leite Humano do Estado de São Paulo.

Trata-se de estudo descritivo, feito por meio da análise e processamento das amostras de LHO obtidas em 2015/2016 no BLH vinculado à Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Carlos, São Paulo, Brasil. Este estudo obteve aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de São Carlos - UFSCar, sob parecer nº: 1.8088.916 de 12 de maio de 2015, estando em consonância com as normas regulamentadoras contidas na Resolução 466/12 do Conselho Nacional de Saúde no que diz respeito a condução de Pesquisas com Seres Humanos.⁽³⁰⁾ Além disso, obteve-se a aprovação junto a Comissão Interna de Ética da Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Carlos - instância na qual o BLH é vinculado.

O processo de amostragem foi do tipo não probabilístico e por conveniência, abrangendo todas as amostras consecutivas de LH. Vinte e nove (29) amostras foram obtidas por coleta domiciliar e 01 amostra foi obtida por coleta no BLH, por doadoras cadastradas no BLH vinculado à Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Carlos no período pré-estabelecido da coleta de dados do presente estudo que ocorreu entre julho de 2015 a março de 2016. Foram coletados 30 frascos, contendo 250 ml de LHO em cada um, qualificado como impróprio para o consumo, sendo 01 amostra de LHO cru que foi descartado na fase de sujidade e 29 frascos de LHO pasteurizado, os quais foram descartados na fase de avaliação da acidez titulável expressa em graus Dornic (ºD) e da qualidade microbiológica, conforme estabelecido na RDC nº 171.⁽²⁰⁾ Ressalta-se que amostra de LHO cru foi descartada devido à ausência de amostras similares para comparações. Além disso, não obtivemos e nem utilizamos amostras de LHO nas fases anteriores, de análise da embalagem, de sujidades, cor e off-flavor. Dessa forma, a amostra final do presente estudo foi constituída por 29 frascos de LHO pasteurizado. As amostras foram transportadas a cadeia de frio do local de coleta no BLH até o Laboratório de Microbiologia e Biomoléculas/UFSCar em recipientes isotérmicos, respeitando as normas estabelecidas pela RDC nº 171,⁽²⁰⁾acondicionadas no freezer sob a temperatura de -3ºC para posterior processamento das análises microbiológicas em até 24h. A análise microbiológica foi norteada pelo método preconizado pela American Public Health Association (APHA).⁽³¹⁾

A análise dos parâmetros físico-químicos do potencial hidrogeniônico (pH) do LH ocorreu logo após o degelo em banho-maria a 40°C, sendo controlada para que a temperatura da água permanecesse em até 5°C. Posteriormente, o frasco foi imerso, ficando acima da altura do nível do LH e realizando leves agitações. Após 5 minutos, o LH foi acondicionado em um Becker (50ml), procedendo a mensuração do pH com a imersão do eletrodo no LH por 1 minuto para efetuar a leitura. Este procedimento foi repetido três vezes para cada amostra e obtivemos a média aritmética para o valor de pH registrado para posterior análises estatísticas. Salienta-se que os parâmetros físico-químicos do teor energético (K) bem como os resultados da avaliação da acidez titulável⁽³²⁾foram realizados no BLH supracitado.

A detecção de microrganismos heterotróficos iniciou-se com a realização da diluição seriada da amostra de LH em solução salina peptonada. Cada amostra foi pipetada em campo de chama em diluições seriadas, sendo a diluição inicial 10⁰ constituída de 10ml de LH, seguida das diluições 10^-1 e 10^-2. A identificação de microrganismos heterotróficos foi realizada de acordo com o método descrito anteriormente pela APHA.⁽³¹⁾Alíquotas de 1ml da amostra de LH e de suas diluições decimais seriadas foram semeadas em duplicatas, pela técnica de inoculação em placas de petri (90 x 15mm) estéreis contendo de 10 a 15ml utilizando o meio de cultura Plate Count (PCA – Himedia®). A inoculação em superfície com auxílio de uma alça de Drigalski, possibilitou que as placas fossem incubadas invertidas a 37°C por 24h para o grupo de mesófilos; a 42,5°C por 24h para o grupo de termófilos e a 7°C por 7 dias para o grupo de psicrófilos. Foram contadas as colônias e os resultados foram expressos em unidades formadoras de colônia (UFC) por ml de LH.

Para a análise de Staphylococcus spp. procedeu-se conforme o método proposto pela APHA⁽³¹⁾com a utilização do meio de cultura Agar Sal Manitol (Kasvi®), no qual as placas foram incubadas e invertidas a 37°C por 24h para verificar a presença de colônias Staphylococcus spp. Os resultados foram expressos em unidades formadoras de colônia (UFC) por ml de LH.

Para a quantificação de fungos filamentosos e leveduriformes procedeu-se novamente com o método descrito pela APHA.⁽³¹⁾Assim, utilizamos o meio de cultura Agar Sabouraud Dextrose (Kasvi®), no qual as placas foram incubadas e invertidas a 37°C por 24h, para a detecção da presença de colônias desses fungos. Os resultados também foram expressos em unidades formadoras de colônia (UFC) por ml de LH.

A presença de coliformes totais e coliformes termotolerantes foram determinados pela técnica do Número Mais Provável (NMP), de acordo com o método descrito em estudo prévio.⁽³³⁾ O teste no NMP de coliformes totais e termotolerantes foram assentados em dois testes, quais sejam, a presuntiva e a confirmativa para série de 3 tubos. O teste presuntivo foi realizado por meio de uma alíquota de 1ml de LH em um tubo contendo 9ml de Caldo Lauril Sulfato de Sódio (CLSS) (Kasvi ®) em diluições seriadas de 10¹, 10^-2e 10^-3sucedendo a incubação a 37°C por 24h. O teste confirmativo foi iniciado após a verificação da inoculação dos tubos positivos por meio da formação de gás e/ou turvação do meio. Essa fase consistiu na transferência de 1 ml da diluição seriada e em triplicada para tubos contendo 9ml de Caldo Verde Brilhante Bile Lactose (VB) 2% (BGBL – (Kasvi®), e para tubos contendo 9ml de Caldo EC (Kasvi®), seguidos pela incubação a 37°C e 42,5ºC por 24h à 48h. Os tubos com gás e/ou turvação, nos dois testes foram registrados a fim de quantificar o NMP/ml de LH.

Para análise dos dados, inicialmente foram digitalizados em planilhas do Microsoft Excel™ e após codificação, foram exportados para o programa Statistical Package for Social Sciences (SPSS Inc., Chicago, Estados Unidos), versão 20.0, para proceder-se com as análises estatísticas descritivas e bivariadas. As variáveis qualitativas ordinais e nominais foram apresentadas com base nos números absolutos e percentuais, por meio da distribuição de frequência relativa (%) e as variáveis quantitativas discretas e contínuas, pela média, desvio-padrão (DP), mediana, valor mínimo (min) e valor máximo (máx). Em seguida, procedeu-se com as análises estatísticas bivariadas para investigar a correlação entre as variáveis da microbiota estudada e a acidez °Dornic por meio do coeficiente de correlação de Pearson. Para todas as análises, fixou-se α=5%, β=0,20 e Intervalo de Confiança de 95%, sendo o nível de significância estabelecido para p<0,05.

Evidenciou-se neste estudo que as amostras de leite humano ordenhado pasteurizado (LHOP) eram compostas por uma oscilação de 3 a 15º de acidez Dornic, sendo que 20,7% delas apresentaram a acidez entre 3 e 5º D; 55,2% revelaram uma acidez de 8º D e 24,1% acidez entre 9 e 15º D. Em condições normais a acidez Dornic no LHOP tem uma variação de 2º a 7ºD, sendo que as amostras que apresentam acidez ≥ 8°D são consideradas impróprias para o consumo. Ademais, sabe-se que o descarte dessas amostras ocorre entre a fase pasteurização e a análise microbiológica, ou seja, a pasteurização tem como finalidade inativar os agentes microbianos e acidez Dornic é um parâmetro físico e indicador da qualidade higiênico sanitário do LHO.^{(12,16,20,32)}Para este estudo o aumento da acidez Dornic está em linha com os achados de estudos prévios^(32,34)pois, a elevação da temperatura após o degelo para o processo de pasteurização interage como modificador da acidez titulável, característica observada em 13,79% de nossas amostras, as quais identificaram a acidez 8ºD e ausência microbiana após a análise microbiológica. Nossos achados também corroboram com outro estudo que durante o armazenamento de LHO ocorreu oxidação lipídica, elevando a acidez,⁽²⁵⁾ e 86,20% das amostras apresentaram inviabilidade devido a presença de microrganismos. Outro estudo também demonstrou que a elevação da acidez Dornic é ocasionada pelo ácido lático degradado da lactose por meio da ação microbiana.⁽¹⁹⁾

Em nosso estudo obtivemos um valor energético (K) médio das amostras analisadas de 587 Kcal/l, DP=77,4 Kcal/l. A variabilidade do teor energético é um conjunto de resultado das características individuais das doadoras, do período da lactação, de perdas durante o processo de estocagem e da própria amostra de leite (leite de início e/ou final da mamada).⁽¹⁹⁾ A média do pH obtida nas amostras de LHOP analisadas foi de 6,8 e este valor corrobora aos achados de outro estudo que obteve uma variação para LHOP de 6,86 (DP=0,24).⁽³⁴⁾ Em nossas amostras, não detectamos a diminuição de pH em relação à acidez elevada e mesmo com a presença microbiana, provavelmente, devido a desestabilização da caseína tornando o cálcio menos disponível, fenômeno que está relacionado com a conservação inadequada do LH após a coleta.⁽¹⁹⁾ Um outro estudo ressalta para além da qualidade higiênico sanitária, que a acidez titulável se relaciona com o armazenamento em refrigeração a 4ºC no qual ocorre reações lipolíticas e proteolíticas liberando ácidos graxos e aminoácidos livres, resultando na diminuição de pH e elevação da acidez.⁽²⁵⁾

Foi evidenciado em 82,76% (n=24) das nossas amostras a presença de coliformes no teste presuntivo com o valor de 3,60⁰ e 240,00⁰ NMP/ml. Já no teste confirmativo VB constatou-se a presença de 54,16% de coliformes totais; no teste EC verificamos 33,33% de coliformes termotolerantes e 12,5% apresentaram teste positivo para coliformes totais e termotolerantes. Este é um fator relevante considerando que sua presença é um indicador clássico para a detecção de coliformes e indica que houve a quebra das boas práticas de manipulação do LH, incluindo as técnicas inadequadas de coleta, higiene precária da doadora e dos utensílios, e manutenção do leite fora da cadeia de frio.^(16,35)Além disso, a carga microbiana inicial elevada compromete a eficiência da pasteurização. Contrariamente aos nossos resultados, um estudo obteve a presença de coliformes em 10% (n=2) das amostras analisadas de LHOP,⁽³⁴⁾ o que corrobora a resultados de outra pesquisa⁽³⁵⁾na qual a avaliação das condições higiênico sanitárias de LHOP, revelou a presença de 5,6% (n=8) coliformes totais e 25,9% de coliformes termotolerantes que sugeriram a contaminação fecal.⁽²⁴⁾

Identificamos em nosso estudo a presença dos microrganismos psicrófilos em 17,24% e de termófilos 27,59% nas amostras de LHOP. Um estudo mostrou a presença de psicrófilos em 36,7% de suas amostras de LHOP e de 6,7% de microrganismos termófilos,⁽³⁶⁾ sugerindo contaminação secundária, com manipulação ou estocagem de refrigeração inadequada.

Nossos achados revelaram 55,17% de mesófilos e 4x10¹a 130x10¹UFC/ml. Salienta-se que a quantidade permitida de microrganismos aeróbios mesófilos é de até 1x10²UFC/ml.⁽³⁵⁾ Esses achados são superiores aos valores encontrados por outra pesquisa⁽²⁴⁾na qual foi se identificou 48,2% de mesófilos. Diferentemente, um outro estudo⁽³⁷⁾ evidenciou a presença de 96% desse microrganismo em suas análises, corroborando aos achados de outras três pesquisas³⁸as quais constataram respectivamente uma população de 96% e 98,6% de mesófilos em suas amostras.⁽³⁹⁾ Em adição, em nosso estudo, especificamente o grupo aeróbio mesófilos, após o teste da correlação linear de Pearson, demonstrou correlação positiva com a variável da acidez Dornic (r=0.44; p=0.01).

A detecção de microrganismos mesófilos em amostras de LH superior ao valor de referência evidencia contaminação ocasionada à ausência das boas práticas de manipulação. As bactérias mesófilas funcionam como indicador da qualidade sanitária do LH.^(27,38) Adicionalmente, a presença desses microrganismos está relacionada as técnicas inadequadas de coleta, higiene precária em relação a doadoras e dos utensílios bem como da manutenção do leite fora da cadeia de frio.^{(5,27,34,38,40)}

Identificamos ainda, 41,38% de fungos filamentosos e leveduriformes em nossas amostras. Pesquisadores encontraram uma prevalência de fungos filamentosos e leveduriformes em 69,4% de suas amostras.⁽⁴¹⁾ Já em outro estudo foi reportado a presença de fungos filamentosos e leveduriformes em 56% de suas amostras.⁽³⁹⁾A incidência de fungos filamentosos e leveduriformes sugerem a transferência para as mãos das doadoras e consequentemente ao LHO, fato de extrema relevância para o controle da assepsia e da manipulação adequada durante a coleta de LHO a fim de evitar contaminação.⁽³³⁾

Ressalta-se que, em nosso estudo não foram encontradas crescimento microbiano de Staphylococcus spp semelhante a outros dois estudos com 20 e 14 amostra de LHOP respectivamente.^(34,40) Este microrganismo faz parte do grupo de bactérias mesófilas possuindo um crescimento ótimo a 37°C e na faixa entre 7 a 47,8°C, além de apresentar um crescimento microbiano em pH de 4 e 9,8. Portanto, a presença desse microrganismo no LH é um indicativo de contaminante externo, proveniente de manipuladores, utensílios e equipamentos.^(21,36,40)

Reconhecemos algumas limitações do presente estudo, dentre elas o tamanho pequeno da amostra que impossibilitou a condução de análises de subgrupos e análises multivariadas. Outra limitação é que a maioria dos estudos prévios na literatura reflete sobre o LHO cru e o nosso estudo utilizou o LHOP, o que pode ter dificultado algumas comparações. Entretanto, este estudo diferentemente dos previamente publicados, utilizou o grupo de microrganismo indicador microbiológico das condições de higiene nos alimentos por meio da variação da temperatura, não optando em classificá-lo.

A partir da avaliação da qualidade microbiológica das amostras de LHOP descartado e consideradas impróprias para consumo no referido BLH, especificamente com relação aos indicadores microbiológicos das condições de higiene, sugere que a inviabilidade das amostras possam estar associadas às boas práticas de manipulação do alimento. Dentre elas, às técnicas inadequadas de coleta, à conservação inadequada do LHO após a coleta, e contaminação secundária, com manipulação ou estocagem de refrigeração inadequada, que podem ter sido ocasionadas tanto pelas doadoras quanto pelo próprio BLH. Espera-se com os nossos achados possam contribuir para a reflexão de gestores e profissionais de saúde, destacando a necessidade da Educação Permanente junto aos BLH a fim de melhorar as boas práticas de manipulação do LH, principalmente, em consonância com a qualidade higiênico sanitária na coleta do mesmo, uma vez que ela não exerce monitoramento absoluto na coleta externa.