Punto de corte de la cotinina urinaria y cotinina/creatinina en niños

(Cutoff urinary cotinine and cotinine/creatinine in children)

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En la actualidad, datos toxicológicos, experimentales y epidemiológicos han establecido que el consumo de tabaco es la principal causa prevenible de morbilidad y mortalidad en el mundo (1) .Según el reporte de la Organización Mundial de la Salud (OMS) publicado en el año 2012, para el año 2004 en la República Bolivariana de Venezuela existía 11% de riesgo atribuible de mortalidad por tabaco en adultos (2).

A partir de marzo del 2011, nuestro país se sumó a las iniciativas internacionales de prohibir la contaminación por el humo de tabaco ambiental (HTA) en espacios públicos (3), en concordancia con el artículo 8 de la Ley aprobatoria del convenio Marco de la OMS para el control del tabaco (4). Sin embargo el alcance de esta legislación es limitada pues las personas pueden fumar en sus hogares o automóviles convirtiendo a los niños en la población más vulnerable a este contaminante, y más aun considerando que en nuestro país para el año 2011 se reportó 17 % de prevalencia de tabaquismo en adultos (5).

Este panorama ha impulsado a nivel mundial diversos estudios destinados a establecer la exposición al HTA de manera objetiva en la población infantil a través de la medición de la cotinina (6,7,8,9), metabolito de la nicotina, esta es una amina terciaria compuesta por un anillo de piridina y otro de pirrolidina. Aproximadamente entre el 80 y el 90% de la nicotina ingerida o inhalada, es metabolizada por el hígado, riñones y pulmones. La C-oxidación como primera fase del metabolismo produce cotinina, 3-hidroxicotinina y nornicotina principalmente mediante la enzima codificada por el gen CYP2A6 (10). La nicotina y la cotinina son excretadas vía renal debido a la segunda fase de N- y O-glucuronidación, mediante enzimas como la UDP-glucuronosiltransferasa (UGT), las cuales producen compuestos solubles en agua, un proceso dependiente del pH urinario. La vida media de la cotinina (16-18 horas), es mayor que el de la nicotina (2-3 horas). Las concentraciones urinarias de cotinina son aproximadamente 5 a 10 veces más altas que los niveles en plasma (11). Debido a esto organizaciones como la Fundación para la investigación y prevención del cáncer (FUCA) en Argentina implementó en un estudio la determinación de este metabolito para cuantificar la exposición al HTA en escolares con el fin de delinear estrategias de prevención (12), asimismo asociaciones médicas han sugerido la inclusión de la cotinina en protocolos de evaluación de los pacientes asmáticos (13, 15), considerando que el HTA es un determinante importante en la incidencia y exacerbación del asma (16,17,18), sin embargo en nuestro país se desconoce la existencia de iniciativas similares.

En las últimas décadas, se han estudiado niveles de decisión o discriminación para valorar la exposición al HTA de biomarcadores no específicos (monóxido de carbono, carboxihemoglobina y tiocianato) (19, 21) y específicos como la cotinina, en distintas matrices biológicas de la población adulta (21, 22) incluyendo embarazadas (23), sin embargo el punto de corte para la cotinina urinaria en niños mediante la técnica HPLC-UV no está bien definido, y en la literatura no existe un consenso al respecto, lo cual repercute en la efectiva evaluación de la exposición a dicho contaminante intradomiciliario, especialmente en la población infantil.

Lo anteriormente expuesto justifica la determinación del punto de corte para la cotinina y cotinina/creatinina para la técnica implementada en la Unidad de Investigación en Toxicología Molecular de la Escuela de Bioanálisis (Universidad de Carabobo), con el propósito de abordar la realidad de la exposición al HTA en niños de la comunidad Santa Eduvigis del municipio Naguanagua (edo. Carabobo) y estimar la magnitud del problema, con el fin de contribuir a mediano y largo plazo en la planificación y evaluación de las acciones para disminuir el riesgo de contraer enfermedades relacionadas con dicho contaminante.

Un grupo de 80 niños fue clasificado como “expuestos o no al HTA” según el reporte de sus padres, en la distribución de la muestra (tabla 1) se observa predominio del género masculino y del grupo etario con edad ≤ 7 años, los valores de cotinina y el índice C /C resultaron mayores en este grupo etario y en el género femenino.

Tabla 1
Valores de cotinina, índice cotinina/creatinina ( C /C) y distribución porcentual de la muestra en estudio según género, grupo etario y exposición al humo de tabaco ambiental (HTA) reportada por los padres

Los valores de cotinina y de C/C se corresponden con las medianas de la distribución.

La curva COR (figura 1) presenta un área bajo la curva (ABC) igual a 0,729 con una significación asintótica < 0,001 e intervalos de 0,614 – 0,843 (95% de confianza) para la cotinina y 0,729 con una significación asintótica < 0,001 e intervalos de 0,616 – 0,843 (95% de confianza) para la cotinina/creatinina. En la tabla 2 se presentan los puntos de corte para cotinina y cotinina/creatinina con sus respectivos índices de Youden (IY).

Figura 1
Curva COR de la determinación de Cotinina e índice C/C urinaria por HPLC-UV

Tabla 2
Valores de punto de corte, sensibilidad, 1-especificidad e índice de Youden de la cotinina y cotinina/creatinina ( C /C)

Valores cut-off para los biomarcadores en negritas.

En atención a lo anterior y obedeciendo el criterio de la definición de sensibilidad, como característica de una prueba que permite identificar a todos los posibles expuestos, extrapolando el concepto de Salech y col. como la razón entre los individuos que tienen un resultado del test positivo y aquellos que tienen la condición o enfermedad de interés (27), en otras palabras, tasa o proporción de verdaderos positivos (28), se otorgó prioridad a la sensibilidad, para aquellos puntos derivados de dicha curva con mayor IY, seleccionando como punto de corte para la cotinina ≥ 21,26 µg/L (sensibilidad: 93%, especificidad: 47,2%) y ≥ 10,29 µg/g para C /C (sensibilidad: 95,3% - especificidad: 41,7%), Ahora bien, el empleo de la encuesta como criterio de referencia influye de manera determinante en la especificidad del biomarcador evaluado, dado que es una medida subjetiva de la condición y que puede disminuir la validez del test al parecer que existe un alto porcentaje de falsos positivos, aun así, se empleó como Gold Standard dado que la OMS recomienda las encuestas como técnica para el monitoreo del consumo y exposición al HTA en programas de prevención y control del tabaco (29, 30).

En la tabla 3 se presenta la relación de dependencia entre el resultado del biomarcador y la exposición real (Encuesta) de los individuos con un nivel de confianza de 95%, asimismo se evidencia los valores predictivos para cotinina y C/C con sus intervalos de confianza para el punto de corte seleccionado.

Tabla 3
Tablas de contingencia y valores predictivos de los biomarcadores asumiendo 21,26 µg/L como punto de corte para cotinina y 10,29 µg/g para el índice Cotinina/Creatinina ( C /C) tomando como referencia los resultados de la encuesta

VPP Valor predictivo positivoVPN Valor predictivo negativoIC Intervalos de confianza al 95% Valores de p según la prueba de Ji cuadrado: Cotinina p<0,001 y Cotinina/creatinina p><0,0002. >< 0,001 y Cotinina/creatinina p<0,0002. >0,0002

Durante las últimas décadas la sociedad ha adoptado un estilo de vida en el cual prevalece el hábito de fumar, convirtiéndose en la principal causa de aparición de múltiples enfermedades como cáncer, enfisema y enfermedad cardiovascular (30,31,32), asimismo los niños han pasado a ser un importante grupo de riesgo, cuando conviven con fumadores, sin ejercer la acción directa de fumar pero igualmente poniendo en peligro su salud al exponerse al humo del tabaco, hecho que se ha ido agravando a pesar de las regulaciones existentes.

La OMS para prevenir y reducir la epidemia tabáquica ha desarrollado la estrategia MPOWER, estas siglas describen las acciones basadas en la monitorización del consumo de tabaco (Monitor), en la protección de la población del humo ambiental del tabaco (Protect), en la oferta de ayuda a los fumadores para dejarlo (Offer), en la advertencia de los peligros del tabaco (Warn), en el cumplimiento de las prohibiciones sobre publicidad, promoción y patrocinio (Enforce) así como en el aumento de los impuestos al tabaco (Raise)(30). Hasta ahora este monitoreo se ha realizado en gran medida a través de métodos indirectos como encuestas, consideramos que esta vigilancia debe complementarse con el control biológico de la exposición ambiental en las poblaciones, pudiendo constituir de este modo una potente herramienta de trabajo para la salud pública (33), en la medida en que se implementen técnicas analíticas que permitan determinar biomarcadores de exposición.

De allí que en la presente investigación se evaluó la validez diagnóstica de la cotinina y el índice Cotinina/Creatinina por HPLC-UV para monitorear la exposición al HTA en niños. La sensibilidad y especificidad obtenidas en la metodología evaluada derivan del punto de corte seleccionado, aun cuando este no corresponde al mayor IY, se consideró la necesidad diagnóstica de la exposición, dado que en las pruebas de cribado, detección o screening, se utilizan en general, pruebas de alta sensibilidad, mientras que en las confirmatorias se utilizan técnicas de alta especificidad (34), aunado a esto, la calidad de la prueba no debe interpretarse aisladamente, sino que se deben valorar también las acciones que se van a poner en práctica cuando el resultado indique la presencia de la condición, en este caso la exposición. Si el evento puede ser tratado y detectado evitando complicaciones posteriores han de utilizarse pruebas que minimicen el número de falsos negativos, es decir, se elegirán pruebas con alta sensibilidad (28, 34).

Cabe resaltar que la baja especificidad obtenida en la prueba evaluada viene dada por el hecho de emplear la encuesta como Gold Estándar, siendo esto una debilidad del presente estudio. Además es de esperar que la especificidad sea un poco inferior dada la relación de interdependencia que se observa en pruebas con escalas (26), por otra parte, es importante destacar que la separación cromatográfica con detección UV garantiza que lo detectado es el metabolito. Lo ideal sería contrastar los métodos acá empleados con una técnica cromatográfica acoplada a la espectrometría de masas para establecer la especificidad real de dichas técnicas, sin embargo esto supone un costo muy elevado.

Ahora bien, se observó una alta frecuencia de exposición al HTA según lo reportado por los padres en las encuestas, lo que coincide con investigaciones que reportan un rango de 48 – 69% de exposición infantil en el hogar (6,7,8,9, 35). Sin embargo, el uso del biomarcador basado en un punto de corte ≥ 21,27 µg.L-1 para la cotinina y ≥ 10,29 µg.g-1 para el índice C/C permitió evidenciar una frecuencia mayor en la exposición a la reportada por los padres. De allí que es necesario establecer puntos de corte que discriminen la exposición disminuyendo el solapamiento entre los grupos, especialmente en poblaciones vulnerables como los niños.

En relación a esto, son pocos los estudios en niños que establecen un punto de corte, hecho que se reviste de importancia debido a características particulares como su mayor frecuencia respiratoria y por lo tanto la inhalación de una mayor dosis efectiva del xenobiótico por kilogramo de peso, representando esto una diferencia a la hora de evaluar el nivel de exposición al HTA en dicha población (36). La literatura existente reporta un amplio rango de puntos de corte para la cotinina urinaria para distinguir a los fumadores de los no fumadores adultos, los valores van desde 31,5 hasta 550 ng/ml dependiendo de la técnica y el método empleado (37,38,39,40,41) haciendo consideraciones especiales en embarazadas (23, 38, 42). El punto de corte obtenido en este estudio es ligeramente superior al descrito por Benowitz y col. quienes estimaron un valor urinario de 15 ng/ml basado en la extrapolación de los niveles séricos óptimos para distinguir los fumadores y no fumadores dentro de los diferentes grupos étnicos raciales en los Estados Unidos (43). Zielinska-Danch y col. (38) reportan un valor promedio de cotinina de 22 ± 13 µg.L-1 en no fumadores empleando HPLC-UV, el cual es comparable al cut-off de 21,27 µg.L-1 seleccionado en el presente estudio.

Igualmente, el índice Cotinina/Creatinina (C /C) ha sido utilizado para determinar la prevalencia del tabaquismo pasivo, al respecto Keskinoglu y col., reportan un punto de corte de 30 ng.mg-1 creatinina para establecer la exposición en niños con infecciones del tracto respiratorio y sanos (44), dicho nivel es superior al seleccionado en esta investigación, lo que puede explicarse por los distintos patrones de exposición al HTA entre las poblaciones estudiadas, por cuanto Venezuela presenta menor prevalencia de tabaquismo que Turquía. En este orden de ideas, diversos estudios han referido la influencia de la variación interindividual en el metabolismo de la nicotina y en consecuencia en la tasa de eliminación de cotinina, bien sea por factores genéticos, raza o relacionados con la actividad de la CYP2A6 (45, 46). También se ha señalado variación intraindividual asociado con los días de la semana en que se realiza el muestreo, factores que no se evaluaron en la presente investigación (47).

Balhara y col. (48) en su estudio presentan una sensibilidad de 90% utilizando una técnica de inmunoensayo para discriminar adultos fumadores de no fumadores utilizando como punto de corte un valor de 12,54 ug.L-1 sin embargo presentan una especificidad menor al 30% con un ABC inferior a 0,5. En este sentido, el ABC obtenida en nuestra curva COR, cumple con los criterios de discriminación aceptable según lo establecido a nivel estadístico (49). Al contrastarla con las reportadas por Balhara y col., Simoni y col., se observa que es superior, lo que podría ser explicado por la menor especificidad de la metodología analítica utilizada por estos investigadores (48,50). El ABC obtenida en estudios en los que se aplicó la separación cromatográfica es superior a 0,7 (7), valor que estadísticamente puede ofrecer la discriminación ideal que permita tomar acciones correctivas pertinentes para evitar la exposición (51, 52). En cuanto al valor predictivo positivo de la cotinina y su índice, en ambos casos fue superior al 65%, mientras que el valor predictivo negativo fue mayor a 80%, esto evidencia que la corrección con creatinina del biomarcador no mejora en gran medida la eficiencia diagnóstica de la prueba. Es necesario considerar que estos elementos dependen de la prevalencia de la enfermedad en una población, tal como lo señala Donis (26), no así la razón de verosimilitud (Likelihood Ratio), que en este caso resultó ser ligeramente superior en la determinación de cotinina.

Ante las debilidades que supone el diseño del estudio transversal y el uso de la encuesta como criterio referncial, la fortaleza de este estudio es el aporte de un umbral para el diagnóstico objetivo de la exposición al humo de tabaco ambiental en niños de nuestra región, dado que los patrones de exposición en cada población tienen diferencias y lo ideal es contar con puntos de corte propios. Para finalizar, consideramos que en el ámbito toxicológico a diferencia de otras áreas que emplean pruebas diagnósticas para discriminar pacientes sanos versus enfermos, la selección del punto de corte de un metabolito que refleje la dosis interna del xenobiótico al que se está expuesto, además de sustentarse en válidos criterios estadísticos, debe revisarse constantemente y complementarse con la medición de marcadores de efecto y susceptibilidad que valoren integralmente el impacto de la exposición a fin de identificar eficazmente el umbral que suponga el menor riesgo posible para la salud.

La mayoría de los programas de control del tabaquismo a nivel mundial emplean encuestas como indicadores para el establecimiento del consumo o exposición al humo de tabaco, lo cual representa una medida subjetiva del fenómeno. La OMS considera que no hay niveles seguros de exposición al humo del tabaco por lo que es necesario e imprescindible disponer de técnicas analíticas que permitan cuantificarla y establecer puntos de corte que identifiquen la exposición. La selección de este punto de corte debe considerar el perfil de exposición del grupo en estudio.