Introducción

La esquistosomiasis es una enfermedad parasitaria crónica causada por tremátodos del género Schistosoma. La Organización Mundial de la Salud considera a la esquistosomiasis como la tercera enfermedad en importancia socio económica en todo el mundo y la segunda enfermedad parasitaria de mayor importancia en salud pública (1). Los humanos se infectan al tener contacto con agua dulce que alberga formas larvarias del parásito que nadan libremente, luego de salir de su hospedador natural en el continente Americano, los caracoles de la especie Biomphalaria glabrata (Planorbidae) (2). La importancia médica de esta especie radica precisamente en que son hospedadores intermediarios de Schistosoma mansoni.

Uno de los métodos de control de la enfermedad es a través de molusquicidas (3). Los molusquicidas sintéticos tienen tres grandes dificultades, el alto costo de producción, la posibilidad de que el caracol desarrolle resistencia y la toxicidad que presentan sobre los diferentes organismos biológicos presentes en el ambiente. Estos factores han dado un impulso importante al estudio de los molusquicida de origen natural, procedente de extractos vegetales más amigables con el medio ambiente (4,5).

Estudios previos han arrojado resultados alentadores en relación a la acción letal que presentan los extractos, látex y compuestos puros aislados de algunas especies del género Euphorbia, contra B. glabrata (6-10). Por otro lado, las especies E. pulcherrima y E. hirta han sido reportadas como potente molusquicida contra caracoles de Lymnaea acuminata (11). E. splendens y E. aphylla mostraron excelente efecto molusquicida contra B. alexandrina (12,13) y se ha reportado una efectiva actividad molusquicida de E. helioscopia y E. schimperiana con DL50 con valores entre 34–66 ppm contra de B. pfeifferi (14). También se ha reportado potente actividad de E. cornigera contra caracoles de B. glabrata con DL50 de 17,5 ppm (9).

La especie Euphorbia laurifolia es un arbusto presente en la zona andina de Venezuela, Colombia y Ecuador entre los 1000 y 3000 msnm (15). En Venezuela su distribución se concreta en el páramo merideño sobre los 2500 msnm. Sobre la especie E. laurifolia existen pocos estudios previos. Del látex de esta especie, se aisló el triterpeno lanosterol y el compuesto latazienona, un nuevo diterpeno macrocíclico tipo latirano (16). En otro estudio se demostró la actividad antiviral de algunos diterpenos aislados del látex de esta especie (17).

En el presente trabajo se plantea evaluar el potencial molusquicida de los extractos de las partes aéreas de la planta contra caracoles de B. glabrata, utilizando el protocolo sugerido por la Organización Mundial de la Salud (18), con la idea de aportar nuevos compuestos como posible alternativa en el control de caracoles de importancia en salud pública.

Materiales y métodos

Material botánico. Las partes aéreas de E. laurifolia (Euphorbiaceae) se recolectaron en Noviembre del 2013, en el páramo de Gavidia, Municipio Rangel, Estado Mérida-Venezuela a 3200 msnm (N 08º 41,219' W 70º 55,747'). La muestra fue identificada por el Ing. For. Juan Carmona y se depositó bajo el número de voucher MER-01 en el Herbario “Prof. Luis Ruiz Terán” de la Facultad de Farmacia y Bioanálisis de la Universidad de Los Andes, Mérida-Venezuela.

Caracoles de la especie Biomphalaria glabrata. Se utilizaron caracoles de Biomphalaria glabrata Say, cepa Puerto Rico, cedida gentilmente por el Dr. Gilberto Payares de la Universidad Central de Venezuela, criados en acuarios con agua declorada, aireación y lechuga como fuente de alimento y mantenidos a temperatura ambiente en el Laboratorio de Parasitología Experimental (LAPEX) de la Universidad de Los Andes, Mérida-Venezuela. Para los ensayos se seleccionaron ejemplares de caracoles sanos de tamaño uniforme entre 6-8 mm de diámetro.

Preparación de los Extractos. Se tomó una muestra 100 g de material vegetal seco, finamente molida y se sometió a un procedimiento de extracción en metanol bajo agitación constante a temperatura ambiente hasta agotamiento. Se obtuvieron 20,2 g del extracto metanólico crudo. Una muestra de 1,0 g de este extracto se conservó hasta el momento de su uso, protegido de la luz y a 4 ºC. El extracto restante (19,2 g) se disolvió en agua y se sometió a extracciones líquido-líquido empleando como solventes n-hexano, acetato de etilo y metanol. Se obtuvieron 2,9 g de extracto en n-hexano, 1,4 g de extracto en acetato de etilo y 2,1 g de extracto residual en metanol, se rotularon y conservaron hasta el momento de su uso protegidos de la luz y a 4 ºC.

Prueba de Bioactividad. Inicialmente se realizó una prueba de bioactividad con cada uno de los extractos a una concentración de 150 ppm; aquellos que reflejaron una letalidad del 100% se evaluaron a las siguientes concentraciones: 100, 50, 10 y 1 ppm para su actividad molusquicida.

Actividad molusquicida. La actividad molusquicida se evaluó de acuerdo a los criterios establecidos por la OMS para plantas con actividad molusquicida a nivel de laboratorio (18). Los bioensayos se realizaron en recipientes de vidrio cilíndricos de 1500 mL de capacidad, en los cuales se agregó el volumen necesario de los extractos para preparar las diferentes concentraciones utilizadas. Las muestras de los distintos extractos se prepararon en una solución madre y se diluyeron en una solución de dimetilsulfoxido (DMSO) al 10% en agua declorada hasta alcanzar la concentración deseada para un volumen total de 500 mL en cada recipiente.

Los ensayos se llevaron a cabo con 5 ejemplares por frasco, y por duplicado para cada extracto, con sus respectivos controles negativos con agua declorada y se mantuvieron a temperatura ambiente, con aireación y una ración de lechuga durante el ensayo. Se determinó el efecto tóxico de los extractos y la mortalidad de los caracoles a las 48 horas.

Efecto tóxico de E. laurifolia A. Juss. Para determinar el efecto tóxico de E. laurifolia sobre B. glabrata, se observaron algunos parámetros fisiológicos, como motricidad de los ejemplares, el color de la concha, los latidos cardíacos y la respuesta a la irritación del pie del caracol. Los parámetros fisiológicos se registraron a las 24 y 48 horas posttratamiento. Luego de registrar el color de la concha, posición y movimiento de los caracoles, cada ejemplar se colocó en una lámina porta objeto bajo observación con un microscopio estereoscópico y se determinaron los latidos cardíacos durante un minuto, posteriormente se determinó la respuesta a la irritación del pie con una punta plástica. En los grupos controles se procedió de igual manera.

Se realizó una prueba t de Student entre los valores obtenidos para el ritmo cardíaco para establecer diferencias estadísticamente significativas.

Mortalidad y dosis letal. Después del periodo de toxicidad de 24 horas, los caracoles se transfirieron a frascos con agua declorada limpia (sin extracto) por 24 horas más, en las mismas condiciones de aireación, alimentación y mantenimiento. Al cabo de este período, se estimó la mortalidad. Como indicativo de muerte se consideró, cambio de color en la concha, si el ejemplar se encontró flotando o en el fondo del recipiente, sin latidos del corazón y la falta de respuesta a la irritación del pie con una punta plástica.

Se realizaron ajuste de la mortalidad aplicando la fórmula de Abbott (19). Se determinó la dosis letal cincuenta, dosis letal noventa y la dosis letal noventa y cinco (DL50, DL90 y DL95) calculadas por un análisis probit utilizando el programa estadístico Statgraphics Centurion XVI. Se realizó un análisis de varianza simple (ANOVA simple) para describir el impacto de la variable tipo de extracto sobre la mortalidad, así como determinar si hubo una diferencia estadísticamente significativa entre los extractos ensayados respecto a su acción molusquicida con un nivel de confianza de 95%. .

Resultados

Los resultados de la prueba de bioactividad mostraron 100% de mortalidad para el extracto crudo, el extracto hexánico y el extracto en acetato de etilo a 150 ppm, mientras que el extracto metanólico residual presentó sólo una actividad molusquicida del 10% por lo que no fue considerado en los ensayos posteriores.

En la tabla 1 se muestran los resultados obtenidos de los extractos ensayados de E. laurifolia sobre los parámetros fisiológicos estudiados de B. glabrata.

Del análisis estadístico (prueba t de Student) realizado entre los valores obtenidos para el ritmo cardíaco de los ejemplares bajo estudio sometidos a los diferentes extractos y a las diferentes concentraciones utilizadas en el bioensayo respecto a los controles utilizados, se obtuvo que la media para las pulsaciones a las 24 horas fue 41,1625 ± 1,29203, [39,8705 - 42,4545] y a las 48 horas fue 40,15 ± 0,933098, [39,2169 - 41,0831]. Mientras que el intervalo de confianza del 95,0% para la diferencia de medias suponiendo varianzas iguales fue 1,0125 ± 1,44557, [-0,433069, 2,45807] con un valor-P = 0,15525. Fue de interés particular el intervalo de confianza para la diferencia entre las medias, el cual se extiende desde -0,433069 hasta 2,45807. Puesto que el intervalo contiene el valor de 0, no hay diferencia significativa entre las medias de las dos muestras de datos, con un nivel de confianza del 95,0%.

En la figura 1, se muestran los valores de mortalidad obtenidos para los tres extractos ensayados de E. laurifolia a diferentes concentraciones contra B. glabrata. Se determinó que el extracto acetato de etilo originó el 100% de mortalidad a concentraciones menores a 10 ppm; mientras los extractos crudo y hexánico mostraron 70% y 60% de mortalidad a esa concentración, respectivamente. Los tres extractos ensayados a la concentración de 1 ppm se comportaron como los controles negativos.

Los resultados del análisis probit del cálculo de la dosis letal 50, 90 y 95 para cada extracto de E. laurifolia ensayado a las 48 horas de exposición con sus respectivos intervalos de confianza al 95,0% se muestran en la tabla 2. Se determinó que el extracto de acetato de etilo mostró la menor DL₅₀ de 5,57 y una DL₉₀ y DL₉₅ de 7,28 y 7,75, respectivamente. Para los extractos crudo y hexánico de E. laurifolia se registraron valores de dosis letal 50 cercanos a 9 ppm.

Durante el análisis probit se obtuvo que el valor de “P” para el modelo (P_modelo) es menor que 0,05 por lo que existe una relación estadísticamente significativa entre las variables, con un nivel de confianza del 95,0%. Además, el valor “P” para el residuo (P_residuo) es mayor o igual que 0,05 lo cual indicó que el modelo no es significativamente peor que el mejor modelo posible para estos datos con un nivel de confianza del 95,0% o mayor.

Discusión

Cuando se evalúa la actividad de un producto natural contra caracoles, no sólo es importante analizar el efecto letal que estos causen, también es necesario evaluar el posible efecto fisiológico sobre los cuales ejercen su acción biocida. Un estado alterado del caracol podría evidenciarse por un cambio en la coloración de la concha o en la motricidad, alteraciones de su frecuencia cardiaca o de la actividad reproductiva del caracol, variaciones de los fluidos de la hemolinfa como los niveles de glucosa, ácido úrico, proteínas totales y calcio, entre otros (20,21). En el presente estudio los resultados en relación a la evaluación de los parámetros fisiológicos registrados, como el cambio de color de la concha, su motricidad, ritmo cardíaco y la respuesta de irritación de los caracoles, no permitieron evidenciar ningún posible efecto toxico, sino un efecto letal de los extractos en las primeras horas de exposición. La rápida mortalidad muestra el efecto tóxico inmediato de E. laurifolia que reduce la capacidad de sobrevivencia de B. glabrata. Los mecanismos a través de los cuales las sustancias contenidas en los extractos ejercen la acción se desconocen. Para evaluar el posible efecto tóxico de E. laurifolia se sugiere evaluar otros parámetros fisiológicos y metabólicos en las primeras horas de exposición.

Los resultados observados en los extractos de E. laurifolia analizados muestran que esta especie posee una potente actividad letal contra caracoles de B. glabrata, considerándose como mejor el extracto en acetato de etilo, el cual presentó una DL₅₀ de 5,57 ppm. Los resultados obtenidos son superiores a varios reportes con distintas especies de Euphorbia contra B. glabrata (12,14) y estimulan a continuar los estudios sobre los compuestos activos y biotoxicidad de E. laurifolia.

Uno de los factores que determinan la potencialidad de una planta es el solvente de extracción (12). Los resultados mostraron que el mayor potencial molusquicida de E. laurifolia contra B. glabrata fue observado en el extracto en acetato de etilo; en relación al extracto crudo y de hexano, con dosis letales inferiores a las reportadas para otras plantas del mismo género (9,13), lo que constituye un gran aporte al estudio E. laurifolia como una fuente natural con alta potencialidad como molusquicida. Los resultados también sugieren que los compuestos responsables de la actividad molusquicida observada en los extractos de las partes aéreas de E. laurifolia son de naturaleza moderadamente polar. Similarmente, Baloch y colaboradores (22) reportaron que los extractos en acetato de etilo de Euphorbia cauducifolia L fueron los que más bioctividad presentaron.

Los resultados concuerdan con otros estudios, donde se reporta una buena actividad para extractos obtenidos a partir de solventes de polaridad media (9,23).

Entre los molusquicida de origen natural se han identificados saponinas, terpenoides, flavonoides y alcaloides (7,8,24-28). Algunos autores señalan que el efecto molusquicida de los compuestos naturales pudiera provocar inestabilidad osmótica y vesiculación superficial causando la muerte de los caracoles (29,22). Por otro lado, Se ha reportado que los terpenos, saponinas y los flavonoides son los principales compuestos aislados del género Euphorbia. Especialmente importante ha sido la actividad molusquicida reportada para los compuestos triterpénicos aislados de algunas especies del género Euphorbia, los cuales, en algunos casos, han sido tan potentes como el producto molusquicida comercialmente disponible conocido como Bayluscide® (9,10).

Recientemente, a partir del extracto en acetato de etilo de las partes aéreas de E. laurifolia se reportaron el diterpeno latazienona y el flavonoide quercetin-3-O-L-ramnosido o quercetrina en un estudio fitoquímico previo realizado por nuestro grupo de investigación en el Instituto de Investigación de la Facultad de Farmacia y Bioanálisis de la Universidad de los Andes, Mérida-Venezuela.

La presencia de este tipo de compuestos, el diterpeno del tipo latirano identificado como latazienona en el extracto de acetato de etilo, pudiera cumplir un rol fundamental en la actividad molusquicida presentada por E. laurifolia contra B. glabrata. Aunque no está claro cómo actúan estos diterpenos policíclicos muchos de estos compuestos son potentes agentes de alquilación (30). Se cree que la porción gem-dimetilciclopropil presente en estas moléculas es la responsable de la actividad biológica.

Como conclusión cabe decir que en el presente estudio se demuestra el potente efecto del extracto de acetato de etilo de E. laurifolia contra B. glabrata con lo cual, esta especie pudiera servir como una alternativa para el control de la schistosomiasis, en razón a ello, se sugiere realizar un estudio minucioso sobre el extracto de acetato de etilo de la E. laurifolia que permita determinar cuáles son los compuestos responsables de la actividad molusquicida.

Agradecimiento

Los autores agradecen al Ing. For. Juan Carmona por la identificación del material vegetal y al Consejo de Desarrollo Científico, Humanístico y Tecnológico de la Universidad de Los Andes por el financiamiento de esta investigación según el Proyecto Nº FA-535-13-08-ED.

Referencias

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Notas de autor

Instituto de Investigaciones. Facultad de Farmacia y Bioanálisis. Universidad de Los Andes, Mérida, Venezuela. Teléfono +58 2742216498.