Desarrollo de un ensayo casero para la detección de IgG contra el core del virus de la Hepatitis B

Development a homemade assay for IgG anti hepatitis B core detection

La infección por virus de la hepatitis B (VHB) es considerada como un problema de salud pública, y se estima que 3,6% de la población mundial está crónicamente infectada, aunque su distribución es muy heterogénea (1). La infección crónica puede generar daños irreversibles del tejido hepático, tales como la cirrosis y el carcinoma hepato celular (HCC) (2), siendo el HCC el causante de 500.000 a 600.000 muertes anuales (3). En América latina se ha reportado una en demicidad heterogénea y variable, según la región y grupos poblacionales. El rango de en demicidad es de baja a elevada y al menos de 7 a 12 millones de personas están infectadas, siendo una de las zonas más afectada la cuenca del Amazona (Brasil, Perú, Venezuela y Colombia) (4). Los grupos indígenas de América del Sur son una de las poblaciones más afectadas por este virus y su distribución varía dependiendo del grupo étnico y la región de asentamiento. Por ejemplo la prevalencia puede variar desde un 64,3% (anti-HBc total), del 9,4% (HBsAg) en la Amazonia Peruana (5), hasta un 15,4-54,5% (anti-HBc total) y del 3,4-9,7% para el HBsAg en la Amazonia Brasileña (6, 7).

El VHB es un virus de doble cadena de ADN de 3.2 kb, que contiene 4 marcos de lectura abierto, que codifican para la polimerasa viral; el core y el antígeno e; la proteína X y para los tres antígenos de superficie denominados: la proteína larga (L) constituida por preS1 +preS2 + S, la mediana (M), conformada por preS2 +S, y la pequeña (S) solo por el antígeno S (8). Dos de las principales herramientas actualmente utilizadas para el diagnóstico inicial y seguimiento de la infección por el VHB, son la detección del antígeno de superficie (HBsAg), y la detección de anticuerpos contra el core (anti-HBc). La detección de HBsAg es una herramienta muy útil sobre todo en las fases tempranas de la infección, sin embargo cuando se evalúa junto con anti-HBc, se convierte en una herramienta muy poderosa para detectar individuos expuestos al virus (9, 10). En nuestro país en la actualidad existen dificultades para la adquisición de pruebas diagnósticas por su elevado costo, en especial aquellas dirigidas a detectar la infección por el VHB, es por ello que como objetivo nos propusimos desarrollar una prueba de ELISA casera que permita la detección de IgG anti-HBcAg, a fin de ofrecerla como herramienta diagnóstica de producción nacional y más asequible, para utilizarse en conjunto con la detección del HBsAg. Nuestros resultados indican que la prueba casera para la detección de IgG anti-HBc, tiene una especificidad 100% y sensibilidad del 95 % y un índice Kappa de 0,901 (IC95%: 0,767-1), asociado a un valor de chi cuadrado estadísticamente significativo (p<0,001). Estos resultados indican que esta prueba pudiera ser una alternativa de bajo costo y de utilidad diagnóstica en nuestra región.

Sujetos: 112 individuos residentes del estado Mérida fueron reclutados al estudio. Este grupo consistió en 20 individuos sanos seronegativos, 43individuos infectados crónicos con serología positiva para anti-HBc y 49 individuos de la etnia Wayuu y mestizos residentes del estado Mérida. Este último grupo fue con el fin de aplicar la prueba para el tamizaje de una población. El estado serológico para la infección por el virus de la Hepatitis B se determinó con la prueba Murex anti-HBc (total)(DiaSorin, UK)usada como prueba de referencia. Las poblaciones indígenas se ubicaron en dos comunidades, la primera ubicada en el Municipio Obispo Ramos de Lora del estado Mérida, la Ranchería, a 40 minutos ; la comunidad está conformada por una población mixta (Wayuu y mestizos) estructurada en116 familias, con una población aproximada de 1000habitantes. La segunda comunidad es aledaña a la Azulita en el Municipio Andrés Bello del Estado Mérida, sector “El limón”, en donde hay gran confluencia de personas provenientes de Colombia(refugiados víctimas del conflicto armado) y de la etnia Wayuu.

Expresión y purificación del core de virus dela hepatitis B: La secuencia del core clonada en el vector pet21d, fue utilizada para transformar mediante shock térmico a la cepas de E. coli BL21-RIPL,luego cultivadas en medio líquido LB (0,5% de NaCl, 1%de peptona, 0,5% de extracto de levadura, pH 7) más glucosa (0,1%), magnesio (1mM) y ampicilina/cloramfenicol (50μg/ml), hasta alcanzar una densidad óptica de 600nm, momento en que se le añadió isopropil-β-D-tiogalactósido (IPTG 100ug/ml).Las células fueron tratadas con buffer de lisis (1% deTritón X100, 50mM de Tris pH 8, 150 mM de NaCl, 1mM de EDTA, 1 mM de PMSF, 1 mM de DTT, y 1 μg/mlde Leupeptina, 1 μg/ml de Aprotinina y 500 μg/ml deLisozima) y el homogenato celular se sometió asonicación, fue tratado con úrea (4M) y finalmente sometido a purificación por cromatografía. Las muestras resultantes de la expresión y purificación, fueron sometidas a electroforesis en un geldis continuo de poliacrilamida al 12%, para evaluar su pureza, y el western blot fue revelado mediante quimioluminiscencia utilizando el reactivo ECL SuperSignal de Pierce, USA, para evaluar su inmunogenicidad.

Ensamblaje de estuche inmunoenzimático (ELISA), validación y ensayos serológicos: Las placas de micro titulación de polyestireno se sensibilizaron con 10 μg/ml del core recombinante puro resuspendido en 50 mM de Buffer Na2CO3 (1M, pH9.6). La incubación se llevó a cabo a 4°C durante todala noche. La placa se bloqueó con PBS-BSA al 1,5% a4°C durante toda la noche. Los sueros se diluyeron1:20 en solución bloqueante y se incubaron durante 45minutos a 37°C. Los lavados (5 en total), se realizaron con TBS-TWEEN 20 0,1%. El anticuerpo secundario conjugado a Peroxidasa de Rábano (HRP) dirigido contra la IgG humana diluido 1:2500 en solución bloqueante, se incubo por 45 minutos a 37°C, luego se hicieron 5 lavados y el revelado de la placa se realizó con TMB y la reacción se detuvo con 50 μl de H2SO4. La densidad óptica se midió con un espectrofotómetro KAYTORT-2100C empleando una longitud de onda de450 nm.

Análisis estadístico: Los análisis estadísticos y los gráficos se realizaron con los programas SPSS versión 21 (IBM Corporation, New York, US), Excel2010 (Microsoft Corporation, Redmond, US) yGraphPad Prism versión 5 & Quickcalcs (GraphPadSoftware Inc, La Jolla, USA). La valoración diagnóstica del ensayo inmunoenzimático se realizó determinando los parámetros de validez y seguridad como sensibilidad, especificidad y valores predictivos; para ello se determinó el punto de corte a partir de la evaluación de las curvas operador-receptor (ROC),usando el programa SPSS versión 21, que permitió determinar el área bajo la curva indicador de la capacidad diagnóstica de nuestro test y los múltiples pares sensibilidad, 1-especificidad. Se determinó el punto de corte con el índice de Youden bajo la fórmulaIY=sensibilidad+especificidad-1 y se tomó el valor máscercano a 1; se clasificaron los resultados obtenidos con el inmunoensayo para cada una de las muestras según el índice de Youden en positivo y negativo.

Validación de los ensayos serológicos: Como fase inicial del estudio se determinó la validez,especificidad y sensibilidad del ensayo serológico casero a través del análisis de muestras con serología conocida para el core del VHB. Tal y como se muestra en la figura 1, el anti core recombinante expresado en el laboratorio es altamente inmunogénico y logra diferenciar entre los individuos expuestos y al VHB (figura 1a). Se evaluó la capacidad diagnóstica de la prueba determinando parámetros de validez y seguridad como sensibilidad, especificidad y valores predictivos; para ello se determinó el punto de corte a través del análisis de discriminación de señales con curvas ROC y del índice de Youden (ver figura 1b),obteniéndose un área bajo la curva de 1,00 y un punto de corte de DO=0,317. Se estimó el área bajo la curva en 1,00 como un indicador adicional de la capacidad diagnóstica de la prueba. La concordancia entre los resultados obtenidos con la prueba diagnóstica y el estado serológico conocido de los individuos, se comparó con el índice Kappa (ver tabla 1) y con la prueba chi cuadrado. La prueba evaluada mostró gran capacidad diagnóstica con niveles de sensibilidad, especificidad, valores predictivos positivos y negativos de 100%.

Figura 1

Evaluación de la prueba serológica anti-HBc IgG. 1a. Presencia de anticuerpos específicos contra el core en individuosno expuestos (seronegativos), infectados crónicos (enfermos).1b. Curva operador-receptor (ROC) para el ensayo serológico deanti-HBc IgG, se obtuvo un área bajo la curva de 1 (p<0,001). La evaluación del índice de Youden permitió establecer un valorcutoff de 0,317

La infección por VHB clásicamente es diagnosticado por la presencia de antígeno des uperficie circulante (HBsAg) y la presencia de anticuerpos contra el core (anti-HBc). El anti-HBcaparece durante la fase aguda y persiste por el resto de la vida, mientras que el HBsAg desaparece asociado a la aparición de anticuerpos anti-HBsAg, conforme elindividuo puede eliminar y controlar la infección (11).Así la detección del anti-HBc en combinación con estos marcadores se ha convertido en una herramienta útilde exposición e infección por el VHB (12), de hecho la presencia de anti-HBc en ausencia de HBsAg, permitela identificación de pacientes con infección oculta (13),de ahí la importancia de contar con un ensayos erológico que permita la diferenciación de individuos expuestos versus los no expuestos. La importancia de detectar los títulos de IgG anti-HBc radican en evidencias recientes que indican que los niveles de anticuerpos anti-HBc reflejan la especificidad de la inmunidad adaptativa y en los individuos infectados crónicos pudiera predecir la respuesta terapéutica (14) y es un fuerte predictor de la seroconversión al HBeAg(15), por lo que se hace necesario contar con ensayos que permitan cuantificar los niveles de anticuerpos y así contar con una herramienta que permita predecirla evolución durante la infección crónica.

Basados en los resultados se procedió al análisis de dos grupos indígenas y mestizos ubicadas en dos poblaciones del estado Mérida asentadas en Guayabones y en la Azulita. En nuestro país, la población indígena está conformada por 724592 personas (según los resultados del censo de población y vivienda realizado en el año 2011) (16) de las cuales 2103 se encuentran en el territorio del estado Mérida, fundamentalmente en la zona de la costa oriental del Lago de Maracaibo; la mayoría (60%) de esta población indígena pertenece a la etnia Wayuu seguida de la Timote/Timotocuica (13%) y 20 etnias minoritarias. En este trabajo se determinó la presencia de anticuerpos contra el core en dos comunidades de población indígena, la primera ubicada en el Municipio Obispo Ramos de Lora del estado Mérida, la Ranchería, a 40minutos de Guayabones; la comunidad está conformada por una población mixta (Wayuu y mestizos) estructurada en 116 familias, con una población aproximada de 1000 habitantes. La segunda comunidad es aledaña a la Azulita en el Municipio Andrés Bello del Estado Mérida, sector “El limón”, en donde hay gran confluencia de personas provenientes de Colombia (refugiados víctimas del conflicto armado)y de la etnia Wayuu.

Tabla 1

Evaluación de los parametros de Validez y Seguridad de la prueba IgG anti-HBc del virus de la hepatitis B

Figura 2

Presencia de anticuerpos específicos contra elcore en la población indígena Wayuu y mestizos. Sedeterminó, en la población estudiada, una prevalenciade seropositividad para IgG anti-HBc de 22% (11/49).

Una vez estandarizado y validado los ensayocaseros para la detección de IgG anti core se procedióa analizar los sueros de 49 individuos de la etniaWayuu y mestizos asentadas en el estado Mérida (figura 2). Se muestran las densidades ópticasobtenidas en individuos provenientes de la poblaciónindígena discriminados según el punto de corte. Seevidencia una seroprevalencia del 22% de anticuerposanti-HBc IgG. Estudios previos han reportado altaendemicidad por el VHB en grupos indígenas deAmérica del Sur, sin embargo su distribución esdiferente según el grupo étnico evaluado. Por ejemplo,en el caso de los indígenas Waorani de Ecuador seevidenció una seroprevalencia del 14 al 54% a travésde la determinación del HBsAg (17), mientras que enlos indígenas Yanomami del Estado Amazonas,Venezuela, la seroprevalencia es de un 68,4% y del17,3% en el caso de los Piaroa (18, 19). En el caso delas etnias Yucpa y Bari de la Sierra de Perijá, laseroprevalencia se ubica por encima del 60% (20). Y enla comunidad indígena Japreira medido a traces de la detección del anti-HBc fue del se ubicó alrededor del 75%. En el caso de la etnia Wayuu no se encuentran reportes en la literatura sobre la seroprevalencia, y en este caso su comportamiento es muy similar al observado en los residentes de la Amazonia Brasileña(6, 7).