Introducción

Candida albicans es el patógeno oportunista aislado con mayor frecuencia en el sector hospitalario, responsable de un 60% de los cuadros de candidiasis. Se considera un patógeno oportunista ya que forma parte de la flora habitual de los individuos (1). Debido al aumento en la población de riesgo y el uso indiscriminado de antifúngicos, se ha observado un incremento en la resistencia de las especies de Candida a la familia de los azoles, compuestos que inhiben la enzima 14α-lanosterol-desmetilasa, afectando la biosíntesis de ergosterol, un importante componente de la membrana plasmática fúngica (2), ocasionando falla terapéutica. En tal sentido, las plantas medicinales proporcionan estructuras simples o complejas con actividad biológica de gran interés terapéutico, representando una fuente importante de principios activos frente a microorganismos patógenos para el hombre (3).

Estudios etnobotánicos revelan que en la medicina tradicional se hace uso de plantas de la familia Euphorbiaceae con fines terapéuticos (4, 5). Por su parte, la especie Hura crepitans L., (Euphorbiaceae) descrita por Carlos Linneo, es conocida como jabillo, un árbol de gran tamaño con tronco espinoso y un látex venenoso, usado como árbol ornamental y de sombra (6); se le han descrito diversas aplicaciones terapéuticas a las hojas, corteza del tallo, las raíces y las semillas, tales como purgante, astringente y emolientes, usos dermatológicos, fungicida, antimicrobiano (7, 8, 9), para el tratamiento de la hipertensión (10).

Con el objeto de contribuir con el estudio de la actividad biológica de H. crepitans, en la presente investigación se evaluó la actividad antifúngica de los extractos de hojas frente a Candida albicans por el método de difusión en agar con discos..

Materiales y métodos

Material Vegetal: La especie H. crepitans L. (1 kg de hojas), fue recolectada en el Jardín de Plantas Medicinales de la Facultad de Farmacia y Bioanálisis “Dr. Luis Ruiz Terán”, Universidad de Los Andes, Mérida – Venezuela. Fecha de recolección: 27 de Junio 2016. La identificación botánica la realizó la Ing. Forestal María Rodríguez y una ficha de la muestra (código Nº 01. M.Azuaje) se depositó en el herbario MERF de la Facultad de Farmacia y Bioanálisis, Universidad de Los Andes.

Obtención de los Extractos: Las hojas de H. crepitans L. se secaron a temperatura ambiente en la sombra durante una semana. Posteriormente se procedió a triturarlo con un molino eléctrico y se colocó a macerar con solventes de polaridad diferente: hexano, etanol y acetona, en periodos de tiempo distintos, de forma contínua para obtener el mayor número de metabolitos secundarios de acuerdo con la solubilidad en los solventes empleados. Los extractos se colocaron en frascos estériles y se llevaron a la estufa hasta su completa secado. Obteniéndose 3 muestras: E₁: Hexano, E₂: Etanol y E₃: Acetona.

Evaluación de la Actividad Antifúngica: La actividad antifúngica se determinó por el método de difusión en agar con discos descrita por Contreras- Moreno y col., 2016 (11) con las siguientes modificaciones: la cepa C. albicans B-385 se cultivó en agar Sabouraud dextrosa con cloranfenicol a 37°C durante 18 horas previo al ensayo. El inóculo fúngico se ajustó con solución salina fisiológica (0.85%) al patrón de turbidez de McFarland N° 1 (3x10⁸ UFC/mL), 1 mL de esta suspensión se incorporó a 20 mL de agar Müeller-Hinton (MH), suplementado con glucosa (2%p/v) y azul de metileno (0,5 μg/mL). Una vez solidificado el medio MH, se colocó sobre la superficie un disco de papel de filtro (6 mm diámetro y 2 mm de espesor) previamente impregnado con 20 μl del extracto y esterilizado con luz ultravioleta durante la noche, además un disco como control negativo con el solvente utilizado en cada caso (hexano, etanol y acetona) y un disco de Fluconazol^® (control positivo). El medio de cultivo inoculado se preincubó durante 18 horas a 4°C y luego se incubó a 37°C (12). La lectura de los halos de inhibición se realizó a las 24 y 48 horas y la zona de inhibición alrededor del disco se expresó en mm (Tabla 1).

Figura 1.
Actividad antifúngica de los extractos obtenidos de las hojas de Hura crepitans L. frente a C. albicans B-385. 1a. Extractos ensayados: E1: Extracto Hexanoico, E2: Extracto Etanólico, E3: Extracto Acetónico. FLU: Fluconazol®. C1: Hexano, C2: Etanol, C3: Acetona. 1b. Concentración inhibitoria mínima (CIM) del extracto etanólico obtenido de las hojas de Hura crepitans L., frente a Candida albicans B-385. Rango de concentración 20-400 mg/µl.

La concentración inhibitoria mínima (CIM) se determinó con el extracto que inhibió el desarrollo de la levadura, se realizaron diluciones con un rango de concentración 20-400 mg/mL en el solvente utilizado en el proceso de preparación del extracto; se impregnaron discos con 20 μl de cada dilución y se realizó el procedimiento anteriormente descrito. La CIM se define como la concentración más baja capaz de inhibir el desarrollo de la levadura (13). Los experimentos se realizaron por duplicado.

Tabla 1.

Actividad antifúngica de los extractos de Hura crepitans L. frente a C. albicans B-385.

E₁: Extracto Hexanóico (527 mg/mL), E₂: ExtractoEtanólico (529 mg/mL), E₃: Extracto Acetónico (526mg/mL). FLU: Fluconazol^® (25 mg), control positivo. NA:No activo. NP: No probado. *Zona de inhibición en mm,diámetro del disco 6 mm, media tomada de dos ensayosconsecutivos. CIM: Concentración Inhibitoria Mínima,rango de concentración 20-400 mg/μl.

Estudio Fitoquímico del Extracto con Actividad Antifúngica: La caracterización fitoquímica del extracto que mostró actividad antifúngica se realizó mediante las técnicas descritas por Hinojosa y col., (14). Entre los metabolitos secundarios buscados se tienen: Alcaloides, triterpenos, esteroides, flavonoides y saponinas. Para la identificación cualitativa se realizó una cromatografía de capa fina, para la fase móvil: se agregó a la cámara hexano: Acetato de etilo (7:3), se tapó la cámara para evitar la evaporación, posteriormente, se sembró de 5 a 10 veces el extracto secándose a la vez. Al secarse se agregó la vainilla revelador universal mostrando múltiples manchas.

Se procedió a realizar la siguiente extracción: Se pesaron 10 g de hojas pulverizada y se agregaron 20 mL de la mezcla agua-etanol (1:10) y 20 mL de éter de petróleo en un matraz tapado y aislado de la luz. Luego, fue colocado en un agitador a 150 rpm durante 1 h. Transcurrido ese tiempo, el sobrenadante se colocó en un embudo de separación para obtener dos fases: etanol-agua y oleosa (etérea), para la identificación de: a) Flavonoides (prueba Shinoda y por cromatografía de capa fina, se procedió a identificar la presencia de los flavonoides quercetina y rutina usando como patrones: Quercetina 2mg/mL MeOH y Rutina 2mg/mL MeOH, mediante el revelador NEU (2- aminoetil-difenilborato) (15). b) Saponinas (se utilizó el ensayo de espuma). c) Alcaloides (pruebas de Dragendorff, Wagner y Mayer). d) Triterpenos y esteroides (se utilizó la prueba de Lieberman- Buchard).

Resultados

En la figura 1 y tabla 1 se describen los resultados obtenidos de la evaluación antifúngica de los extractos de H. crepitans L. frente a C. albicans B- 385. Sólo el extracto etanólico inhibió el desarrollo de la levadura a una concentración de 529 mg/μl y un halo de inhibición de 14 mm de diámetro, con una CIM de <20 mg/μl. Los ensayos de caracterización cualitativa realizados al extracto etanólico de las hojas de H. crepitans L., indican la presencia de saponinas y esteroides (Tabla 2).

Tabla 2.

Tamizaje fitoquímico del extracto etanólico de las hojas de Hura crepitans L.

(-): Ausente, (+): presente.

Discusión

Los resultados obtenidos en la evaluación de la actividad antifúngica de los extractos obtenidos de las hojas de H. crepitans L., se correlacionan con el estudio realizado por Oloyede y Olatinwo 2014 (16) en Nigeria, quienes evaluaron la actividad antimicrobiana de extractos de hexano, butanol y acetato de etilo de la corteza del tallo de dicha especie, con inhibición del desarrollo de C. albicans a concentraciones de 6,25 a 200 mg/mL, siendo la fracción de acetato de etilo la más activa.

Solo el extracto etanólico mostró actividad antifúngica, al respecto, Rojas y col., (17) señalan que los solventes juegan un papel significativo en la efectividad de los extractos de las plantas como agentes antimicrobianos. Es importante destacar que este es el primer estudio in vitro de la actividad antifúngica del extracto etanólico de las hojas de Hura crepitans L.

Por otra parte, especies pertenecientes a la familia botánica Euphorbiaceae han presentado la inhibición de cepas de C. albicans y Cryptococcus neoformans, como es el caso del extracto etanólico de Euphorbia lancifolia (18). La especie Cnidoscolus aconitifolius ha mostrado la presencia de taninos, saponinas, alcaloides y flavonoides, metabolitos relacionados con actividad antimicrobiana (19).

Dentro de los hongos, Candida es uno de los patógenos oportunistas más comunes y en especial por la presentación de cuadros invasivos en pacientes inmunocomprometidos. Al respecto, Candida albicans es la especie más patógena y su virulencia se debe a un conjunto de atributos relacionados con su habilidad para evadir a los mecanismos de defensa del hospedador, de resistir al tratamiento antifúngico, o de lesionar las células y tejidos que invade (20). Como resultado, la terapia antifúngica está jugando un papel muy importante en el cuidado de la salud, y el tamizaje de plantas tradicionales en busca de nuevos antifúngicos es ahora más frecuente (21).

Respecto al estudio fitoquímico de la especie en estudio, se ha reportado entre los metabolitos secundarios presentes en extractos metanólicos de las hojas y corteza del tallo de H. crepitans, se encuentran: alcaloides, esteroides y compuestos fenólicos. Los flavonoides, glucósidos cardíacos y taninos aunque presentes en la corteza eran sin embargo ausente en las hojas, pero saponinas y carbohidratos si fueron detectados (16).

La distribución de los compuestos antifúngicos puede ser definida ya sea en base a su distribución taxonómica o su clase química. Los antifúngicos naturales pertenecen a todas las clases mayores de metabolitos secundarios como compuestos fenólicos, alcaloides, terpenoides, saponinas, flavonoides, proteínas, y péptidos, entre otros (22).

Finalmente, se ha reportado otros usos a la especie Hura crepitans L., como insecticida natural en áreas tropicales. Los insecticidas vegetales han vuelto a ser considerados como una opción válida para la eliminación de insectos por ser muchas las ventajas que ofrecen, especialmente desde el punto de vista ecológico (23). Asimismo, el extracto hexanoico posee actividad antiviral contra BHV-1 (24) y actividad antibacteriana contra Staphylococcus aureus (21).

La actividad antifúngica exhibida por el extracto etanólico de las hojas contra C. albicans, apoyará futuras investigaciones orientadas a aislar y caracterizar el o los componentes responsable(s) de dicha actividad.

Referencias

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Notas

Información adicional

Como citar este artículo:: Azuaje M, Villarreal S, Rojas-Fermín L, Díaz C, Velasco J, Salazar O, Rodríguez M. Actividad antifúngica in vitro de extractos de Hura crepitans L. (Euphorbiaceae) frente a Candida albicans. Avan Biomed 2017; 6: 197-