La pandemia causada por el coronavirus tipo 2 induce el síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2) y causa la COVID-19 ⁽¹⁾. Al momento de este estudio, el Perú atravesaba por una segunda ola, con mayor índice de letalidad e ingreso a las unidades de cuidados intensivos (UCI) debido a las nuevas variantes del virus ^(2–4). Al mismo tiempo, la población comenzó a vacunarse, lo que disminuyó no solo las muertes sino también las estancias hospitalarias y, por el lado de la ciencia, se generó el interés por conocer lo que sucede con los mecanismos básicos del sistema inmune ante este estímulo vacunal. Un evento importante es la tormenta de citocinas IFN-α, IFN-γ (interferones tipo alfa y gamma), IL-1β, IL-6 (interleucinas tipo 1 beta y 6), TNF-α (factor de necrosis tumoral tipo alfa) entre otras) inducida por el virus, pero promovida por distintas células inmunes, lo que lleva a reacciones hiperinflamatorias y procoagulantes. ^(5–8)

El incremento de TNF-α en adultos mayores puede inducir apoptosis en los linfocitos T (LT) ⁽⁹⁾. La linfopenia observada en COVID-19 podría predecirse con los niveles de TNF- α. ⁽¹⁰⁾

La inmunidad adaptativa es un poco más lenta, ya que requiere reconocimiento, procesamiento, presentación y activación del sistema de linfocitos ⁽¹¹⁾. La inmunidad adaptativa celular no solo es importante porque los LT CD4⁺ estimulan la respuesta por LT CD8⁺ antivirales, sino también porque colaboran con la producción de anticuerpos a través de un mecanismo T-dependiente ^{(12, 13)}. Diao et al. ⁽¹⁴⁾, demostraron que en pacientes con COVID-19 se presenta una disminución de LT totales y subpoblaciones CD4⁺ y CD8⁺, además esta disminución tuvo correlación negativa con las concentraciones en suero de TNF- α, IL-6 e IL-10. Tal disminución podría promoverse por una sobre expresión de TNF-α. ^{(15, 16)}

Por otro lado, el agotamiento celular de LT aparece ante la persistencia de antígenos en infecciones virales o cáncer y produce falla en el desarrollo de LTCD8⁺ de memoria y un deterioro en las funciones de LTCD8⁺ efectores ⁽¹⁷⁾​. En la fase aguda y convaleciente de la COVID-19 el agotamiento celular se caracteriza por la pérdida gradual y progresiva de las funciones celulares; expresión sostenida de receptores inhibidores o ¨checkpoints¨ PD-1(Receptor de muerte celular programada tipo 1), CTLA-4 (Antígeno 4 de linfocito T citotóxico), NKG2A (Subfamilia K de receptores similares a lectina de células NK) entre otros; cambios en el panorama epigenético-transcripcional y reprogramación metabólica ^(17–22)​. En la COVID-19 se presentan altos porcentajes de LT, CD8⁺PD-1⁺ y CD4⁺PD-1⁺ con altos niveles de PD-1, lo que demuestra que el SARS-CoV-2 induce el agotamiento celular. ^{(21, 23, 24)}​

En la COVID-19 existe linfopenia y pérdida de la funcionalidad de los linfocitos totales ^{(21, 23, 25, 26)}​. Diao B et al. ⁽²³⁾, reportaron que el 82,1% de pacientes con la COVID-19 tenían linfopenia, además, 522 casos tenían alta producción de PD-1 y Tim-3 (inmunoglobulina de células T que contiene dominio de mucina-3) en LT CD4⁺ y CD8⁺ ​. Por tanto, es importante investigar el grado de agotamiento celular en personas vacunadas. Además, debido al rol cooperador de los LT sobre la producción de anticuerpos, la disminución de los niveles de LT afectaría indirectamente los niveles de anticuerpos IgG. Bajo este contexto, el objetivo del estudio fue evaluar el comportamiento de los niveles de TNF-α, anticuerpos IgG y poblaciones de LT, incluyendo su agotamiento celular, antes y después de la tercera dosis de la vacunación contra el SARS-CoV-2.

Estudio exploratorio; los participantes fueron enrolados por el equipo de investigación del Laboratorio de Inmunología # 108 – LID – FACI – UPCH. Los criterios de inclusión fueron: 1. Varones o mujeres mayores de 18 años; 2. Con o sin comorbilidades; 3. Grupo G1 (n=07), contó con un esquema de vacunación de primera y segunda dosis con la vacuna de BNT162b2, tuvo infección entre 0 y 4 meses postvacunación y además recibió una tercera dosis de la misma vacuna; 4. Grupo G2 (n= 08), similar al G1 pero sin infección y 5. Grupo G3 (n=10), similar al grupo G2, pero con tercera dosis de la vacuna ChAdOx1-S. Aunque los G2 y G3 no tuvieron infección, se les catalogó como asintomáticos debido a que no fue posible comprobar la no infección con pruebas antigénicas.

El estudio es de tipo exploratorio y pretende contar con evidencia que permita ahondar en el estudio de los mecanismos inmunes afectados antes y después de la tercera dosis de vacunación homóloga o heteróloga contra el SARS-CoV-2.

En el análisis individual de las variables medidas se encontró un aumento estadísticamente significativo de TNF-α después de la tercera dosis de la vacuna de BNT162b2 en G1; sin embargo, analizando el valor estadístico de p=0,05 y el tamaño muestral bajo llegamos a la conclusión que no se puede aseverar certeramente el resultado de que la vacuna induce el aumento de una citocina pro inflamatoria, el que es posible que sea un rezago de la etapa de infección con SARS-CoV-2 por la que atravesó el grupo G1 (tuvo infección entre 0 a 4 meses después de las dos primeras dosis de la vacuna de BNT162b2). Otro aspecto a tener en cuenta es que, los niveles encontrados son tan bajos (<100pg/ml) que no se puede atribuir a esta citocina un efecto tal como un shock tóxico e inflamación o agotamiento celular sobre células como los LTCD4⁺ como lo indican Aguillón JC. et al. ⁽²³⁾ y Diao B. et al. ⁽²⁷⁾, respectivamente.

Gráfico 4. Gráfico 4. Porcentajes de linfocitos totales, LT, subpoblaciones y su nivel de agotamiento celular antes y después de la tercera dosis de vacunación. Porcentajes poblacionales de linfocitos según los parámetros de tamaño y granularidad (FSC/SSC) para linfocitos totales (A) y fluorescencia para LT, CD3+ (B), subpoblaciones CD4+ (C) y CD8+ (D) y agotamiento celular PD-1+ (E y F) antes y después de la tercera dosis de vacuna. Donde G1, n=07 luego de 0 a 4 meses de haber tenido infección, recibieron tercera dosis de vacuna BNT162b2; G2, n=08 al momento de la tercera dosis de vacuna BNT162b2 no tenían infección (asintomáticos) y G3, n=10 al momento de la tercera dosis de vacuna ChAdOx1-S no tenían infección (asintomáticos). Significancia estadística si * p<0,05 o ** p<0,01. Prueba T pareada (A), G2; (C y D), G3 y Prueba de Wilcoxon pareada (E y F), G3. Se representa la línea mediana de concentración del porcentaje poblacional y los límites superior e inferior representan el intervalo de confianza al 95% en gráficos de violín. Gráfico 4. Porcentajes de linfocitos totales, LT, subpoblaciones y su nivel de agotamiento celular antes y después de la tercera dosis de vacunación. Porcentajes poblacionales de linfocitos según los parámetros de tamaño y granularidad (FSC/SSC) para linfocitos totales (A) y fluorescencia para LT, CD3+ (B), subpoblaciones CD4+ (C) y CD8+ (D) y agotamiento celular PD-1+ (E y F) antes y después de la tercera dosis de vacuna. Donde G1, n=07 luego de 0 a 4 meses de haber tenido infección, recibieron tercera dosis de vacuna BNT162b2; G2, n=08 al momento de la tercera dosis de vacuna BNT162b2 no tenían infección (asintomáticos) y G3, n=10 al momento de la tercera dosis de vacuna ChAdOx1-S no tenían infección (asintomáticos). Significancia estadística si * p<0,05 o ** p<0,01. Prueba T pareada (A), G2; (C y D), G3 y Prueba de Wilcoxon pareada (E y F), G3. Se representa la línea mediana de concentración del porcentaje poblacional y los límites superior e inferior representan el intervalo de confianza al 95% en gráficos de violín.

La concentración de anticuerpos IgG (anti-N) en todos los grupos de vacunación no cambió después de la tercera dosis de vacuna, lo que significa que al menos en la mediana de tiempo de los tres grupos (47,5 días; IC95% 42-89 días) los niveles de anticuerpos se mantienen y pueden proteger a los vacunados independientemente del esquema de vacunación. Nuestro resultado concuerda con los estudios sobre la cinética de anticuerpos inducidos por la vacunación que indican que después de las dos primeras dosis se alcanza un pico de producción de anticuerpos que con un booster o tercera dosis se puede mantener títulos constantes de anticuerpos. ⁽²⁸⁾

Gráfico 5. Gráfico 5. Correlación entre la concentración de anticuerpos IgG (anti-N-SARS-CoV-2) y los porcentajes poblaciones de LT, CD4+PD-1+ y CD8+PD-1+ después de la tercera dosis de vacunación. Correlación estadística de Pearson entre la concentración de IgG (U/ml) y los porcentajes de CD4+PD-1+ y CD8+PD-1+, respectivamente antes (A) y después (B) de la tercera dosis de vacuna. G3, n=10 al momento de la tercera dosis de vacuna ChAdOx1-S no tenían infección (asintomáticos). Significancia estadística si p<0,05; Rho (r) para un intervalo de confianza de 95%. Gráfico 5. Correlación entre la concentración de anticuerpos IgG (anti-N-SARS-CoV-2) y los porcentajes poblaciones de LT, CD4+PD-1+ y CD8+PD-1+ después de la tercera dosis de vacunación. Correlación estadística de Pearson entre la concentración de IgG (U/ml) y los porcentajes de CD4+PD-1+ y CD8+PD-1+, respectivamente antes (A) y después (B) de la tercera dosis de vacuna. G3, n=10 al momento de la tercera dosis de vacuna ChAdOx1-S no tenían infección (asintomáticos). Significancia estadística si p<0,05; Rho (r) para un intervalo de confianza de 95%.

La evaluación de los niveles porcentuales de LT indica que el mejor esquema de vacunación es el G3 o heterólogo, en el que después de la administración de la vacuna de ChAdOx1-S se incrementan los LT helper, que son vitales para sostener la respuesta de anticuerpos y LT citotóxicos, pero además reduce el agotamiento celular de ambas subpoblaciones de LT, lo que mejoraría la respuesta celular contando con células con señales de coestimulación activen más eficientemente cuando el sistema inmune se enfrente a una infección por SARS-CoV-2.

En este estudio exploratorio se planteó la posibilidad de la existencia de una correlación entre las variables del eje IgG-TNF-α-LT, en la que la inducción de TNF-α podría causar linfopenia con lo que habría una disminución o agotamiento celular de LT, que a su vez afectaría la producción de anticuerpos antivirales. Únicamente se encontró que a mayor concentración de IgG (anti-SARS-CoV-2) mayor agotamiento celular en las subpoblaciones porcentuales de LT. Este resultado es contradictorio porque se esperaría que los LT mejoren su nivel de activación, pero el incremento de células PD-1⁺, una molécula inhibidora de la activación del LT, indicaría lo contrario; sin embargo, para corroborar esta hipótesis se tendría que evaluar LT-antígeno específicos contra SARS-CoV-2. Esta contradicción en el agotamiento celular de subpoblaciones de LT cuando se evalúan individualmente o comparados a una variable como la concentración de IgG anti-SARS-CoV-2 se debería dilucidar con LT antígeno-específicos a SARS-CoV-2, ya que es posible que LT que presentan mayor agotamiento celular a mayor concentración de IgG anti-SARS-CoV-2 se deba a LT con otras especificidades. De comprobarse este agotamiento celular antígeno-específico, se podría corregir la falta de funcionalidad de los LT con inmunoterapia con anticuerpos monoclonales anti-PD-1 en el tratamiento de la COVID-19, como lo experimentó Roy S. et al. ⁽²⁹⁾ en un modelo animal de herpes ocular.

En personas con cáncer, los efectos de la vacunación (Sinopharm) sobre el tratamiento anti-PD-1 no son afectados y, más bien, la administración de ambos mejora las señales coestimuladoras y reduce la regulación co-inhibidora. ⁽³⁰⁾

Tras los resultados obtenidos, se plantea la pregunta si es necesario, medidas profilácticas adicionales como el uso de anticuerpos monoclonales, además de las dosis de refuerzo.

Existen LT que aumentan su nivel de agotamiento celular y, por lo tanto, la investigación futura es importante para determinar la respuesta inmune a largo plazo a dosis adicionales de la vacuna.

Dentro de las principales limitaciones de este estudio se encuentran, no haber podido catalogar laboratorialmente como sujetos sin infección a los grupos G2 y G3, limitándonos a describir lo indicado por el donante, por tal razón, preferimos denominarlos asintomáticos; el bajo tamaño muestral, lo que probablemente influye en las diferencias estadísticas encontradas particularmente en la medición de TNF-α (G1) donde a pesar de existir una diferencia significativa (p=0,05), el valor limítrofe impide concluir con certeza un evento pro inflamatorio postvacunación en el grupo G1. Es posible que se requieran más puntos de medición en el tiempo para las variables, concentración de anticuerpos y citocinas. Además, de TNF-α sería interesante medir otras citocinas proinflamatorias como IL-6 e IL-1. En el caso de IL-6 se conoce su influencia sobre la producción de anticuerpos; sin embargo, con este estudio se abren nuevas vías de estudio en la infección por SARS-CoV-2.

En conclusión, en este estudio exploratorio se observó que el esquema de vacunación heterólogo del grupo G3 fue el mejor, ya que incrementó los niveles de LT CD4⁺, una subpoblación que sostiene la inmunidad adaptativa antiviral y evitó el agotamiento celular de las subpoblaciones de LT con lo que se evidencia una mejora de la respuesta inmune celular; sin embargo, es posible que el costo de mantener el nivel de anticuerpos se correlacione positivamente con el agotamiento celular de las subpoblaciones de LT. Ninguno de los esquemas de vacunación modificó significativamente la respuesta humoral (IgG) e inflamatoria (TNF-α), manteniéndolas en un nivel de normalidad frente a la vacunación.