BACTERIOCINAS DE BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS: MECANISMOS DE ACCIÓN Y ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA CONTRA PATÓGENOS EN QUESOS

BACTERIOCINS OF LACTIC ACID BACTERIA: MECHANISMS OF ACTION AND ANTIMICROBIAL ACTIVITY AGAINST PATHOGENS IN CHEESE

BACTERIOCINAS DE BACTÉRIAS ÁCIDO LÁCTICAS: MECANISMOS DE AÇÃO E ATIVIDADE ANTIMICROBIANA CONTRA PATÓGENOS EM QUEIJOS

Las bacterias ácido lácticas (BAL) son ampliamente utilizadas en la industria alimentaria por su capacidad de conferir diferentes características sensoriales como textura, sabor y olor agradable a los alimentos fermentados (Parra-Huertas, 2010; O’Bryan et al., 2015a). Las BAL son un grupo de bacterias clasificadas como Gram positivas, no formadoras de esporas, sin motilidad, con forma de cocos o bacilos, microaerofílicos o anaerobios facultativos,, y que sintetizan principalmente ácido láctico durante su proceso de fermentación (Monroy et al., 2009; Siamansouri et al., 2013). En las últimas décadas se ha explo rado el potencial de las BAL como bio conservadoras naturales de productos lácteos, debido a la producción de diversos metabolitos como el ácido láctico, peróxido de hidrógeno, diacetilo, dióxido de car- bono (CO2) y las bacteriocinas per se (Siamansouri et al., 2013; O’Bryan et al., 2015b); siendo estas últimas las que han despertado mayor interés.

Algunas de las ventajas que se han considerado para la aplicación y uso de las bacteriocinas son su no toxicidad para células eucariotas, su mayor inhibición comparada con las producidas por bacterias Gram negativas, y aunque solo la bacteriocina nisina, producida por Lactococcus Lactis, es considerada segura para el consumo humano (GRAS, del inglés Generally Reconized As Safe) de acuerdo a la Food and Drung Administration (FDA) de los EEUU, se sabe que no forman compuestos secundarios al biodegradarse en el tracto gastrointestinal.

Además, su aplicación no solo se enfoca como bioconservador de alimentos, sino también en cosméticos y en tratamientos biomédicos contra infecciones en medicina humana y veterinaria (Dolz, 2008; López et al., 2008; Beristain-Bauza et al., 2012; Józefiak y Sip, 2013; Yang et al., 2014). Aunque en un principio se pensaba que las bacteriocinas solo actuaban contra bacterias estrechamente relacionadas con la cepa productora, en años recientes este concepto ha cambiado, ya que se han encontrado bacteriocinas que pueden actuar contra cepas filogenéticamente distanciadas con la cepa productora (Dolz, 2008).

En las últimas décadas, los estándares de calidad en la industria alimentaria son más exigentes. Particularmente, en los quesos se han encontrado una diversidad de microorganismos patógenos, debido a que la mayoría son elaborados con leche cruda, su composición química es una fuente rica de nutrientes para los microorganismos y en su proceso de elaboración son altamente manipulados. Se ha propuesto que las bacteriocinas o las BAL productoras de bacteriocinas pueden ser una alternativa natural para su conservación. Sin embargo, se ha reportado que su uso podría verse limitado por las características físicas y químicas de los propios quesos, ya que las bacteriocinas podrían interactuar con los componentes hidrofóbicos de la matriz y como consecuencia perder su actividad (Kousta et al., 2010; Jeanson et al., 2011; Aly et al., 2012; Favaro et al., 2015). El objetivo de esta revisión es actualizar la información disponible sobre las características generales de las bacteriocinas, su clasificación y mecanismos de acción. Además, comparar la actividad antimicrobiana que presentan las bacteriocinas contra patógenos presentes en quesos y discutir sobre las perspectivas de su aplicación como conservador comercial.

Las bacteriocinas se definen como péptidos de origen ribosomal que son secretados al medio extracelular y tienen la capacidad de inhibir el crecimiento de otros microorganismos (Monroy et al., 2009; Beshkova y Frengova, 2012; Mondragón Preciado et al., 2013). En la naturaleza existe una gran diversidad bacteriana y se estima que un 99% de las bacterias producen cuando menos una bacteriocina (Dolz, 2008). Las características generales de las bacteriocinas se en- cuentran resumidas en la Tabla I.

Las bacteriocinas de las BAL contienen residuos de aminoácidos tales como lisina, arginina e histidina, los cuales les confieren un carácter catiónico (pH neutro), y también contienen residuos de alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, metionina, fenilalanina y triptófano, lo que les proporciona su naturaleza hidrofóbica; además, las bacteriocinas también son de carácter anfipático (Diep y Nes, 2002; Yusuf, 2013). Las bacteriocinas han sido agrupadas en cinco clases (Tabla II) según varios criterios de clasificación, como por ejemplo: microorganismos productores, pesos moleculares, propiedades físicas, estructuras químicas, modo de acción, y características genéticas y bioquímicas (Nes et al., 2007; Monroy et al., 2009; Balciunas et al., 2013).

La clase I o lantibióticos son péptidos de muy bajo peso molecular (<5kDa), resistentes a altas temperaturas y con aminoácidos no comunes en su estructura, tales como lantionina, metillantionina, dehidroxilamina y dehidrobutirina.

TABLA I
CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LAS BACTERIOCINAS

TABLA II
CLASIFICACIÓN LAS BACTERIOCINAS

Los lantibióticos pueden encontrarse en forma lineal (tipo A), como en el caso de la nisina, o de forma globular (tipo B), como el caso de la mersacidina.

La clase II son péptidos pequeños termoestables (<10kDa) sin aminoácidos modificados en su estructura. La clase II ha sido dividida en cinco subclases (IIa, IIb, IIc, IId y IIe). La subclase IIa, son bacteriocinas que actúan fuertemente contra Listeria, siendo la pediocina PA-1 la más representativa; la subclase IIb son bacteriocinas formadas por dos péptidos, como la plantaricina EF; en la subclase IIc se encuentran las bacteriocinas que no comparten homología con ninguna otra bacteriocina, por ejemplo lactococcina A; en la clase IId, se encuentran péptidos lineales como la lacticina Q; y en la clase IIe se encuentran las bacteriocinas que se formaron por la degradación específica de proteínas más grandes.

La clase III son péptidos termolábiles de alto peso molecular (>30 kDa), siendo la helveticina la bacteriocina representativa. La clase IV son péptidos grandes y de estructura compleja, ya que se encuentran asociados a carbohidratos (glicoproteínas) o lípidos (lipoproteínas), siendo la lactocina S una de las bacteriocinas de esta clase. Por último, en la clase V se encuentran los péptidos con una estructura circular que no posee modificaciones post traduccionales, siendo la enterocina AS-48 un ejemplo de esta clase (Nes et al., 2007; Monroy et al., 2009; Zacharof y Lovitt, 2012; Balciunas et al., 2013).

La mayoría de las bacteriocinas de las BAL inhiben el crecimiento de las bacterias mediante la formación de poros en la membrana celular, lo cual se inicia con la atracción de las bacteriocinas hacia la bacteria diana a través de fuerzas electrostáticas, debido a que las bacterciocinas están cargadas positivamente e interactúan con los fosfolípidos de la membrana de las bacterias que se encuentran cargadas negativamente. Además, la naturaleza anfipática de las bacteriocinas facilita aún más su distribución a lo largo de la superficie de la membrana celular de la bacteria (Cotter et al., 2005; Nishie et al., 2012; Yusuf, 2013).

La unión de bacteriocinas con bacterias diana se da entre la región N-terminal de la bacteriocina (región hidrofílica) con la superficie polar de la membrana celular. Una vez unida la bacteriocina a la bacteria, la región C-terminal (región hidrofóbica) penetra hacia el interior no polar de la membrana celular, lo que resulta en la formación de poros en la membrana y como consecuencia se produce un vaciamiento intracelular, generando la pérdida de iones K, de energía en forma de ATP y en algunos casos, de aminoácidos y moléculas de bajo peso molecular (Bemena et al., 2014).

Las consecuencias de lo anterior se traducen en la disminución del potencial de membrana y en la escasa disponibilidad de las reservas energéticas de la célula, lo que conlleva a la disminución de la síntesis de ADN, ARN y proteínas, que finalmente desencadena la muerte de la célula (Vásquez et al., 2009; Yusuf, 2013; Bemena et al., 2014). Algunas bacteriocinas de clase I, como la nisina, han demostrado tener un modo de acción dual, ya que pueden formar poros en la membrana celular uniéndose a ella y atravesándola (por su carácter anfipático) y/o por unirse al lípido II (principal transportador de las subunidades de péptidoglicano) evitando la formación de la pared celular (López et al., 2008; Perez et al., 2014). La naturaleza anfipática de las bacteriocinas de clase II facilita la inserción del péptido en la membrana de la bacteria diana, provocando su despolarización y con ello la muerte (Drider et al., 2006; Yusuf, 2013). Las bacteriocinas de clase III, como la lisostafina, pueden actuar directamente en la pared celular de las bacterias diana Gram positivas, conduciendo a la lisis de la bacteria (Lai et al., 2002; Cotter et al., 2005).

En la actualidad, nisina y pediocina PA-1 (producida por fermentación con Pediococcus acidilactici) son las bacteriocinas más utilizadas en la industria de alimentos con fines de conservación. La nisina fue la primera en ser comercializada y sus efectos antimicrobianos son los más documentados (Tabla III), resaltando su capacidad para disminuir el conteo de Staphylococcus aureus en queso fresco Minas sin afectar las propiedades fisicoquímicas y características sensoriales (Sobrino- López y Martín-Belloso, 2008; Pinto et al., 2011; Favaro et al., 2015; Felicio et al., 2015). En queso fresco Hispánico, la combinación de ácido caprílico con nisina y cinamaldehído controló a Listeria monocytogenes y presentó bajo impacto en la flora natural del queso (Gadotti et al., 2014).

El contenido de grasa en el queso podría afectar negativamente la actividad antimicrobiana de la nisina debido a su naturaleza anfipática, que favorece su interacción con los lípidos; sin embargo, el NaCl podría incrementar su actividad (Chollet et al., 2008). Tomando en cuenta lo anterior, algunos estudios se han enfocado al desarrollo de estrategias que permitan aumentar la actividad de las bacteriocinas. Por ejemplo, la nisina Z y nisina encapsuladas en forma de liposomas fueron eficientes para inhibir el crecimiento de Listeria innocua . Listeria monocytogenes en queso Cheddar y queso fresco Minas, respectivamente (Benech et al., 2002; Malheiros et al., 2012).

TABLA III
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE BACTERIOCINAS EN QUESOS

Por otro lado, otras estrategias se basan en el uso de películas poliméricas y de caseinato de sodio adicionadas con enterocina y nisina en queso fres-co Cottage, inhibiendo a Listeria monocytogenes . L. innocua (Iseppi et al., 2008; Cao-Hoang et al., 2010). Otro estudio mostró que el tratamiento con calor más la adición de nisina presentó un efecto sinérgico contra L. innocua, logrando eliminarla por completo después de seis días de almacenamiento (Al-Holy et al., 2012), mientras que el tratamiento con alta presión hidrostática aplicado en quesos para la inactivación de esporas de Bacillus cereus fue más eficiente cuando se incluyó nisina como agente antimicrobiano (Lopez- Pedemonte et al., 2003).

La actividad antimicrobiana de la nisina también fue probada en suero de queso (Tabla IV). Se ha reportado que la adición de nisina en la elaboración del queso Feta redujo el conteo de Listeria monocytogenes, modificando la flora microbiana normal del suero (Samelis et al., 2003). También se ha reportado que la aplicación de bajas temperaturas, campo eléctrico pulsado y la aplicación de MicroGARDTM (cultivo láctico pasteurizado como bioprotector natural) favoreció la acción antimicrobiana de la nisina contra Listeria innocua en suero de queso (Gallo et al., 2007a, b; von Staszewski y Jagus, 2008).

Actividad antimicrobiana de BAL productoras de bacteriocinas in situ en quesos

La capacidad antimicrobiana de las BAL productoras de bacteriocinas en la conservación de quesos es un tema que en la actualidad ha tomado mayor importancia (Tabla V), debido a las ventajas tecnológicas que brindan al producto final (Parra Huertas, 2010). La capacidad antimicrobiana de las BAL productoras de bacteriocinas en la conservación de quesos es un tema que en la actualidad ha tomado mayor importancia (Sobrino-López y Martín-Belloso, 2008; Favaro et al., 2015). Algunos estudios han reportado que la utilización de BAL productoras de bacteriocinas han sido eficientes para disminuir los niveles de Listeria innocua . L. monocytogenes en en queso Manchego, queso madurado, Fresco y Cottage (Rodriguez et al., 1998; O’Sullivan et al., 2006; Dal Bello et al., 2012; Vera Pingitore et al., 2012).

Se ha reportado que BAL productoras de bacteriocinas pueden disminuir la concentración de diversas especies del género Clostridium, como es el caso de C. tyrobutyricum . C. beijerinckiiI NIA 63 en quesos y otras esporas de especies de Clostridium en queso Vidiago, semiduro, Kasseri y de oveja (Rilla et al., 2003; Bogovič Matijašić et al., 2007; Anastasiou et al., 2009; Martínez-Cuesta et al., 2010; Garde et al., 2011). También se ha señalado que aunque las BAL sean productoras de bacteriocinas in vitro, esto no garantiza su actividad durante el proceso de elaboración de quesos, debido a que las bacteriocinas pueden interactuar con la grasa, perdiendo su actividad, o pueden inactivarse por proteasas presentes (Nuñez et al., 1997; Hamama et al., 2002; Sarantinopoulos et al., 2002; Vesković et al., 2014 ).

Otros estudios se enfocaron en combinar tratamientos antimicrobianos con las BAL productoras de bacteriocinas para mejorar la actividad antimicrobiana. Aly et al. (2012) reportaron que la aplicación de Lactococcus lactis subsp. lactis, productora de nisina Z, mejoró la actividad antimicrobiana en queso cuando fue combinada con gelatina obtenida de piel de bovino. Arqués et al. (2005) demostraron que el efecto combinado de altas presiones y diferentes BAL productoras de bacteriocinas (nisina A, nisina Z, lacticina 481, TAB 57, TAB 7, enterocina I, enterocina AS-48) disminuyeron el conteo de Listeria monocytogenes en queso. Por otro lado, se ha reportado que Lactobacillus sakei subsp. sakei 2a fue combinado con inulina como fuente de fibra y se pudo obsevar la disminución de las cuentas de L. monocytogenes. Lo anterior indica que las BAL productoras de bacteriocinas también son eficientes en los quesos mediante el uso de simbióticos. Así mismo, se menciona que esta bacteria expresó los genes sakP y sakQ responsables de la síntesis de bacteriocinas en el queso (Martínez et al., 2015).

Otra opción que se ha considerado es la aplicación de BAL multiproductoras de bacteriocinas. Se ha reportado que la actividad antimicrobiana de la nisina en combinación con pediocina incrementa su actividad en contra Listeria monocytogenes (Rodrıǵuez et al., 2005). Izquierdo et al. (2009) utilizaron a Enterococcus faecium WHE 81 multiproductora de bacteriocinas en la superficie de queso Munster contaminado con Listeria monocytogenes y reportaron que esta cepa erradicó casi por completo al patógeno. Estos mismos autores sugieren que una BAL multiproductora de bacteriocinas es más eficiente contra la resistencia desarrollada por el patógeno en comparación con las que producen una sola; además, el efecto sinérgico entre bacteriocinas puede favorecer la actividad antimicrobiana. Sin embargo, se ha reportado que Lactococcus lactis CL2, productora de nisina y pediocina, disminuyó el conteo de Listeria monocytogenes, Escherichiacoli . Staphylococcus aureus en queso, aunque su inhibición no fue mejor que una BAL productora solo de nisina, por lo que los autores sugirieron que en el queso no se presentó un efecto sinérgico entre ambas bacteriocinas (Rodrıǵuez et al., 2005).

TABLA IV
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE BACTERIOCINAS DE BAL EN SUERO DE QUESO

* Microorganismo indicador. L: Listeria.

TABLA V
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE BAL PRODUCTORAS DE BACTERIOCINAS EN QUESOS

* Microorganismo indicador. Lc: Lactococcus, Lb: Lactobacillus, Ent: Enterococcus, Cl: Clostridium, L: Listeria, E: Escherichia, S: Staphylococcus, Lb: Lactobacillus, St: Streptococcus.

Por otro lado, el uso de BAL productoras de bacteriocinas genética mente modificadas también ha sido explorado. Buyong et al. (1998) insertaron el gen que codificaba para pediocina PA-1 a Lactococcus lactis subsp. lactis MM217 y observaron que la concentración de Listeria monocytogenes disminuyó significativamente en queso Cheddar, con lo que concluyeron que el uso de estos microorganismos podría ayudar a disminuir los tratamientos químicos como control microbiológico. En otro estudio, McAuliffe et al. (1999) utilizaron a Lactococcus lactis DPC4275 transconjugante, productor de lacticina 2147, consiguiendo inhibir el crecimiento de L. monocytogenesen un 99,9% en queso Cottage. Así mismo, Rodrıǵuez et al.(2005) reportaron que las cepas transformadas de Lactococcus lactis CL1, productora de pediocina, y Lactococcus lactis CL2, productora de nisina y pediocina, disminuyeron el conteo de L. monocytogenes, Escherichia coli . Staphylococcus aureus en queso.

Debido a que las bacteriocinas tienen un gran potencial para la industria alimentaria como antimicrobianos naturales, se han realizado diferentes estudios donde se buscan nuevas bacteriocinas, o se combinan las ya conocidas, elucidándose en combinación o no con otros antimicrobianos naturales, tratamientos físicos y químicos, para lograr incrementar su actividad antimicrobiana contra diferentes patógenos. A pesar de esto, solamente una bacteriocina (nisina) es reconocida como GRAS, por lo que se debe seguir realizando estudios donde se evalué la toxicidad de las bacteriocinas en modelos animales para que éstas puedan probar su seguridad. La producción de bacteriocinas in situ podría ser la forma más viable y prometedora para la elaboración de quesos con leche cruda, donde se pueden utilizar BAL productoras de bacteriocinas como cultivo iniciador. Por lo anterior- mente expuesto, será necesario realizar estudios in vitro para evaluar la efectividad de las bacteriocinas durante el procesamiento y almacenamiento del queso.