Introducción

La contaminación del agua, aire y suelo por metales pesa-dos es uno de los problemas ambientales más graves pro-vocados por el hombre (Blais et al., 2007). Las fuentes más comunes de contaminación por dichos metales son los procesos industriales, los ver-tidos municipales y la minería (Muñoz y Becker, 1999). En Chile, como consecuencia del desarrollo minero en el norte y el desarrollo industrial en la zona central, se registra una creciente y preocupante conta-minación ambiental en los ecosistemas costeros por las altas concentraciones de meta-les que afecta desde el sub-suelo hasta la atmósfera, incluyendo suelos y cuerpos de agua (Salamanca et al., 2004). En estas zonas del país se concentran muchas colo-nias de pingüinos de Humboldt, las cuales se ven afectadas por estas activida-des antropogénicas (Celis et al., 2014). El pingüino de Humboldt (Spheniscus hum-boldti) es una especie de ave marina que habita el litoral de las costas del Perú y de Chile; se alimenta en el mar en base a una dieta constitui-da principalmente de peces, complementado con calamares y crustáceos (Martínez y González, 2004). Muchos me-tales pesados son incorpora-dos al organismo a través de la dieta, y una gran parte de ellos son excretados por el pingüino una vez que está en tierra (Celis et al., 2014).La presencia de metales pe-sados en el ambiente puede modificar la f lora microbiana que allí habita, dependiendo de la concentración de estos elementos químicos (Montuelle et al., 1994). Existe evidencia que indica que la contamina-ción con metales pesados pue-de favorecer la resistencia bac-teriana tanto en ambientes marinos como terrestres (Baker-Austin et al., 2006) y que algunos organismos pue-den ser portadores de genes resistentes a los antibióticos (Singer et al., 2006). La resis-tencia a metales pesados en poblaciones bacterianas puede considerase como un fenóme-no ambiental de selección na-tural para la supervivencia de las especies, lo que podría alterar la biota bacteriana au-tóctona de los ecosistemas (Pathak y Gopa, 2005; Baker-Austin et al., 2006). Se ha visto que bacterias nativas del género Pseudomonas que ha-bitan en suelos de ambientes mineros presentan resistencia a metales pesados tales como Cd, Cu y Pb (Monge-Amaya et al., 2008). De este modo, la contaminación de los ecosiste-mas costeros puede tener re-percusiones que van más allá de afectar a la población del pingüino de Humboldt, pues la exposición de bacterias au-tóctonas a altas concentracio-nes de metales pesados podría significar la aparición de ce-pas resistentes, cuyas conscuencias pueden ser graves para el ambiente (Nies, 2003). A nivel mundial se estima que sobre el 70% de las enferme­dades infecciosas emergentes tienen su origen en la fauna silvestre, y además de aumen­tar significativamente con el tiempo, la mayoría de los pató­genos que las provocan presen­tan resistencia a antibióticos (Jones et al., 2008). Esto impli­ca que muchos lugares donde viven especies silvestres po­drían estar experimentando los mismos problemas.

La influencia antrópica juega un papel importante en la con­taminación de los ecosistemas marinos y terrestres, lo que se ha visto reflejado por la cerca­nía de las infraestructuras o de núcleos urbanos a los nichos silvestres (Salamanca et al., 2004; Celis et al., 2014). La contaminación por metales pe­sados sobre la flora microbiana no ha sido cabalmente estudia­da en fauna de zonas costeras de Chile (Moraga et al., 2003). La exposición a altas concen­traciones de metales pesados podría estar influyendo en la susceptibilidad de las bacterias gastrointestinales de espe-cies como el pingüino de Humboldt. Más aún, ciertos estudios han mostrado que la contaminación con metales en ambientes naturales podría te­ner un importante rol en la proliferación de la resistencia a antibióticos usados en humanos y en animales (Alonso et al., 2001; Summers, 2002; Rose et al., 2009). Esto ha motivado la realización de algunos estu­dios sobre susceptibilidad a metales pesados en bacterias que habitan en los ecosistemas costeros de Chile (Mondaca et al., 1993; Moraga et al., 2003). Sin embargo, estos estu­dios se han realizado sobre la base de matrices abióticas y no sobre matrices bióticas como las excretas, donde las bacte­rias gastrointestinales de espe­cie silvestres que habitan los ecosistemas costeros podrían tener importancia. No se sabe si la contaminación por meta­les pesados tiene incidencia sobre la f lora microbiana de estas aves marinas en relación a los hábitats a los que estas especies están vinculadas. En este estudio, se pretende 1) de­terminar si existe resistencia a metales como Cd, As, Pb, Cu y Zn en bacterias presentes en excretas de colonias de pingüi­nos de Humboldt que anidan en tres lugares de la costa chi­lena, y 2) investigar si dichos metales tienen efecto sobre la resistencia bacteriana a algunos de los antibióticos usados en humanos y en veterinaria.

Metodología

Recolección de muestras

Los muestreos se llevaron a cabo entre diciembre 2011 y enero 2012 desde tres lugares del litoral chileno donde habitualmente anidan estas aves (Figura 1): Isla Pan de Azúcar (26º09’S, 70º40’O), Isla Chañaral (29º01’S, 71º34’O) e Isla Cachagua (32º35’S, 71º27’O). Se recolectaron 20 muestras frescas de excretas (~5g cada una) de pingüinos de Humboldt, correspondientes a un grupo de animales de la colonia y no de un individuo en particular, desde los sitios de anidamiento en cada colo­nia. Para ello, se utilizaron guantes de látex, espátulas de plástico y bolsas de polietileno Ziploc. Cada muestra se alma­cenó en un contenedor con hielo (~4ºC) hasta su llegada a laboratorio.

La isla Pan de Azúcar es una isla de forma ovalada (1,5×1km) ubicada en el norte de Chile, a 1km de la costa y a 18km de la bahía de Chañaral, lugar donde desechos de la minería fueron vertidos en gran cantidad entre 1938 y 1974 (Vermeer y Castilla, 1991); allí existe una importan­te población de pingüinos de Humboldt, con ~5000 indivi­duos. Por su parte, la Isla Chañaral es una isla circular (2km de diámetro) situada a 7km de la costa y a 100km al norte de la bahía de Coquimbo; constituye una de las más grandes colonias de pingüinos de Humboldt en el norte de Chile, con una pobla­ción estimada de 22000 indivi­duos. Por su parte, Isla Cachagua está ubicada en la zona central de Chile, y es una pequeña área (250×200m) si­tuada a 100m de la costa y a 20km de la Bahía de Quintero, un área altamente industrializa­da; a pesar del pequeño tama­ño de la isla, Cachagua consti­tuye un lugar de anidación importante para los pingüinos de Humboldt, soportando una población de ~2000 individuos (Meza et al., 1998).

Determinación de la resistencia a metales pesados y antibióticos

Las muestras de excretas fue­ron pesadas para estandarizar una cantidad fija (5g de peso seco) sobre la cual se trabajó en los análisis. A partir de cada muestra, 1g fueron sembrados por esparcimiento superficial en placas de Petri con agar R2A y agar ENDO-C (Merck®), las cuales se incubaron por cinco días a temperatura ambiente (20ºC). Las colonias desarrolla­das se caracterizaron de acuer­do a su morfología y las colo­nias seleccionadas se traspasa­ron a placas de agar PCA (Merck®) enriquecido con 800μg·ml-1 de CuSO4 (Moraga et al., 2003). La identificación bacteriana a partir de las colo-nias aisladas se basó en estu­dios de morfología microscópi­ca con tinción Gram y en pro­piedades bioquímicas. Para la tipificación de las especies identificadas se utilizó un sis­tema estandarizado de identifi­cación bacteriana (API).

La resistencia a As, Cd, Cu, Pb y Zn se determinó utilizan-do las siguientes soluciones (Merck®): N2AsO4H·7H2O, CdCl2, CuSO4, Pb(NO3)2 y ZnCl2 (Moraga et al., 2003). Para Zn las concentraciones ensayadas fueron 3200, 1600, 800, 400 y 200μg·ml-1, para As, Cu y Pb fueron 1600, 800, 400, 200 y 100μg·ml-1, mien­tras que para Cd los niveles testeados fueron 400, 200, 100, 50 y 25μg·ml-1 (Mondaca et al., 1993). La resistencia bacteriana se determinó a tra­vés de la concentración míni­ma inhibitoria (CMI) para es­tos metales (Anisimova et al., 1993). Los ensayos se realiza­ron en agar PCA suplementa­do con el metal. Las placas se sembraron con un replica­dor Steel y fueron incubadas por 48h.

La resistencia a antibióticos se estudió mediante la técnica de difusión en placa, en base a las definiciones dadas por el EuropeanCommittee on Anti-microbial Susceptibility Testing (Matuschek et al., 2013). Se utilizaron los siguientes anti­bióticos (Merck®): oxitetracicli­na (30μg·ml-1), penicilina (10μg·ml-1), gentamicina (10μg· ml-1), f lorfenicol (30μg·ml-1), amoxicilina (20μg· ml-1), sulfa­trimet (25μg·ml-1) y cefapirina (30μg·ml-1). Las cepas fueron reactivadas desde partidas con­geladas, cultivadas en placa por triplicado y chequeadas para ver crecimiento bacteriano después de 24, 48 y 72h. Se utilizaron tres repeticiones en cada caso. Los resultados se registraron como sensible o resistente; no se consideró el crecimiento intermedio.

Resultados

Del análisis de las muestras de excretas obtenidas de las diferentes colonias de pingüi­nos de Humboldt, se logró identificar diferentes cepas bacterianas (Tabla I). Las bac­terias Gram negativas tales como Brevundimonas, Erwinia, Chryseobacterium, Weeksella, Pseudomonas . Mannheimia presentaron resistencia a peni­cilina, así cono también Ente-rococcus durans, una bacteria Gram positiva. Por su parte, Erwinia y Pseudonoma presen­taron resistencia a sulfatrimet y penicilina.

En las pruebas de susceptibi­lidad a metales, los valores de la concentración mínima inhi­bitoria (CMI) mostraron que el metal más tóxico (con menor CMI) para todas las cepas ais­ladas resultó ser el Cd, seguido por el Cu (Tabla II). Se encon­tró que todas las cepas bacte­rianas aisladas en las excretas del pingüino de Humboldt de las tres localidades estudiadas fueron resistentes al Zn; en cambio, todas las bacterias ais­ladas de Isla Chañaral no mos­traron ninguna resistencia al Cu, siendo este lugar el más alejado de la costa. Todas las bacterias aisladas de Isla Cachagua y la mayoría de las bacterias de Isla Pan de Azúcar (exceptuando C. indo­genes . M. luteus) mostraron resistencia al Pb, mientras que por el contrario las cepas bac­terianas de Isla Chañaral no mostraron ninguna resistencia a este metal. Por su parte, E. durans, E. faecium, Pseudo-monas spp. y B. vesicularis aisladas de las excretas obteni­das de Isla Cachagua mostra­ron resistencia al Cd. Por otra parte, solo M. haemolytica. Pseudomonas spp. de Isla Pan de Azúcar mostraron resisten­cia al Cd. La mayoría de las cepas de Isla Cachagua e Isla Pan de Azúcar fueron resisten­tes al As, pero no así las aisla­das de Isla Chañaral. Se notó que las cepas resistentes pre­sentaron simultáneamente resis­tencia a dos o más metales, particularmente en aquellas cepas aisladas de Isla Cacha-gua (Figura 2). Se observó una mayor resistencia al As, Cu y Pb en las cepas bacte-rianas aisladas de las excretas de pingüinos de Humboldt en Isla Cachagua, lo que coincide con las mayores concentracio­nes de estos metales en las excretas recolectadas desde este lugar (Tabla III).

Discusión

No se encontraron estudios similares de susceptibilidad bacteriana a metales pesados en excretas de pingüinos. Más aún, poco se conoce acerca del impacto de la contaminación con metales sobre las pobla-ciones bacterianas en áreas donde habita el pingüino de Humboldt. Los diferentes valo­res de CMI encontrados sugie­ren que las bacterias son capa­ces de codificar complejos me­canismos de resistencia antimi­crobiana, tales como enzimas hidrolíticas, bombas de flujo, mutaciones en porinas de membrana, biofilms y elemen­tos genéticos móviles (Girlich et al., 2007). Entre estos últi­mos están los plásmidos, los integrones, los transposones y elementos integrativos, los cuales pueden transmitirse en­tre especies bacterianas me­diante procesos de conjugación (Vargas et al., 2010). Cuando un elemento móvil porta simul­táneamente genes de resistencia a metales pesados y a algunos antibióticos, la presencia de metales pesados en el entorno claramente favorece la selec­ción de dichos elementos gené­ticos en las poblaciones bacte­rianas (Mondaca et al., 1993; Ahmed et al., 2007). El pre­sente estudio revela que existen bacterias gastrointestinales del pingüino de Humboldt resisten­tes a algunos de los metales pesados estudiados. Moraga et al. (2003) mostraron que bacterias del género Pseu-domonas aisladas en muestras de agua de la bahía de Iquique (760km al norte de Isla Pan de Azúcar), con una gran activi­dad industrial en su borde cos­tero y cuyas industrias descar­gan sus residuos líquidos en ella, son resistentes a Pb, As y Cu, y a cefataxima, amikacina, nitrofurantoina y ampicilina. En el presente estudio, la ma-yoría de las bacterias aisladas mostraron resistencia a As, Cu, Pb y Zn. Todas las bacterias Gram negativas aisladas pre­sentaron resistencia a penicili­na y algunas a sulfatrimet. En general, las bacterias Gram negativas tales como Chryseo-bacterium y Pseudomonas, pre­sentan resistencia innata a mu­chos antibióticos (Poole, 2005; Sakurada, 2008), pero no ob­servamos ninguna resistencia a oxitetraciclina, gentamicina, florfenicol, amoxicilina, sulfa­trimet o cefapirina.

Las mayores resistencias a Pb, Cu y As fueron observadas en isla Cachagua, la que a di­ferencia de las otras dos islas estudiadas es la que se encuen­tra más cercana al litoral y que está más afectada por activida­des antropogénicas. Existen estudios que han establecido que la resistencia bacteriana a metales en ecosistemas muy contaminados está asociada a la resistencia a antibióticos (Baker-Austin et al., 2006), como es el caso de la resisten­cia bacteriana al Hg (Summers et al., 1993) y la resistencia de enterobacterias a la tetraciclina, aún a concentraciones sub-leta­les de As, Cu y Zn (Chen et al., 2015). Por otro lado, la presencia de metales pesados en las excretas de aves árticas pue­de inducir cierta resistencia en bacterias que viven en ambien­tes terrestres (Sjölund et al., 2008). Los trabajos llevados a cabo en suelos muy contamina­dos por la minería indican que ciertas bacterias nativas en suelos contaminados pueden desarrollar resistencia a Hg y otros metales pesados, así como también a cloranfenicol, ampicilina, tetraciclina, estrep­tomicina y kanamicina (Rojas et al., 2014). Se ha encontrado que existe una amplia resisten­cia a Hg, Cu, Pb, Ni, Zn y antibióticos en bacterias que viven inmediatamente bajo la superficie de suelos contamina­dos (Diptendu y Goutam, 2013). No obstante, y dado que los pingüinos se alimentan en el mar, pueden transportar los metales pesados que ingieren a través de la dieta a los sitios de anidación en tierra, actuan­do como biovectores de conta­minación (Blais et al., 2007). Es allí donde estos contami­nantes se concentran, pudiendo aumentar la resistencia de cier­tas comunidades bacterianas nativas de estos lugares terres­tres. Las excretas son un sus­trato ideal para el crecimiento microbiológico y constituyen un medio favorable para que las bacterias estén metabólica­mente activas.

B. vesicularis es resistente a sulfametoxazol, trimetropina y ceftazidima (Zhang et al., 2012) y también se ha reporta­do resistencia a vancomicina por parte de bacterias del gé­nero Enterococcus (Cetinkaya et al., 2000). En aves, se ha encontrado que cepas de Pseudomas aisladas de la cloa­ca del perico bronceado (Brotogerisjugularis) y de co­torra (Aratingapertinax) son resistentes a trimetoprim-sulfa­metoxazol, cefotaxima y ampi­cilina (Vargas et al., 2010). Un gran número de bacilos no en­téricos Gram negativos, como Pseudomonas, aislados de la cloaca de gaviota argéntea (Larus argentatus) han mostra­do resistencia a amikacina, ampicilina, aumentina, carbeni­cilina, celtiofur, tetraciclina, ticarcilina y tribrissen (Rose et al., 2009). Otro estudio en­contró que M. haemolytica es altamente resistente a penicili­na y también a f lorfenicol (Pijoan y Aguilar, 2000). La administración de antibióticos de uso veterinario, como flor­fenicol, celtiofur o tribrissen, puede inducir la selección de bacterias resistentes a los anti­bióticos en la población ani­mal, que después puede exten-derse a los humanos a través de la cadena alimentaria. La fauna silvestre no se encuentra aislada de la cadena alimenta­ria y por ende muchos de los problemas en ganadería y clíni­ca humana se están observando en estos animales (Van der Bogaard y Stobbering, 2000).

La resistencia a uno o a va­rios antibióticos en las bacte­rias aisladas en animales sil­vestres es un factor de riesgo para su salud (Vargas et al., 2010). Adicionalmente, el uso de antimicrobianos en la pobla­ción humana y animal resulta en la liberación de residuos que portan tanto antibióticos como bacterias resistentes a ellos en los ambientes terres­tres y marinos (Silbergeld et al., 2008). En nuestro estu­dio es interesante notar que la mayor resistencia bacteriana se manifestó en los lugares donde hubo mayor concentración con metales pesados, lo que refuer­za lo establecido por Montuelle et al. (1994), quienes indican que la resistencia de la flora microbiana depende de la con­centración de estos elementos químicos en el ambiente. La Isla Cachagua está ubicada en una zona altamente industriali­zada y con asentamientos hu­manos, mientras que Isla Chañaral está alejada de las actividades humanas (Celis et al., 2014). La liberación de As, Cu y Pb al ambiente es el resultado de diferentes activi­dades antropogénicas, y su presencia en el aire, agua y suelo se debe al uso de com­bustibles fósiles, a las fundi­ciones, al uso de pesticidas y fármacos, a las pinturas y a las maderas impregnadas que se usan en las viviendas (Duruibe et al., 2007).

Existe evidencia de que las bacterias resistentes a antibióti­cos y metales viajan grandes distancias. En ambientes remo­tos, como el Ártico, se ha en­contrado resistencia bacteriana a Hg, Cd, Pb, Cu y Zn, en se­dimentos y agua, con una co­rrelación positiva entre metales y antibióticos (Neethu et al., 2015). Otro estudio encontró que bacterias aisladas de excre­tas de aves árticas presentaron resistencia a ampicilina, trime-tropina, sulfametoxazol, cloran­fenicol y tetraciclina (Sjölund et al., 2008). En el norte y zona central de Chile, muchos de los vertidos al mar son aguas residuales industriales que pueden contener metales pesados (Salamanca et al., 2004) y efluentes urbanos que pueden tener metales y com­puestos farmacológicos (mu­chos de ellos conteniendo Hg) debido al aumento del consu­mo por la población humana y el uso en animales (Jones et al., 2005; Heberer, 2002). En el litoral del norte y centro de Chile las corrientes oceánicas pueden movilizar los metales a grandes distancias (Celis et al., 2014) y podrían llegar hacia los sitios de anidación de los pingüinos de Humboldt si las condiciones climáticas cambia­ran, razón por la cual es preci­so contar con un monitoreo continuo. La resistencia bacte­riana en ecosistemas marinos y terrestres contaminados con metales como Hg, Cu, Pb, Ni y Zn (Rojas et al., 2014; Ball et al., 2007) significaría que la exposición microbiana a tales metales pesados podría resultar en una selección indirecta de bacterias con resistencia a múltiples antibióticos (Baker- Austin et al., 2006; Seiler y Berendonk, 2012). Puesto que los metales pesados son todos similares en sus mecanismos de toxicidad, la tolerancia a múltiples metales es un fe-nómeno común entre las bacte­rias resistentes a metales (Rajbanshi, 2008). De esta ma­nera, aunque en nuestro estu­dio no se pudo probar, la expo­sición a metales pesados podría estimular el desarrollo de ce­pas bacterianas nativas resis­tentes a antibióticos y vicever­sa si las condiciones cambiaran (Rojas et al., 2014). Debido al cambio climático, los sistemas biofísicos y ecológicos están siendo alterados, y como con­secuencia de ello se estima que habrá un aumento de las tem­peraturas en el norte y zona central de Chile (González et al., 2009). Se sabe que las mayores temperaturas promue­ven la transmisión de patóge­nos (Patz et al., 2005), lo cual implica que habrá una mayor presión sobre los ecosistemas terrestres y marinos del norte y centro del país. En esas condi­ciones, existe un escenario pro­picio para que muchas cepas nativas interactúen con las bac­terias gastrointestinales que ex­pulsa el pingüino de Humboldt cuando excreta en los lugares donde anida. El impacto que podrían tener las excretas de los pingüinos de Humboldt en los lugares donde estas aves anidan es un tema que requiere ser más investigado.

Conclusiones

Las cepas resistentes a me­tales pesados encontradas en este estudio podrían afectar los ciclos orgánicos e inorgá­nicos en los ambientes del li­toral septentrional y central de Chile. A pesar de que no se encontraron evidencias que indiquen que la resistencia bacteriana a metales en los lugares estudiados está fuerte­mente asociada a la resistencia a antibióticos, se notó cierta tendencia. En general, las ce­pas bacterianas aisladas de las excretas de pingüino presentan una mayor resistencia a meta­les pesados en los sectores que se encuentran más cerca­nos al litoral, los cuales pre­sentan los niveles más eleva­dos de metales pesados como consecuencia de las diferentes actividades antropogénicas. Esto permite localizar las zo­nas donde las actividades hu­manas impactan mayormente sobre estas especies de aves marinas, lo que sería un aporte para evaluar el grado de conta­minación debida a la actividad antropogénica y que podría estar afectando la fauna del li­toral y la salud humana, y ayu­dará a la toma de decisiones adecuadas que apunten a la reducción de las sustancias contaminantes en el ambiente.

Agradecimientos

Este estudio ha sido finan­ciado por la Vicerrectoría de Investigación de la Univer-sidad de Concepción, a través del proyecto 214.074.051-1.0. Los autores agradecen la cola­boración del personal de la Corporación Nacional Forestal (CONAF) y del Servicio Nacional de Pesca (SERNA-PESCA) para la obtención de los permisos para la toma de datos en terreno.

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Notas