Introducción

El cilantro (Coriandrum sativum L.), originario de países del Mediterráneo, se cultiva en regiones de clima templado de todo el mundo. Tiene importancia económica en la industria farmacéutica, cosmética y gastronómica, y presenta un alto valor cultu­ral en la medicina tradicional de muchos países (Coşkuner y Karababa, 2007; Mildner et al., 2009; Asgarpanah y Kazemivash, 2012). El cilan­tro se cultiva especialmente para la producción de semi­llas, de las que se extrae un aceite esencial compuesto principalmente de linalol (Msaada et al., 2007) cuya importancia radica en que es un agente fitoterapeútico con actividad antioxidante; anti­bacterial, antifúngica, anti­diabética, anticancerígena, antireumática, etc. (Wangens-teen et al., 2004; Zoubiri y Baaliouamer, 2010; Silva et al., 2011). México produce 46000t de cilantro al año, es el cuarto productor a nivel mundial y la producción se destina principalmente al consumo en fresco. El estado de Oaxaca participa con el 20% de la producción nacio­nal (SAGARPA, 2015). En la localidad de Ocotlán de Morelos, Oaxaca, la produc-ción de cilantro es primordial para la economía del 40% de las familias; sin embargo, una de las limitantes de la producción son los problemas fitosanitarios existentes. En 2012, en plantíos comerciales de cilantro, se observaron plantas de 30 días de edad con síntomas de marchitez y muer te prematura. En las raíces de las plantas enfer­mas se observó constricción, agrietamiento y pudrición del cuello de la raíz primaria, con áreas necróticas en el tejido interno; las raíces se­cundarias presentaron pudri­ción. En México, hasta el momento no se había precisa­do el agente causal de la en­fermedad. En el escenario mundial, estudios previos in­dicaron que la marchitez y muerte de las plantas de ci­lantro puede ser causada por Fusarium oxysporum en la India (Srivastava, 1972), Argentina (Gaetán et al., 1999) y EEU U (Koike y Gordon, 2005) o por Pythium ultimum en Italia (Garibaldi et al., 2010). Síntomas simi­lares han sido repor tados como inducidos por bacterias tales como Erwinia carotovo­ra en Brasil (Romeiro, 1994), Pseudomonas syringae pv. coriandricola en Alemania (Toben y Rudolph, 1996) y Xanthomonas campestris en Venezuela (Guevara y Maselli, 2005).

Las enfermedades del cilan­tro en Oaxaca se controlan con fungicidas selectivos, que si bien muestran eficacia contra los fitopatógenos, también tie­nen efectos adversos al medio ambiente y a la salud pública, ya que pueden inducir proble­mas carcinogénicos, teratogéni­cos y/o de toxicidad residual en el ser humano (Xiong et al., 2014), incrementar los costos de producción y resistencia in­ducida en los patógenos (Al- Haq et al., 2002). Por esta ra­zón, es importante encontrar alternativas sustentables, atóxi­cas, inocuas, biodegradables y de baja o nula residualidad en productos agrícolas para el control de las enfermedades. En años recientes, las propie­dades biológicas de los extrac­tos de plantas se ha puesto en auge y diversos estudios han sugerido la posibilidad de usar los aceites esenciales o mo-léculas específicas en la cien­cia de la fitopatología para el control de patógenos (Lo Cantore et al., 2004).

Los aceites esenciales vege­tales han mostrado propieda­des antibacterianas, antimicó­ticas, antiparasitarias, insecti­cidas y nematicidas (Bur t, 2004; Ponce et al., 2004; Kim et al., 2008). El aceite esencial de S. aromaticum inhibe el crecimiento micelial de Asper-gillus niger, Geotrichum can­didum (Verma et al., 2011), Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, Rhizoctonia sola­ni, Verticilllium dahliae (López et al., 2005) y Colle-totrichum sp. (Ranasinghe et al., 2002). El aceite de T. vulgaris impide el crecimiento de Botryodiplodia theobro-mae (Tripathi y Shukla, 2009), Colletotrichum acuta­tum (Alzate et al., 2009) y Fusarium spp. (Bar rera y García, 2008). El aceite esen­cial de O. vulgare controla el crecimiento de Botrytis cine­rea . Fusarium sp. (Daferera et al., 2003).

En este contexto, el uso de aceites esenciales o moléculas específicas puede ser una al­ternativa viable y prometedo­ra para el manejo de fitopató­genos. Los objetivos de este estudio fueron determinar la etiología de la muerte prema­tura del cilantro (Coriandrum sativum L.) en Oaxaca, México y evaluar el efecto de cuatro dosis (50, 100, 200 y 400μl·l-1) de los aceites esen­ciales de Bursera linanoe, Cymbopogon citratus, Larrea tridentata, Laurus nobilis, Mentha pulegium, Origanum vulgare, Syzygium aromati­cum . Thymus vulgaris sobre la inhibición (%) del creci­miento micelial in vitro del patógeno.

Materiales y Métodos

Área de estudio

El estudio se realizó en Ocotlán de Morelos (16º48’N, 96º40’O, a 1,523 msnm), loca­lidad ubicada en la región de los Valles Centrales del estado de Oaxaca, México.

Material vegetal

En campo se recolectaron 250 muestras de tejido interno de la raíz primaria de plantas de cilan­tro de 30 días de edad con sínto­mas de marchitez y muerte pre­matura. La recolección se llevó a cabo en un área de 0,5ha median­te un patrón de muestreo en ‘W’.

Aislamiento y purificación de hongos

Las muestras fueron lavadas con agua destilada estéril y desinfestadas con hipoclorito de sodio a 2,0% durante 5min. Se sembraron en medio de cul­tivo papa-dextrosa-agar (PDA; Bioxon® B ecton D ickinson d e México) con ácido láctico e incubaron a 22 ±3ºC con luz blanca durante 8 días. Las co­lonias desarrolladas se purifi­caron mediante la técnica de cultivo monospórico y se pre­servaron en tubos con PDA cubiertos con aceite mineral estéril.

Pruebas de patogenicidadPruebas de patogenicidad

El inóculo de los hongos experimentales se incrementó en sustrato estéril compuesto de 70% de suelo agrícola, 29% de arena y 1% harina de maíz. En 1,0kg de sustrato se colocaron 10 discos de 0,7cm de diámetro de medio de cul­tivo PDA con crecimiento mi­celial de 10 días de edad; el sustrato se incubó durante 45 días en oscuridad y humedad constante a una temperatura de 22 ±3ºC. La patogenicidad de los hongos se verificó en plantas sanas de cilantro de 30 días de edad cultivadas indivi­dualmente en bolsas de polie­tileno con 500g de suelo esté­ril. Alrededor de sistema radi­cular de cada planta se colocó 100g de inóculo; las plantas se mantuvieron a cielo abierto a temperatura ambiente (22 ±2ºC) y humedad constante durante 25 días.

Las plantas de cilantro ino­culadas con el aislado H1 se observaron marchitas en su totalidad a los 15 días después de la inoculación (ddi) y a 20 ddi la incidencia de plantas muertas fue de 100% (Figura 1). En la raíz principal hubo agrie­tamiento con tejido interno necrótico de donde se re-aisló la cepa H1. En el tratamiento donde las plantas fueron inocu­ladas con los aislados H2 y H3 la incidencia de plantas muer­tas, en ambos casos, fue de 20% a 20 ddi; sin embargo, no se observaron daños en la raíz principal. Las plantas inocula­das con las cepas H4, H5 y H6 no mostraron síntomas.

Figura 1. Pruebas de patogenicidad. a: plantas de cilantro inoculadas con Fusarium oxysporum a 20 ddi; la incidencia de plantas con muerte pre­matura fue de 100%; b: plantas testigo.

Tratamientos

Cada hongo evaluado se consideró un tratamiento, cada uno con 10 repeticiones. La unidad experimental fue una planta de cilantro.

Incidencia de la enfermedad

La incidencia de la enfer­medad por tratamiento se esti­mó con la ecuación: Ii= (Σni/ Ni) ×100; donde Ii: incidencia (%) de plantas enfermas en el momento i; ni: número de plantas enfermas en el mo­mento i; Ni: población total de plantas inoculadas en cada tratamiento. La evaluación se realizó a los 15 y 20 días des­pués de efectuada.

Caracterización morfométrica y molecular del patógeno

La caracterización morfomé­trica se realizó a partir de co­lonias puras cultivadas en PDA 2,0% a 25ºC y luz blanca constante por 10 días; siguien­do las claves para género de Barnett y Hunter (2006). La especie del patógeno se deter­minó de acuerdo a las claves de Nelson et al. (1983), Burgess et al. (1994) y Leslie y Summerell (2006). Se determi­nó el color de la colonia, las dimensiones de 100 macroconi­dios, 100 microconidios y 100 fiálides. La caracterización molecular se realizó con la metodología propuesta por Ahrens y Seemüller (1992). La amplificación de las regiones ITS1 e ITS2 de los genes ribo­somales se hizo por PCR con los iniciadores universales ITS5 (GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G) e ITS4 (TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC) (White et al., 1990) y se alinearon con la base de datos del banco de genes del National Center for Biotechno-logy Information (NCBI; www. ncbi.nlm.nih. gov). Las secuen­cias con el valor más alto de identidad se compararon con las de este estudio.

Efecto de aceites esenciales en la inhibición del crecimiento del patógenoEfecto de aceites esenciales en la inhibición del crecimiento del patógeno

Se evaluaron cuatro dosis (50, 100, 200 y 400μl·l-1) de cada uno de los siguientes aceites esenciales: clavo (S. aromaticum L.), tomillo (T. vulgaris L.), orégano (O. vulgare L.), té limón (C. ci­tratus DC. Stapf.), linaloe (B. linanoe (La Llave) Rze-dowski, Calderón y Medina), Laurel (L. nobilis L.), gober­nadora (L. tridentata (Sessé & Moc. ex DC.) Coville) y poleo (M. pulegium L.). Las plantas se secaron en la som­bra (22 ±2ºC) durante 20 días y se molieron. Los aceites se extrajeron por la técnica de hidrodestilación asistido por microondas en un aparato Clevenger. La fuente de ca­lentamiento fue un horno de microondas modificado (Sam-sung MW1235WB de 1,1pies3, 2450MHz, 1000W). El aceite esencial resultante se secó con sulfato de sodio anhidro y se almacenó en frascos co­lor ámbar a 4ºC (Granados et al., 2014).

Cada dosis de aceite se mez­cló en 1 litro de medio de cul­tivo PDA a 30ºC y se vació en cajas de Petri de 8,5cm de diá­metro. Sobre el medio de culti­vo se colocó un disco micelial de 0,7cm de diámetro y 10 días de edad. Las cajas se incuba­ron a 22 ±2ºC durante 10 días con luz natural.

La efectividad de los aceites se estimó mediante el paráme­tro porcentaje de inhibición del crecimiento micelial del patógeno in vitro con la fór­mula I= ((C-T)/C)x100, donde I: inhibición del crecimiento micelial expresada en porcen­taje, C: crecimiento micelial (diámetro en cm) del testigo, y T: crecimiento micelial (diá­metro en cm) del hongo trata­do con aceites esenciales (Vincent, 1947). Las medicio­nes se realizaron cada 24h durante 10 días.

El aceite esencial de S. aro­maticum . T. vulgaris, a partir de una dosis de 100 y 200μl·l-1, respectivamente, inhibieron en 100% el crecimiento micelial de F. oxysporum in vitro, mientras que el aceite de O. vulgare, a una dosis de 400μl·l-1 lo inhibió en 96% (Figura 3). Los aceites esenciales de C. citratus, B. li­nanoe, L. nobilis, L. tridentata . M. pulegium, a partir de la dosis de 400μl·l-1, inhibieron el crecimiento micelial en 46, 31, 28, 25 y 12%, respectivamente. Los porcentajes de inhibición están referidos al testigo absolu­to. En todos los casos, el testigo positivo (oxicloruro de cobre) inhibió en 100% el crecimiento de F. oxysporum. La efectividad de los aceites, estimada median­te el parámetro porcentaje de inhibición del crecimiento mice­lial in vitro del patógeno, se indica en la Tabla II.

Los aceites esenciales de especies vegetales contienen moléculas específicas que con­fieren propiedades antibacteria­nas y antifúngicas (Burt, 2004; López et al., 2005). Moléculas con este potencial son el euge­nol y acetato de eugenilo que se encuentran en el aceite de S. Aromaticum, mientras que el timol, carvacrol, α-terpineno y p-cymeno son moléculas del aceite de T. vulgaris . O. vul­gare (McGimpsey et al., 1994;Prudent et al., 1995; Sivro-poulou et al., 1996; Russo et al., 1998; Cosentino et al., 1999; Daferera et al., 2000). Se ha referido que el aceite de S. aromaticum tiene capacidad para inhibir el crecimiento de A. niger, G. candidum (Verma et al., 2011), F. oxysporum f. sp. lycopersici, R. solani . V. dahliae (López et al., 2005), mientras que el aceite de T. vulgaris . O. vulgare inhiben el crecimiento de F. oxyspo­rum, B. theobromae (Tripathi y Shukla, 2009), C. acutatum (Alzate et al., 2009) y Fusarium spp. (Barrera y García, 2008).

Una de las características importantes de los aceites esenciales es su hidrofobicidad. En bacterias, esta propiedad permite que las moléculas de los aceites interactúen con los lípidos de la membrana y mito­condrias celulares, confiriendo permeabilidad a la célula, lo que provoca un flujo continuo de iones intracelulares, altera­ción del citoplasma y coagula­ción del contenido celular (Sikkema et al., 1995). El ti­mol, carvacrol y eugenol pro­vocan permeabilidad, desinte­gración de la membrana celular e inhibición de producción de enzimas (Thoroski et al., 1988; Lambert et al., 2001).

De acuerdo a los resultados del presente estudio, la inhibi­ción del crecimiento micelial de Fusarium oxysporum, agen­te causal de la muerte prema­tura del cilantro en Oaxaca, México, se debió probablemen­te a la presencia de moléculas contenidas en aceites esenciales de S. aromaticum (eugenol y acetato de eugenilo) T. vulgaris . O. vulgare (timol, carvacrol, α-terpineno y p-cymeno). Estos resultados fueron satisfactorios en condiciones in vitro; ahora el reto será diseñar estrategias para que estos aceites interac­túen con el inóculo del patóge­no que se encuentra de forma sistémica dentro de las plantas de cilantro sintomáticas.

Diseño experimental

Se establecieron 32 trata­mientos resultantes de la inte­racción de ocho aceites esencia­les y cuatro dosis. Se incluyó un testigo absoluto y un testigo positivo donde el fitopatógeno se sembró en PDA sin aceite esencial y en PDA con 0,3g·l-1 oxicloruro de cobre, respectiva­mente. La efectividad de los aceites se evaluó con un diseño completamente al azar con arre­glo factorial AΧB; donde el factor A fueron los aceites esenciales (ocho) y el factor B fueron las dosis (cuatro) y dos testigos (testigo absoluto y testi­go positivo). Se utilizó la prue­ba de Tukey (SAS, 2002) para la comparación de medias entre tratamientos (α= 0,05).

Resultados y Discusión

Hongos aislados

A partir de 250 muestras de tejido de raíces de plantas de cilantro sintomáticas se obtu­vieron seis aislados fungosos diferentes que fueron etiqueta dos como H1, H2, H3, H4, H5 y H6. El aislado identificado como H1 se obtuvo con mayor frecuencia (Tabla I).

Pruebas de patogenicidad

Las plantas de cilantro ino­culadas con el aislado H1 se observaron marchitas en su totalidad a los 15 días después de la inoculación (ddi) y a 20 ddi la incidencia de plantas muertas fue de 100% (Figura 1). En la raíz principal hubo agrie­tamiento con tejido interno necrótico de donde se re-aisló la cepa H1. En el tratamiento donde las plantas fueron inocu­ladas con los aislados H2 y H3 la incidencia de plantas muer­tas, en ambos casos, fue de 20% a 20 ddi; sin embargo, no se observaron daños en la raíz principal. Las plantas inocula­das con las cepas H4, H5 y H6 no mostraron síntomas.

Caracterización morfométrica

Las colonias identificadas como H1, H2 y H3 en medio de cultivo PDA produjeron mi­celios de color blanco con una pigmentación rosa-violeta en la parte inferior del cultivo a los 15 días de edad (Figura 2a); microconidios amerosporas, ovales, hialinos, de 6,6-12,2 × 2,9-5,6μm; originándose en cabezas sobre monofiálides hialinas de 4,1-7,5μm de longi­tud; y macroconidios fragmos­poras, hialinos, en forma de media luna, con cinco septos en promedio, de 14,7-23,8 × 3,7-9,6μm, célula apical aguda y célula basal en forma de pie (Figura 2b). Las características morfométricas de estos aisla­mientos coinciden con las re­portadas por Nelson et al. (1983), Burgess et al. (1994), Leslie y Summerell (2006) para F. oxysporum.

Caracterización molecular

La caracterización molecular se realizó solamente para la colonia identificada como H1 debido a los resultados obteni­dos en las pruebas de patogeni­cidad. La secuencia genética del fragmento de ADN de la cepa H1 amplificado con los iniciadores universales ITS4 e ITS5 se homologó en 100% con F. oxysporum depositado en el banco de genes del NCBI con número de acceso HQ649816.1.

En este estudio se determinó que F. oxysporum es el agente causal de la marchitez y muer­te prematura del cilantro en el estado de Oaxaca, México. En estudios previos, Srivastava (1972), Gaetán et al. (1999) y Koike y Gordon (2005) consig­naron a este mismo hongo como el responsable de inducir marchitez y muerte prematura de las plantas de cilantro en la India, Argentina y EEUU, res­pectivamente. Se reportó que en plantíos de cilantro se ob­servaron áreas de ~1m2 con plantas marchitas con poco crecimiento, las raíces presen­taron pudrición de la corona con desprendimiento de corte­za; los tallos exhibieron áreas descoloridas con tonalidad roji­za a café, con secamiento pau­latino del follaje; finalmente las plantas murieron. Garibaldi et al. (2010) indicó que en Italia la enfermedad es causada por Pythium ultimum con sin­tomatología similar a la induci­da por F. oxysporum.

Efecto de aceites esenciales en la inhibición del crecimiento del patógeno

El aceite esencial de S. aro­maticum y T. vulgaris, a partir de una dosis de 100 y 200μl·l-1, respectivamente, inhibieron en 100% el crecimiento micelial de F. oxysporum in vitro, mientras que el aceite de O. vulgare, a una dosis de 400μl·l-1 lo inhibió en 96% (Figura 3). Los aceites esenciales de C. citratus, B. li­nanoe, L. nobilis, L. tridentata y M. pulegium, a partir de la dosis de 400μl·l-1, inhibieron el crecimiento micelial en 46, 31, 28, 25 y 12%, respectivamente. Los porcentajes de inhibición están referidos al testigo absolu­to. En todos los casos, el testigo positivo (oxicloruro de cobre) inhibió en 100% el crecimiento de F. oxysporum. La efectividad de los aceites, estimada median­te el parámetro porcentaje de inhibición del crecimiento mice­lial in vitro del patógeno, se indica en la Tabla II.

Los aceites esenciales de especies vegetales contienen moléculas específicas que con­fieren propiedades antibacteria­nas y antifúngicas (Burt, 2004; López et al., 2005). Moléculas con este potencial son el euge­nol y acetato de eugenilo que se encuentran en el aceite de S. Aromaticum, mientras que el timol, carvacrol, α-terpineno y p-cymeno son moléculas del aceite de T. vulgaris y O. vul­gare (McGimpsey et al., 1994; Prudent et al., 1995; Sivro-poulou et al., 1996; Russo et al., 1998; Cosentino et al., 1999; Daferera et al., 2000). Se ha referido que el aceite de S. aromaticum tiene capacidad para inhibir el crecimiento de A. niger, G. candidum (Verma et al., 2011), F. oxysporum f. sp. lycopersici, R. solani y V. dahliae (López et al., 2005), mientras que el aceite de T. vulgaris y O. vulgare inhiben el crecimiento de F. oxyspo­rum, B. theobromae (Tripathi y Shukla, 2009), C. acutatum (Alzate et al., 2009) y Fusarium spp. (Barrera y García, 2008).

Una de las características importantes de los aceites esenciales es su hidrofobicidad. En bacterias, esta propiedad permite que las moléculas de los aceites interactúen con los lípidos de la membrana y mito­condrias celulares, confiriendo permeabilidad a la célula, lo que provoca un flujo continuo de iones intracelulares, altera­ción del citoplasma y coagula­ción del contenido celular (Sikkema et al., 1995). El ti­mol, carvacrol y eugenol pro­vocan permeabilidad, desinte­gración de la membrana celular e inhibición de producción de enzimas (Thoroski et al., 1988; Lambert et al., 2001).

De acuerdo a los resultados del presente estudio, la inhibi­ción del crecimiento micelial de Fusarium oxysporum, agen­te causal de la muerte prema­tura del cilantro en Oaxaca, México, se debió probablemen­te a la presencia de moléculas contenidas en aceites esenciales de S. aromaticum (eugenol y acetato de eugenilo) T. vulgaris y O. vulgare (timol, carvacrol, α-terpineno y p-cymeno). Estos resultados fueron satisfactorios en condiciones in vitro; ahora el reto será diseñar estrategias para que estos aceites interac­túen con el inóculo del patóge­no que se encuentra de forma sistémica dentro de las plantas de cilantro sintomáticas.

Conclusiones

Se determinó que Fusarium oxysporum es el agente causal de la marchitez y muerte pre­matura del cilantro (Corian-drum sativum L.) en el estado de Oaxaca, México. Se consig­nó que los aceites esenciales de S. aromaticum . T. vulgaris inhibieron en 100% el creci­miento micelial de F. oxyspo­rum en condiciones in vitro a partir de una dosis de 100 y 200μl·l-1, respectivamente. Mientras que O. vulgare lo in­hibió en 96% a partir de una dosis de 400 μl/l. Los aceites esenciales de C. citratus, B. li­nanoe, L. nobilis, L. tridentata . M. pulegium, a partir de la dosis de 400μl·l-1, inhibieron el crecimiento micelial en 46, 31, 28, 25 y 12%, respectivamente.

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