Resumen
Objetivos: En las últimas décadas se han identificado genes asociados a la masa ósea y al riesgo de fractura osteoporótica, varios de los cuales pertenecen a la vía de Wnt. En este proyecto se estudió la funcionalidad de 7 mutaciones de cambio de sentido del gen DKK1 –un inhibidor de la vía de Wnt– presentes en la población general.
Material y métodos: Se realizaron estudios in vitro del gen reportero luciferasa para medir la actividad de la vía de Wnt en presencia o ausencia de DKK1 silvestre o mutada, y estudios de western blot, para evaluar si las distintas mutaciones afectan a su síntesis y/o a su estabilidad.
Resultados: La proteína DKK1 con la variante p.Ala41Thr presenta menor actividad inhibidora de la vía en comparación con la proteína silvestre. También se observaron diferencias significativas entre los experimentos realizados en ausencia de DKK1 y los que incluyen DKK1 con la mutación p.Ala41Thr. Los western blots mostraron que la cantidad de proteína era similar para todas las variantes, tanto las mutadas como la silvestre, por lo que la pérdida de actividad de p.Ala41Thr no parecía deberse a falta de proteína. El resto de las mutaciones no presentaron un comportamiento diferente al de la proteína DKK1 silvestre.
Conclusiones: La variante de cambio de sentido p.Ala41Thr de la proteína DKK1, con una frecuencia poblacional de 0,013%, presenta una pérdida parcial de su función inhibidora, que no es debida a la falta de expresión de ésta. Esta variante génica podría conllevar un aumento de la densidad mineral ósea en las personas de la población general portadoras de esta mutación.
Palabras clave: DKK1, estudios funcionales, variantes de cambio de sentido, luciferasa, vía de Wnt, masa ósea elevada, osteoporosis.
Abstract
Objectives: In recent decades, genes associated with bone mass and osteoporotic fracture risk have been identified, several of which belong to the Wnt pathway. In this project, the functionality of 7 missense mutations of the gene DKK1 –an inhibitor of the Wnt pathway– present in the general population was studied.
Materials and methods: In vitro studies of the luciferase reporter gene were carried out to measure Wnt pathway activity in the presence or absence of wild-type or mutated DKK1, and western blot studies, to evaluate if the different mutations affect its synthesis and/or stability.
Results: The DKK1 protein with the p.Ala41Thr variant shows lower pathway inhibitory activity compared to the wild-type protein. Significant differences were also observed between the experiments performed in the absence of DKK1 and those that include DKK1 with the p.Ala41Thr mutation. Western blots showed that the amount of protein was similar for all variants, both mutated and "wild-type, so the loss of p.Ala41Thr activity did not seem to be due to a lack of protein. The rest of the mutations did not show different behavior from that of the wild DKK1 protein.
Conclusions: The missense variant p.Ala41Thr of the DKK1 protein, with a population frequency of 0.013%, shows a partial loss of its inhibitory function, which is not due to the lack of expression. This gene variant could lead to an increase in bone mineral density in those people in the general population who carry this mutation.
Keywords: DKK1, functional studies, missense variants, luciferase, Wnt pathway, High Bone Mass (HBM), osteoporosis.
Research Article
Estudios funcionales de variantes de DKK1 presentes en la población general
Functional studies of DKK1 variants present in the general population
Sociedad Española de Investigaciones Óseas y Metabolismo Mineral
Recepción: 02 Junio 2018
Aprobación: 01 Septiembre 2018
El papel de la vía de Wnt sobre la regulación del remodelado óseo se ha demostrado en múltiples estudios. Por un lado, se han descrito polimorfismos en diversos genes de la vía de Wnt que muestran asociación con la densidad mineral ósea (DMO) y el riesgo de fractura1-6. También se han descrito mutaciones poco frecuentes o raras en genes de la vía de Wnt, causantes de fenotipos óseos más raros, tales como la osteoporosis-pseudoglioma (OPPG; OMIM 259770)7, la osteogénesis imperfecta autosómica recesiva de tipo XV (OMIM 615220)8, y la osteosclerosis (OMIM 144750)9. La vía de Wnt se inicia con la formación de un complejo heterotrimérico entre el receptor Frizzled, el co-receptor LRP5 y el ligando Wnt. Una vez formado este complejo, la β-catenina se acumula en el citoplasma y se transloca al núcleo donde puede activar la transcripción de numerosos genes diana. En osteoblastos se ha demostrado que la vía de Wnt activa la transcripción de genes que contribuyen netamente a la formación de hueso10. Además, esta vía se encuentra finamente regulada por una serie de inhibidores extracelulares, entre los que destacan la proteína esclerostina, codificada por el gen SOST, y la proteína DKK1, codificada por un gen con el mismo nombre. Estas dos proteínas realizan su función, impidiendo la formación del complejo heterotrimérico. Las proteínas esclerostina y DKK1 forman así otros complejos heterotriméricos, junto con LRP5 y LRP4 (en el caso de esclerostina)11,12 y junto con LRP5 y Kremen (en el caso de DKK1)13.
La sobreexpresión transgénica del gen DKK1 en osteoblastos produce una disminución relativa del número de osteoblastos frente al de osteoclastos, produciendo así una disminución en la formación de hueso. Del mismo modo, en ratones, la deleción homocigota del gen DKK1 es letal, pero la deleción en heterocigosis presenta un fenotipo de sobrecrecimiento de hueso (alta masa ósea)14,15.
Gracias al efecto directo sobre la inhibición de la osteoblastogénesis y de la activación indirecta de la osteoclastogénesis16, en la última década esclerostina y DKK1 se han convertido en unas dianas interesantes para el tratamiento de la osteoporosis. En cuanto a DKK1 se refiere, se han desarrollado anticuerpos (BHQ880, DKN-01 y PF-04840082), el primero de los cuales se encuentra en fase de ensayo clínico en mujeres postmenopáusicas con baja densidad mineral ósea (DMO)17-19.
En un estudio previo de nuestro grupo20 se secuenció DKK1 para identificar variantes que pudieran explicar el fenotipo de alta masa ósea (HBM, por sus iniciales en inglés), definida por una Z-score femoral + lumbar > 4, presente en 15 mujeres. En una de ellas, se encontró una mutación de cambio de sentido (p.Tyr74Phe) que cosegregaba con el fenotipo HBM en la familia. En otro estudio de resecuenciación del gen DKK1 en mujeres postmenopáusicas de la cohorte BARCOS, hemos encontrado otra mutación de cambio de sentido (p.Arg120Leu) en otra mujer con HBM21. Además de estas mutaciones, en la población general existen otras variantes de cambio de sentido en DKK1 (http://exac.broadinstitute.org/), cuyo efecto en términos de masa ósea se desconoce.
En este trabajo, hemos realizado estudios in vitro de las mutaciones p.Arg120Leu y p.Tyr74Phe, junto con otras mutaciones de cambio de sentido de DKK1 frecuentes en la población general (p.Met16Leu, p.Ala41Thr, p.Pro84Leu, p.Ala106Thr, p.Ser157Ile), para valorar su posible implicación en fenotipos óseos.
Los vectores de expresión mouse Wnt1-V5, mesdc2, human wildtype LRP5, pRL-TK, PGL3-OT y DKK1-FLAG22, fueron cortesía del Dr. Wim van Hul (Amberes, Bélgica). Las mutaciones p.Met16Leu, p.Ala41Tyr, p.Tyr74Phe, p.Pro84Leu, p.Ala106Thr, p.Arg120Leu, p.Ser157Ile se introdujeron en el vector de expresión DKK1-FLAG utilizando el kit Quick Change Site-Directed Mutagenesis (Stratagene). Se verificó la presencia de las mutaciones y la ausencia de errores mediante secuenciación Sanger.
Se han utilizado células HEK293, cultivadas con medio DMEM suplementado con FBS (10% V/V, Gibco, LifeTecnologies) y 1% de estreptomicinapenicilina (Gibco, LifeTecnologies) y mantenidas en incubadores a 37ºC al 5% en CO2. Se sembraron 3 x 105 células por pocillo en placas de 6 pocillos, 24 h antes de la transfección. Se transfectó 2.000 ng/pocillo de los plásmidos DKK1-FLAG mutado o silvestre. La transfección se realizó utilizando Lipofectamina 2000 (Invitrogen) siguiendo las indicaciones del fabricante. A las 24 h se cambió el medio, reduciendo de 2 a 1 ml de DMEM, sin FBS (Fetal Bovine Serum) ni antibióticos. A las 48 h de la transfección se recogió el sobrenadante de cada condición. Las proteínas del medio condicionado se concentraron utilizando filtros Amicon Ultra (Millipore) y se fueron cuantificadas mediante el ensayo BCA (Pierce). Las proteínas de los medios condicionados concentrados (4,5 µg/carril) se separaron mediante electroforesis en un gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE) y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Para los análisis de western blot se utilizaron los anticuerpos de Abcam ab109416 contra DKK1 y ab2413 contra la proteína extracelular fibronectina, utilizada como control de carga. Las imágenes se desarrollaron usando un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa (Sigma-Aldrich). Para cada mutante se obtuvo medio condicionado en 2 días diferentes y se realizó el análisis por western blot 2 veces con estos medios condicionados.
Se utilizaron células HEK293, cultivadas como se indica en el apartado anterior. Se sembraron 104 células por pocillo en placas de 96 pocillos, 24 h antes de la transfección. Se cotransfectaron hasta 5 plásmidos en células HEK293: Mouse Wnt1-V5 (3,2 ng), mesdc2 (6,4 ng), human wildtype LRP5 (6,4 ng), pRL-TK (8 ng), y pGL3-OT (160 ng). Además, dependiendo del experimento también se cotransfectó el plásmido DKK1-FLAG (0,6 ng) silvestre o mutado. En caso necesario, se utilizó el vector vacío pcDNA3 para igualar la cantidad total de ADN de cada experimento. La transfección se realizó utilizando Lipofectamina 2000 (Invitrogen) siguiendo las indicaciones del fabricante. A las 48 h de la transfección, las células se lisaron y se midió la actividad de las luciferasas de Photinus pyrali y Renilla reniformis utilizando un luminómetro Glomax Multi+ (Promega) siguiendo las instrucciones del sistema Dual-luciferase reporter assay (Promega). Cada experimento incluyó 5 réplicas y se repitió independientemente en 3 experimentos separados.
Se realizó un modelo one-way blocked ANOVA para cada mutante teniendo en cuenta el factor de prueba, el día como factor de bloqueo y la variable de respuesta la relación entre las actividades de las luciferasas (Photinus pyrali vs. Renilla reniformis). El bloqueo es una técnica para lidiar con el factor de molestia y este puede ser un factor que influya en la respuesta. Para cada proteína mutante, el factor de prueba tiene los siguientes niveles: control (se refiere a la actividad de la luciferasa resultante de la vía de Wnt endógena), el activador (actividad de la luciferasa producida por la vía de Wnt en presencia de Wnt y LRP5 exógenos), el inhibidor (actividad en presencia del inhibidor DKK1 silvestre) y mutante (cada una de las proteínas DKK1 mutantes). Se utilizó el test de TukeyHSD para realizar la prueba post hoc para comparaciones múltiples de grupos. Los test ANOVA se realizaron utilizando el programa R studio v.3.4.0, y valores de p<0,05 fueron considerados significativos. Todos los datos fueron evaluados para la normalidad, la homogeneidad de la varianza y la detección de valores atípicos.
Se ha realizado un ensayo de western blot para comprobar si las proteínas DKK1 mutantes se encuentran correctamente en el espacio extracelular, utilizando un cultivo de células HEK293, que expresan elevadas cantidades de DKK1 silvestre o DKK1 mutadas. Los resultados muestran que, en todos los casos, las distintas proteínas DKK1 mutadas se detectan en el espacio extracelular (Figura 1) y a niveles iguales o superiores a los de la proteína silvestre.
Figura 1
Niveles de expresión de la proteína DKK1 wild-type o mutada analizados mediante western blot. Se transfectaron células HEK293 con vectores de expresión de las diferentes variantes de DKK1 que se indican en cada carril. Los medios condicionados resultantes, debidamente concentrados se emplearon para este análisis. En cada carril se cargó 4,5 ug de proteína total. Como control de carga se ha utilizado la proteína extracelular fibronectina
Con el objetivo de testar la actividad inhibidora de proteínas DKK1 mutantes sobre la vía de Wnt, hemos realizado un ensayo de gen reportero (luciferasa), específico para esta vía (Figura 2).
Figura 2
Diseño de ensayo de gen reportero. A) Condición endógena: transfectamos los plásmidos pRLTK y pGL3OT. B) Condición activa: transfectamos los plásmidos pRLTK, pGL3OT, Wnt1, LRP5 y mesdc2. C) Condición inhibida: transfectamos los plasmidos pRLTK, pGL3OT, Wnt1, LRP5, mesdc2 y DKK1-WT. En gris los elementos endógenos de las células HEK293 de la vía de Wnt, en color los elementos transfectados en cada condición
Los resultados de la condición endógena en la que se han cotransfectado los plásmidos pRLTK y pGL3-OT se muestran en las figuras 2A y 3 que representan la actividad de la vía de Wnt en las células HEK293.
Figura 3
Ensayo de actividad de la proteína DKK1-p.Ala41Thr. A) Gráfico de interacciones siguiendo el modelo, Yij = + día + test + día:test + ϵijk. En el eje de las Y se muestra el logaritmo de la media de la ratio de actividades de las luciferasas (Photinus pyrali/Renilla reniformis) con su intervalo de confianza; en el eje de las X se muestran los tres días en los que se ha testado el experimento. B) Test Tukey de comparaciones múltiples entre las diferentes condiciones testadas. Se muestran los niveles de significación mediante el código: (****)<0,000001, (***)<0,0001, (**)<0,01, (*)<0,05
Figura 3 (Cont.)
Ensayo de actividad de la proteína DKK1-p.Ala41Thr. A) Gráfico de interacciones siguiendo el modelo, Yij = + día + test + día:test + ϵijk. En el eje de las Y se muestra el logaritmo de la media de la ratio de actividades de las luciferasas (Photinus pyrali/Renilla reniformis) con su intervalo de confianza; en el eje de las X se muestran los tres días en los que se ha testado el experimento. B) Test Tukey de comparaciones múltiples entre las diferentes condiciones testadas. Se muestran los niveles de significación mediante el código: (****)<0,000001, (***)<0,0001, (**)<0,01, (*)<0,05
En la condición activa, además de pRLTK y pGL3-OT, se ha cotransfectado los vectores que expresan Wnt1 y LRP5. Wnt1 actúa como ligando activador de la vía y LRP5 como co-receptor, dos elementos indispensables para la activación de la vía. En esta condición (Figura 2B) la actividad de la luciferasa se ha incrementado 3 veces, en promedio, en comparación con la vía endógena (Figura 3, activador).
La vía inhibida contenía los mismos vectores que la condición activa pero además se ha cotransfectado el vector que expresa la proteína DKK1-WT (proteína silvestre). En esta condición, se ha inhibido la vía de Wnt, al secuestrar al coreceptor LRP5 (Figura 2C). En estos experimentos la actividad de la luciferasa se ha aumentado 2,2 veces respecto a la condición endógena y ha resultado significativamente inferior a la de la vía activada (Figura 3, inhibidor).
Cuando se ha comprobado la funcionalidad de los mutantes de DKK1, se han cotransfectado los distintos vectores de la vía inhibida, pero sustituyendo el de DKK1-WT por los que expresan las distintas DKK1 mutadas. Para las proteínas mutantes DKK1p.Met16Leu, DKK1-p.Tyr74Phe, DKK1-p.Pro84Leu, DKK1-p.Ala106Thr, DKK1-p.Arg120Leu y DKK1p.Ser157Ile no se han hallado diferencias significativas en la actividad inhibidora comparada con la proteína DKK1 WT (datos no mostrados).
En cambio, en presencia de la proteína mutante DKK1-p.Ala41Thr se ha observado una actividad de la luciferasa que es significativamente mayor a la de la vía inhibida por la DKK1-WT (Figura 3), y a su vez significativamente inferior a la de la vía activa.
El gen DKK1 codifica una proteína del mismo nombre, que actúa en el espacio extracelular como inhibidor de la vía de señalización de Wnt. Numerosos estudios han asociado la vía de Wnt con la formación ósea, mientras que su bloqueo mediante esclerostina o DKK1 se ha asociado con mayor pérdida de masa ósea y riesgo de fractura. La búsqueda de variantes génicas que puedan explicar la regulación de la vía Wnt en la población general puede abrir una campo de investigación muy relevante para el estudio de la osteoporosis. En este trabajo hemos estudiado la función inhibidora de 7 proteínas DKK1 mutantes sobre la vía de Wnt y hemos observado que la proteína mutante DKK1-p.Ala41Thr presenta una pérdida parcial de su función inhibidora, que no es debida a la pérdida de su expresión. La actividad de la proteína DKK1-p.A41T se reduce aproximadamente un 50% en comparación con la proteína DKK1-WT. La mutación, en el aminoácido 41 no se encuentra en el dominio de unión a LRP5 (aminoácidos 189-263), pero sí que afecta el motivo NAIKN (aminoácidos 40-44), crucial para la unión a las proteínas LRP5 y LRP6 y que se encuentra conservado en todos los inhibidores de la vía de Wnt23.
Según la base de datos ExAC, la frecuencia poblacional de la variante p.Ala41Thr es de 15 heterocigotos en 60.000 individuos adultos exentos de patologías graves. Dado nuestro resultado de pérdida de actividad inhibidora de esta variante de DKK1, podríamos inferir que el fenotipo asociado sería de una mayor densidad ósea no patogénica. A partir de esta frecuencia, estimamos que en España hay unos 6.000 portadores de esta variante en heterocigosis. Por otra parte, hay una única referencia a la mutación p.Ala41Thr que la asocia a patología, concretamente a la malformación de Chiari tipo I (CMI)24. Esta enfermedad se caracteriza por un defecto del desarrollo del hueso occipital y la fosa posterior (PF) y la consiguiente hernia de la amígdala cerebelosa. Será interesante estudiar la posible relación entre mutaciones en DKK1 y esta patología, que en muchos casos es asintomática y no diagnosticada.
No se han encontrado diferencias en la actividad del resto proteínas mutantes y la proteína DKK1 WT. Estos resultados coinciden con los resultados encontrados por Korvala et al.25 para la mutación p.Arg120Leu. Estos autores encontraron dicha mutación en un paciente con osteoporosis primaria, un fenotipo diametralmente opuesto al fenotipo de la mujer HBM donde nosotros encontramos la muta ción. Esta misma mutación se encuentra en pacientes con enfermedad de Paget (PDB)26 y su frecuencia en pacientes es el doble que en controles, aunque la diferencia no resulta significativa.
Ninguna de las siete mutaciones testadas se encuentra en el dominio que afecta a la vía de señalización de Wnt (dominio de unión a LRP5: aminoácidos 189-263), y solo la p.Ala41Thr afecta al motivo NAIKN. Esto podría ser una razón por la que no se han observado diferencias de actividad inhibidora en 6 de las 7 DKK1 mutadas. Alternativamente, estas DKK1 mutantes mostrarían diferencias de actividad inhibidora menores a las que se puedan detectar con la sensibilidad del ensayo de gen reportero que se ha utilizado. Una limitación del estudio sería que el ensayo realizado conlleva la cotransfección de varios vectores para tener unos valores altos de actividad de la luciferasa, lo que le confiere una elevada variabilidad. Otra limitación sería que el efecto que se espera de estas mutaciones es pequeño, ya que son variantes presentes en la población general. Esta cuestión solo podrá resolverse cuando se disponga de algún ensayo con una mayor sensibilidad.
En conclusión, en este estudio se ha visto que la proteína DKK1-p.Ala41Thr presenta una pérdida parcial de su función inhibidora, que no se debe a su falta de expresión. Esto podría conllevar un aumento de la densidad mineral ósea en las personas de la población general portadoras de dicha mutación.
Los autores declaran no tener conflicto de interés.
Susana Balcells Comas - Departamento de Genética, Microbiología y Estadística - Facultad de Biología - Universitat de Barcelona - Avda. Diagonal, 643 - 08028 Barcelona (España)sbalcells@ub.edu
Figura 1
Niveles de expresión de la proteína DKK1 wild-type o mutada analizados mediante western blot. Se transfectaron células HEK293 con vectores de expresión de las diferentes variantes de DKK1 que se indican en cada carril. Los medios condicionados resultantes, debidamente concentrados se emplearon para este análisis. En cada carril se cargó 4,5 ug de proteína total. Como control de carga se ha utilizado la proteína extracelular fibronectina
Figura 2
Diseño de ensayo de gen reportero. A) Condición endógena: transfectamos los plásmidos pRLTK y pGL3OT. B) Condición activa: transfectamos los plásmidos pRLTK, pGL3OT, Wnt1, LRP5 y mesdc2. C) Condición inhibida: transfectamos los plasmidos pRLTK, pGL3OT, Wnt1, LRP5, mesdc2 y DKK1-WT. En gris los elementos endógenos de las células HEK293 de la vía de Wnt, en color los elementos transfectados en cada condición
Figura 3
Ensayo de actividad de la proteína DKK1-p.Ala41Thr. A) Gráfico de interacciones siguiendo el modelo, Yij = + día + test + día:test + ϵijk. En el eje de las Y se muestra el logaritmo de la media de la ratio de actividades de las luciferasas (Photinus pyrali/Renilla reniformis) con su intervalo de confianza; en el eje de las X se muestran los tres días en los que se ha testado el experimento. B) Test Tukey de comparaciones múltiples entre las diferentes condiciones testadas. Se muestran los niveles de significación mediante el código: (****)<0,000001, (***)<0,0001, (**)<0,01, (*)<0,05
Figura 3 (Cont.)
Ensayo de actividad de la proteína DKK1-p.Ala41Thr. A) Gráfico de interacciones siguiendo el modelo, Yij = + día + test + día:test + ϵijk. En el eje de las Y se muestra el logaritmo de la media de la ratio de actividades de las luciferasas (Photinus pyrali/Renilla reniformis) con su intervalo de confianza; en el eje de las X se muestran los tres días en los que se ha testado el experimento. B) Test Tukey de comparaciones múltiples entre las diferentes condiciones testadas. Se muestran los niveles de significación mediante el código: (****)<0,000001, (***)<0,0001, (**)<0,01, (*)<0,05
