Resumen
Introducción: WNT16 es un gen importante en la homeostasis ósea, que se encuentra en un locus muy complejo que también incluye los genes vecinos: ING3. FAM3C y CPED1. Además del claro papel de WNT16 sobre la determinación de la densidad mineral ósea (DMO), también se han encontrado pruebas sobre la importancia de estos tres genes vecinos en el metabolismo óseo. Queda por tanto esclarecer si las variantes en WNT16 asociadas a la DMO realizan su efecto propiamente sobre WNT16 o si lo hacen modificando la expresión de estos genes vecinos.
Material y métodos: Hemos determinado los niveles de expresión de CPED1 y FAM3C en osteoblastos primarios y hemos comprobado si variantes de WNT16 se comportan como loci de rasgos cuantitativos de expresión (expresion quantitative trait loci; eQTL) de estos genes.
Resultados: La variante de cambio de aminoácido rs2908004 en WNT16 actúa como eQTL de FAM3C en osteoblastos primarios bajo la hipótesis de modelo dominante.
Discusión: Es posible que el efecto de esta variante sobre la DMO sea debido a la modificación de los niveles de expresión de FAM3C además o en vez de un efecto directo de la proteína WNT16 mutante resultante del cambio de aminoácido.
Palabras clave: WNT16, densidad mineral ósea, osteoporosis, transcripción.
Summary
Introduction: WNT16 is an important gene in bone homeostasis, found in a very complex locus that also includes neighboring genes: ING3, FAM3C, and CPED1. In addition to the clear role of WNT16 in determining bone mineral density (BMD), evidence has also been found for the importance of these three neighboring genes in bone metabolism. Therefore, it remains to be clarified whether the variants in WNT16 associated with BMD carry out their effect on WNT16 or if they do so by modifying the expression of these neighboring genes.
Material and methods: We have determined the expression levels of CPED1 and FAM3C in primary osteoblasts and we have verified whether WNT16 variants behave as loci of quantitative expression traits (expression quantitative trait loci; eQTL) of these genes.
Results: The amino acid change variant rs2908004 in WNT16 acts as the eQTL of FAM3C in primary osteoblasts under the dominant model hypothesis.
Discussion: It is possible that the effect of this variant on BMD is due to the modification of the expression levels of FAM3C in addition to or instead of a direct effect of the mutant WNT16 protein resulting from the amino acid change.
Key words: Bone mineral density, WNT16, osteoporosis, transcription.
ORIGINALES
La variante missense rs2908004 de WNT16 actúa como eQTL de FAM3C en osteoblastos primarios humanos
WNT16 rs2908004 missense variant acts as eQTL of FAM3C in human primary osteoblasts
Sociedad Española de Investigaciones Óseas y Metabolismo Mineral
Recepción: 13 Mayo 2021
Aprobación: 27 Septiembre 2021
WNT16 es un ligando de la vía de Wnt extensamente estudiado por su importancia en la regulación de la homeostasis del hueso. Esto se ha confirmado con el fenotipo de ratones knock-out (KO) y ratones KO condicionales en osteoblastos (cKO), que muestran fracturas espontáneas debido a una baja densidad mineral ósea (DMO) cortical, una baja resistencia ósea y una alta porosidad cortical, manteniendo el volumen de hueso trabecular inalterado1-4. Por el contrario, la sobreexpresión de WNT16 en osteoblastos y osteocitos produce un aumento de la DMO y de la resistencia ósea tanto en hueso trabecular como cortical">5-7. A pesar de esto, no se conoce el mecanismo preciso por el que WNT16 actúa y diferentes estudios señalan que el efecto sobre las vías Wnt canónicas y no-canónicas podría ser específico de tejido1,8-11. En el hueso, WNT16 es expresado principalmente por los osteoblastos y realiza su función tanto estimulando la formación ósea, como inhibiendo su resorción de manera indirecta a través de OPG o de manera directa afectando a la diferenciación de los osteoclastos1,12.
Multitud de estudios de asociación del genoma completo (GWAS) han mostrado asociación entre el locus que contiene WNT16 y varios fenotipos esqueléticos, incluyendo la DMO y el riesgo de fracturas2,3,13-26. WNT16 se encuentra en un locus muy complejo, donde varios genes de la región han mostrado un papel importante sobre el metabolismo óseo. Pertenecen a este locus los genes ING3 y CPED1 a 5 y FAM3C a 3 de WNT16 (figura 1).
Figura 1
Genes en el locus: ING3_1 (ENST00000315870.5), ING3_2 (ENST00000339121.5), CPED1_1 (ENST00000310396.5), CPED1_7 (ENST00000450913.2), WNT16_1 (ENST00000222462.2), WNT16_2 (ENST00000361301.2), y FAM3C (ENST00000359943.3), de GRCh37/hg19
ING3 (Inhibitor Of Growth Family Member 3) es responsable de la regulación de la cromatina, ya que forma parte del complejo NuA4 histona acetiltransferasa (HAT) que reconoce la forma trimetilada de la lisina 4 de la histona H327. Otras funciones no relacionadas con la regulación de la cromatina incluyen la promoción de la apoptosis, la reparación de ADN y la modulación de la movilidad celular27. ING3 se expresa en multitud de tejidos, especialmente en aquellos con mayor proporción de crecimiento celular, siendo el hueso uno de los que mayor expresión de ING3 presenta27. El modelo celular in vitro de células mesenquimales KO de ING3, muestra afectación de la osteoblastogénesis y una estimulación de la diferenciación adipogénica28.
Para CPED1 (Cadherin Like And PC-Esterase Domain Containing 1), no se conoce función concreta en humanos o ratones. En estos últimos, se encuentra uniformemente expresado en una variedad de tejidos sólidos, incluido el óseo, aunque no se detecta en la línea celular RAW264.7 ni en leucocitos circulantes29. Además, Cped1 presenta diferentes isoformas debidas a splicing alternativos y tres regiones promotoras activas durante la diferenciación osteogénica, lo que indica una compleja regulación durante la diferenciación29.
FAM3C (Family of sequence similarity 3c) es un factor de crecimiento tipo citocina expresado en multitud de tejidos30, que juega un papel muy importante en la transición epitelio-mesénquima (Epithelial-to-mesenchymal transition; EMT) y la subsecuente metástasis durante la progresión del cáncer31. Su relación con el metabolismo óseo se ha confirmado con el modelo de ratón KO que presenta alteraciones en la estructura cortical y trabecular, con un aumento en la DMO cortical, lo que genera una disminución de la resistencia ósea30. En estudios in vitro, se comprobó que las células mesenquimales extraídas de estos ratones KO mostraban una osteoblastogénesis acelerada31.
La relación de los genes presentes en el locus ING3-CPED1-WNT16-FAM3C con el metabolismo óseo y su repetida asociación a la DMO plantea la cuestión de si hay un único gen causal y, en ese caso, cuál es o, si por lo contrario, todos los genes están contribuyendo al fenotipo. Para ello, en el presente trabajo hemos determinado si aquellas variantes de WNT16 asociadas a la DMO en un trabajo previo de nuestro grupo32 se encuentran modificando la expresión de los genes vecinos CPED1 y FAM3C.
Para los ensayos de loci que determinan diferencias cuantitativas de expresión génica (expression quantitative trait loci; eQTL) se usaron osteoblastos primarios humanos (hOB). Los hOB se obtuvieron a partir de fragmentos de hueso trabecular descartados de operaciones de reemplazo de rodilla realizadas a mujeres con osteoartritis y que no presentaban ningún otro trastorno que pudiera afectar la calidad ósea. El estudio fue aprobado por el Comité Ético de Investigación Clínica del Parc de Salut MAR (números de registro: 2010/3882/I and 2013/5266/I) y se llevó a cabo de acuerdo con la Declaración de Helsinki, obteniéndose consentimiento informado por escrito de todos los participantes. El protocolo de cultivo de los osteoblastos primarios se encuentra descrito en Roca-Ayats y cols.33. Brevemente, las muestras de hueso se cortaron en trozos pequeños y se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS; Gibco, Life Technologies). Estas piezas se cultivaron en placas de 140 mm con DMEM suplementado al 10% de FBS, 1% p/s, 0,4% de fungizona (Gibco, Life Technologies) y 100 g/ml de ácido ascórbico (Sigma-Aldrich). Cuando las células alcanzaron la confluencia, se dividieron en tres matraces de 75 cm2, uno para extracción de ADN, otro para extracción de ARN y el tercero para su congelación y almacenamiento. Se utilizaron células a pase 2 o inferior para todas las extracciones.
Se extrajo el ADN de los hOB cultivados utilizando el kit Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La concentración del ADN purificado y su calidad se analizó en un espectrofotómetro (Nanodrop). Los genotipos de las variantes rs2908004, rs2707466, rs55710688 y rs142005327 se evaluaron mediante secuenciación Sanger utilizando BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems) en las instalaciones de Genómica de los CCiT de la Universitat de Barcelona. Los primers (Invitrogen, Thermo Fisher) se diseñaron utilizando el Primer3 Input 0.4.0 (tabla 1). El ARN total de los hOB cultivados se extrajo utilizando el kit High Pure RNA Isolation kit (Roche), de acuerdo con las instrucciones del fabricante y la cuantificación y la calidad del ARN se comprobaron utilizando un espectrofotómetro Nanodrop. El ARN se retrotranscribió a cADN utilizando el kit High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Thermo Fisher), de acuerdo con las especificaciones del fabricante. La RTqPCR se realizó utilizando sondas UPL (Roche) en un LightCycler 480 Instrument II (Roche). Se utilizó la expresión del gen HMBS como control de normalización y se calculó la cuantificación relativa (fold change) utilizando el método de la segunda derivada. El número y la secuencia de la sonda utilizada, así como los primers utilizados para la amplificación de los genes CPED1, FAM3C y HMBS se muestran en la tabla 1.
Primers utilizados en la secuenciación de cuatro SNPs de WNT16 y para la RT-qPCR de FAM3C, CPED1 y HMBS
F: primer forward; R: primer reverse.
Para el análisis estadístico de los eQTL, se utilizó la función WGassociation34 en RStudio. Esta función lleva a cabo un análisis de asociación entre un SNP dado y una variable dependiente (en este caso los niveles de expresión de CPED1 y FAM3C) en cinco modelos de herencia genética diferentes: codominante [homocigoto para alelo mayoritario frente a heterocigoto frente a homocigoto para alelo minoritario], dominante [homocigoto para alelo mayoritario frente a (heterocigoto + homocigoto para alelo minoritario)], recesivo [homocigoto para alelo minoritario frente a (heterocigoto + homocigoto para alelo mayoritario)], sobredominante [heterocigoto frente a (homocigoto para alelo mayoritario + homocigoto para alelo minoritario)] y log-aditivo [cada alelo modifica el riesgo en una cantidad aditiva].
Las variantes rs2908004, rs2707466, rs55710688 y rs142005327 de WNT16 han sido descritas como cis-eQTLs, según la base de datos GTEx en diferentes tejidos humanos (tabla 2). Desafortunadamente, esta base de datos no dispone de información de ningún tejido óseo. Es por esto, que haciendo uso de una base de datos propia de osteoblastos primarios humanos (n=45), hemos testado si estas variantes actúan como cis-eQTL de los genes vecinos de WNT16: CPED1 y FAM3C. Únicamente la variante rs2908004 ha mostrado una asociación significativa con los niveles de expresión de FAM3C bajo la hipótesis dominante (p=0.03, tabla 3, figura 2). Además, las variantes rs2908004 y rs2707466 muestran una tendencia a la significación con los niveles de expresión de FAM3C bajo la hipótesis de codominancia (p=0.05491) y bajo la hipótesis dominante (p=0.06954), respectivamente (tabla 3, figura 2). La presencia del alelo G (rs2908004) y el alelo C (rs2707466) están asociados con un aumento en la expresión de FAM3C (tabla 3, figura 2). Por el contrario, no hemos encontrado asociación significativa ni tendencia entre las variantes analizadas de WNT16 y los niveles de expresión de CPED1 (tabla 3, figura 2).
Genes cuya expresión es modificada por las variantes rs2908004, rs2707466, rs55710688, rs142005327 en diversos tejidos humanos (datos extraídos del Genotype-Tissue Expression (GTEx) Portal)
NE: no expuesta al sol (suprapúbica); E: expuesta al sol (parte inferior de la pierna).
Resultados de asociación de los 4 SNPs de WNT16 y la expresión de CPED1 y FAM3C
En negrita las asociaciones significativas (p<0,05) y en cursiva las que muestran tendencia.
A may: alelo mayoritario; A min: alelo minoritario; HWE: equilibrio de Hardy-Weinberg.
Figura 2
Gráficos de violín (violin plots) de los niveles de expresión de FAM3C (arriba) y CPED1 (abajo) según los tres genotipos(homozigoto para el alelo mayoritario, heterozigoto, homozigoto para el alelo minoritario) de las 4 variantes estudiadas
I: inserción; D: deleción.
Multitud de trabajos en los últimos 20 años destacan la importancia de WNT16 en la homeostasis ósea. WNT16 se encuentra en la posición 7q31.31 junto con otros 3 genes también relacionados con el metabolismo óseo. En un estudio previo de nuestro grupo encontramos que las variantes rs142005327, rs55710588, rs2908004 y rs2707466 se hallaban asociadas a la DMO en una cohorte de mujeres postmenopáusicas del área de Barcelona (BARCOS)32. Para determinar si estas variantes están relacionadas con un efecto sobre WNT16 o con un efecto sobre la expresión de genes vecinos hemos comprobado si están actuando como eQTL de FAM3C y CPED1. Este trabajo nos ha permitido determinar que la variante missense rs2908004 está actuando como eQTL del gen FAM3C bajo la hipótesis de modelo dominante en osteoblastos primarios humanos.
La variante de cambio de aminoácido rs2908004 (p.Gly72Arg/p.Gly82Arg) se ha encontrado asociada a diferentes parámetros óseos por nosotros y por otros autores2,32,35-38. Este cambio de aminoácido de glicina a arginina se considera tolerado y benigno por los predictores de patogenicidad SIFT y PolyPhen-2, por lo que su efecto sobre la DMO podría deberse a su papel como eQTL y no a un cambio sobre la proteína WNT16 resultante.
Cabe destacar que para obtener una significación estadística más robusta es necesario disponer de un banco con un mayor número de osteoblastos primarios. Desafortunadamente la obtención de estas muestras es difícil y solamente hemos logrado conseguir incorporar 45 muestras a nuestro banco.
Además, sería interesante determinar los niveles de expresión de otros genes vecinos que puedan estar influyendo sobre la DMO como ING3 o directamente sobre los niveles de expresión de WNT16, que no han podido ser cuantificados por falta de muestra de ARN de osteoblastos primarios.
Mediante este trabajo hemos determinado que la variante rs2908004 de WNT16 regula los niveles de expresión del gen vecino FAM3C bajo la hipótesis de modelo dominante. Si esta asociación se confirma en un banco de osteoblastos primarios mayor indicaría que la asociación de esta variante con la DMO podría ser debida, al menos en parte, a la variación de expresión de FAM3C.
Correspondencia: Núria Martínez-Gil (nuriamartinez91@ub.edu)
Figura 1
Genes en el locus: ING3_1 (ENST00000315870.5), ING3_2 (ENST00000339121.5), CPED1_1 (ENST00000310396.5), CPED1_7 (ENST00000450913.2), WNT16_1 (ENST00000222462.2), WNT16_2 (ENST00000361301.2), y FAM3C (ENST00000359943.3), de GRCh37/hg19
Primers utilizados en la secuenciación de cuatro SNPs de WNT16 y para la RT-qPCR de FAM3C, CPED1 y HMBS
F: primer forward; R: primer reverse.
Genes cuya expresión es modificada por las variantes rs2908004, rs2707466, rs55710688, rs142005327 en diversos tejidos humanos (datos extraídos del Genotype-Tissue Expression (GTEx) Portal)
NE: no expuesta al sol (suprapúbica); E: expuesta al sol (parte inferior de la pierna).
Resultados de asociación de los 4 SNPs de WNT16 y la expresión de CPED1 y FAM3C
En negrita las asociaciones significativas (p<0,05) y en cursiva las que muestran tendencia.
A may: alelo mayoritario; A min: alelo minoritario; HWE: equilibrio de Hardy-Weinberg.
Figura 2
Gráficos de violín (violin plots) de los niveles de expresión de FAM3C (arriba) y CPED1 (abajo) según los tres genotipos(homozigoto para el alelo mayoritario, heterozigoto, homozigoto para el alelo minoritario) de las 4 variantes estudiadas
I: inserción; D: deleción.
