Crecimiento de Zea mays inoculado con Bacillus cereus y Micromonospora echinospora con fertilizante nitrogenado al 50%

Growth of Zea mays innoculated with Bacillus cereus and Micromonospora echinospora at 50% of nitrogen fertilizer

En México y en el mundo la gramínea Zea mays es de alto consumo en la alimentación humana. Z. mays requiere fertilizante nitrogenado (FENI), en forma de NH₄NO₃ para un sano crecimiento. El FENI aplicado en exceso en su cultivo causa infertilidad del suelo.^1,2 En contraste, una alternativa de solución para la hiperfertilización en Z. mays es la inoculación con géneros y especies de BAPOCEVE las que permitan reducir y optimizar el NH₄NO₃ reducido al 50%.³ La literatura señala evidencias que géneros y especies diversas de BAPOCEVE, utilizan los compuestos orgánicos generados durante la germinación de las semillas como las de Z. mays, al igual de aquellos compuestos liberados durante el crecimiento de la raíz, pudiendo ser transformados en SUPOCEVE, de tipo auxina, citocinina y geberelina^17,18 que aceleran su germinación, induciendo la producción de abundantes pelos radicales, para que la raíz explore y optimice al máximo el FENI disponible, en especial se ha reducido para evitar la pérdida del fertilidad del suelo.^20,31 La literatura reporta un efecto positivo de diferentes géneros y especies de Bacillus spp., ya sea de manera individual o en mezcla con otros géneros y especies de BAPOCEVE, no convencionales como actinomicetos^4,7 que se aplican en gramíneas, para favorecer la síntesis de SUPOCEVE, un sano crecimiento a dosis de FENI reducida hasta un 50% sin causar problema de desnutrición mineral, Gholami et al.¹⁵, Ashrafuzzaman et al.¹⁶ reportan la inoculación de Z. mays exclusivamente con B. cereus, con otros géneros y especies de BAPOCEVE, pero no con algún género y especie de actinomiceto endófito como M. echinospora, de la que la información asociada con la inoculación en Z. mays a dosis regulada de FENI, es pobre o desconocida.^4,5 Por ello se propuso que este actinomiceto endófito se aplique en Z. mays mezclado con B. cereus que en la zona de rizosfera convierte exudados de raíz en fitohormonas, mientras M. echinospora endófito penetra al interior de las raíces sintetizando SUPOCEVE, así la planta podría mejorar la capacidad de absorción radical del FENI reducido al 50%, lo óptimo al máximo, sin poner en riesgo el sano crecimiento vegetal.^6,7,18,19,30

Un ejemplo de este hecho, fue en invernadero la respuesta positiva de Z. mays en los valores de la fenología y biomasa, cuando se inoculo con Azotobacter sp. y Bacillus megaterium⁹, registrándose valores numéricos estadísticamente distintos comparados con los de respuesta de Z. mays con control relativo (CR). Con base a lo anterior el objetivo de esta investigación fue analizar el crecimiento de Z. mays inoculado con B. cereus y/o M. echinospora a la dosis 50% del FENI.

Esta investigación se realizó en el invernadero del laboratorio de Microbiología Ambiental, Instituto de Investigaciones Químico-Biológicas (IIQB) de la Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo (UMSNH), Morelia, Mich, México. La temperatura promedio fue de 23.2 °C, luminosidad de 450 μmol·m^-2s^-1, humedad relativa de 67%. Para este ensayo se utilizó un suelo no estéril colectado de un sitio ubicado a los 19º 39’ 27’’ de latitud norte 100º 19’ 59’’ de longitud oeste, con una altitud de 1820 msnm de clima templado, en un terreno agrícola denominado “La cajita” perteneciente a la Tenencia Zapata del municipio de Morelia, sobre el km 5 de la carretera Morelia-Pátzcuaro, Mich, México. La textura de este suelo se clasificó como franco-arcilloso, materia orgánica de 4.57% y un pH 6.64 ligeramente ácido.

Figura 1
Diagrama de diseño de una Jarra de Leonard¹⁰

El suelo se solarizó a 70 °C/48 h para minimizar problemas de plagas y enfermedades, después se tamizó con una malla del No. 20. Posteriormente 1.5 kg de suelo se colocó en la parte superior de la Jarra de Leonard, mientras que la solución mineral (SOMI) o agua en el reservorio de la parte inferior, ambas partes se conectaron por una tira de algodón de aproximadamente 20 cm de largo para permitir el movimiento de la solución por capilaridad al suelo (Figura 1). La semilla de Z. mays fue proporcionada por la Secretaria del Ambiente y Recursos Naturales del gobierno de México (SEMARNAT 2018)^10,12 las cepas de B. cereus y M. echinospora pertenecen a la colección del Laboratorio de Microbiología Ambiental del IIQB-UMSNH, fueron aisladas de la rizosfera del pasto Paspalum notatum.¹ El ensayo se realizó con un diseño experimental de bloques al azar con 5 tratamientos y 5 repeticiones Tabla 1, con 2 controles: i) Z. mays sin inocular e irrigado con agua referido como control absoluto (CA), ii) Z. mays sin inocular, alimentado con el NH₄NO₃ al 100% o control relativo (CR) y iii) los tratamientos Z. mays con B. cereus y/o M. echinospora alimentado con una solución mineral (SOMI) que contenía el FENI y la siguiente composición química (g/L): NH₄NO₃ 12.0, KH₂PO₄ 3.0, K₂HPO₄ 3.5, MgSO₄ 1.5, CaCl₂ 0.1, FeSO₄ 0.5 mL y 1.5 mL de la solución de oligoelementos (SOL): H₃BO₃ 2.86, ZnSO_4*7 H₂O 0.22, MnCl_2*7 H₂O 1.81 y K₂MnO₄ 0.09 en 1000 mL de agua destilada para plantas, ajustada a pH de 6.8, aplicada c/3dias por dos meses. Por su parte B. cereus se cultivó en caldo nutritivo (CN) con la siguiente composición (g/L): extracto de carne 3.0, peptona de caseína 5.0 y ajustado a un pH de 7.0, mientras que M. echinospora se reprodujo en agar hueso de aguacate (AHA) con la siguiente composición (g/L): hueso de aguacate 10.0, peptona de caseína 5.0, extracto de levadura 1.3, K₂HPO₄ 0.17, KH₂PO₄ 2.61, MgSO₄ 1.5, NaCl 0.9, CuSO₄ 0.05, azul de bromotimol 10% (p/v) 10 ppm, solución detergente 2.5 mL al 10%, antifúngico Tecto®60 1.0 mL al 10%, SOL 1.0 mL, agar bacteriológico 18.0, ajustado a un pH de 7.5, ambas BAPOCEVE se incubaron a 30 °C/72 h. Para la inoculación de Z. mays: por cada 50 semillas de Z. mays se usaron 7.0 mL de B. cereus y/o M. echinospora a densidad de 2.0x10⁶ UFC/mL y 2.1x10⁶ UFP unidades formadoras de propagulos/mL, respectivamente, calculado en base a una cuenta viable en placa en agar nutritivo y AHA.¹¹ Entonces las semillas de Z. mays inoculadas con B. cereus y/o M. echinospora, se sembraron en el suelo de las Jarra de Leonard y creció hasta la fase fisiológica de plántula y floración, a los 15 y 62 días después de su siembra. Al finalizar estos periodos se midió la fenología: altura de planta (AP), longitud radical (LR), número de hojas (NH) y longitud de hoja (LH), mientras que la biomasa: peso fresco y seco, aéreo y radical (PFA/PFR)/(PSA/PSA) de Z. mays. Los datos experimentales fueron sometidos a un análisis de varianza (ANOVA) y Tukey HSD p<0.05 con el paquete estadístico Statgraphics Centurion XVI.¹²

Tabla 1
Diseño experimental para analizar el efecto en semillas de Z. mays a la inoculación con B. cereus y/o M. echinospora con el NH₄NO₃ al 50%

n*= 5, (+) = aplicado, (-) = no aplicado

Los datos expuestos en la tabla 2 señalan que Z. mays inoculada solamente con B. cereus y en combinación con M. echinospora y el NH₄NO₃ al 50%, redujo el tiempo de emergencia de las semillas de Z. mays aumentando su porcentaje de crecimiento, la literatura refiere si las semillas se embebieron con agua reactivaron actividad enzimática de la α-amilasa que cataliza la hidrolisis de almidón, liberando ácidos orgánicos, aminoácidos, azucares y vitaminas derivadas de la degradación del endospermo, cuando esta gama de compuestos se liberan al exterior afectan positivamente la actividad y crecimiento de los microorganismos asociados a las semilla, denominándose espermatosfera^15,17,18,31, mientras su liberación durante el crecimiento de la raíz, al exterior afectan positivamente la actividad y reproducción de las BAPOCEVE efecto denominado rizosfera^13,14,15 de esta forma B. cereus transformo estos exudados de la espermósfera en SUPOCEVE, lo que sugiere, M. echinospora podría invadir el interior de las semilla de Z. mays señalando también que es posible convertir estos exudados en fitohormonas y terminar con la latencia para la aparición de la plantula.^6,16,17

Tabla 3
Crecimiento de Z. mays a B. cereus y M. echinospora a plántula, 25 días después de la siembra con el NH₄NO₃ al 50%

n*=5, **Letras distintas indican diferencia estadística según Tukey p<0.05 El nivel de plántula Z. mays con B. cereus y M. echinospora y el NH₄NO₃ al 50% alcanzó una AP de 31.7 cm, valor numérico con diferencia estadística comparado con los 18.0 cm de AP de Z. mays sin inocular alimentada con NH₄NO₃ al 100% referido como CR. Mientras que la biomasa Z. mays con B. cereus y M. echinospora y el NH₄NO₃ al 50% registro un PFA de 1.16 g y un PFR 0.66 g, estos valores numéricos tuvieron diferencia estadística comparados con los valores numéricos de 0.45 g de PFA y los 0.24 g en PFR de Z. mays utilizado como CR

Tabla 4
Crecimiento de Z. mays a B. cereus y M. echinospora a nivel de floración, 62 días después de la siembra con el NH₄NO₃ al 50%

n * = 5, **Letras distintas indican diferencia estadística según Tukey (p<0.05). El nivel de floración que Z. mays inoculada con M. echinospora con el NH₄NO₃ al 50% alcanzó una AP de 91.3 cm, valor numérico estadísticamente diferente comparado con los 72.9 cm en AP de Z. mays sin inocular alimentado con el NH₄NO₃ al 100% referido como CR. En tanto que en la biomasa de Z. mays con B. cereus y M. echinospora con el NH₄NO₃ al 50% registró un PFA de 38.5 g y un PFR de 15.2 g, estos valores numéricos tuvieron diferencia estadística comparados con los 14.5 g de PFA y los 5.9 g de PFR de Z. mays o CR

En tanto que los datos registrados en la tabla 3, señalan que el sano crecimiento de Z. mays fue debida a que tanto, B. cereus como M. echinospora transformaron estos exudados radicales en SUPOCEVE del tipo auxina y giberelina^20,30 incrementando la AP, NH, LH y la LR^18,19, por tanto fueron capaces de realizar^20,30 lo que apoyaría a que estos exudados liberados en raíz serian transformados en diferentes SUPOCEVE: auxina y citocinina que influirían directamente en las variables respuesta de la biomasa, ya sea el PSA y el PSR, pues esta reportado que M. echinospora^4,20,21 sintetiza fitohormonas, lo que respaldaría el sano crecimiento referente a la fenología y biomasa de Z. mays, cuando se inoculo individualmente con este actinomiceto o en combinación con B. cereus, de esa manera los exudados radicales transformados en SUPOCEVE^1,4,5,6 fueron diversos dadas las diferencias genéticas que existen entre B. cereus y M. echinospora, dos grupos microbianos que están reportados y coexisten en la naturaleza, interactuando con una amplia variedad de plantas domesticas como silestres.^9,22,23 Además, algunos metabolitos que se generen durante la fotosíntesis vegetal, pueden ser también transformados por BAPOCEVE en SUPOCEVE^24,25 que mejoran y optimizan la absorción radical del FENI reducido al 50%, sin afectar el sano crecimiento de Z. mays.^1,23,28

La tabla 4, presenta el crecimiento sano de Z. mays con B. cereus y M. echinospora a la dosis 50% de NH₄NO₃ en la fenología y biomasa a 62 después de la siembra, debido al efecto rizosfera que libera compuestos orgánicas producto del metabolismo del crecimiento de las raíces, que B. cereus trasformó en auxinas y giberelinas que indujeron la meiosis y mitosis del tejido de la raíz, facilitando la exploración del suelo, e incremento la absorción radical y optimización de la dosis de NH₄NO₃ reducido al 50%.^10,26 En tanto, y dado el carácter de endófito de M. echinospora se sugiere que invadió la endodermis de la raíz de Z. mays^27,25,7 para así generar fitohormonas que estimularen un crecimiento acelerado del sistema radical^1,28,29 y simultáneamente B. cereus colonice la superficie externa de la raíz, para continuar con la conversión de los compuestos orgánicos liberados por el efecto rizosfera que son atractivos para los géneros y especies de BAPOCE VE para que al interactuar con el sistema de raíces de Z. mays se establezca una interacción positiva y en consecuencia^30,15 se mejore y optimice la absorción radical del NH₄NO₃ reducido al 50%.

Con estos resultados se concluye que es posible evitar la hiperfertilización nitrogenada en el cultivo de Z. mays mediante la aplicación de BAPOCEVE de manera individual o en combinación con un género rizosferico como B. cereus y un actinomiceto endófito del tipo M. echinospora, para que a traves de SUPOCEVE, faciliten la absorción y optimización de la dosis de NH₄NO₃ al 50 %, sin afectar negativamente el sano crecimiento de Z. mays.

Además, combinación de géneros y especies de BA POCEVE, es una nueva alternativa a las ya conocidas de géneros y especies convencionales de BAPO CEVE^18,32 útiles en la producción sustentable de Z. mays, que evitan el exceso de FENI y la pérdida de productividad del suelo.

Al proyecto 2.7 (2019) apoyado por la Coordinación Investigación Científica-UMSNH y BIONUTRA S.A de CV, Maravatío, Mich, México por la beca para el primer autor.