Actividad antifúngica in vitro del extracto crudo acuoso de Rosmarinus officinalis contra Candida albicans

In vitro antifungal activity of the aqueous crude extract of Rosmarinus officinalis against Candida albicans

Candida albicans es considerado un microorganismo comensal oral, su ocurrencia oral es de un 50-70% en individuos sanos y su efecto sobre la ecología oral a pesar de la naturaleza compleja de los biofilms orales, así C. albicans puede proliferar en biofilms cultivadas en condiciones aerobias, sin embargo, en estas condiciones, se ha evidenciado la presencia de bacterias anaeróbicos facultativos o estrictos como Veillonella, Prevotella, Leptotrichia y Fusobacterium.¹ Asimismo, la candidiasis oral es considerada una infección oportunista de la cavidad oral, siendo sub diagnosticada entre los ancianos, particularmente en aquellos que usan dentaduras postizas, de ahí que la incidencia de C. albicans en aislados de la cavidad oral ha sido reportado en un 45% en neonatos, 64.5-65% de niños sanos, 30-45% de adultos sanos, 50% - 65% de personas que usan prótesis removibles.²

Por otro lado, las infecciones frecuentes de la cavidad oral ocasionadas por Candida se manifiestan en adultos de edad avanzada, aunque su incidencia real se desconoce, se sabe que existe una prevalencia elevada, en ciertas ocasiones como ocurre en ancianos, en presencia de prótesis mucoso portadas, xerostomía o en patologías asociadas frecuentemente en los adultos mayores.³

Además, la estomatitis de dentadura puede ocurrir en respuesta a la acumulación de placa en dentaduras postizas, siendo C. albicans uno de los principales microorganismos patógenos que causan este tipo de inflamación, asimismo una candidiasis oral se presenta con dolor en la mucosa oral, complicado por estomatitis angular.⁴

En la actualidad las plantas medicinales han sido utilizadas durante siglos como remedios para diversas enfermedades humanas, por contener componentes de valor terapéutico, existe un interés creciente en los fitoquímicos como nuevas fuentes de antioxidantes naturales y agentes antimicrobianos, que a través de sus extractos se ha evidencia capacidad de inhibir su crecimiento.⁵

R. officinalis conocido como romero, es un vegetal de la familia Lamiaceae utilizado ampliamente en medicina tradicional e industria cosméticos⁶, como sus extractos acuosos, hidroalcohólicos, aceites esenciales, además se ha evidenciado la presencia en su composición química variada como, ácido romarínico, α-pineno, acetato de bornilo, alcanfor y carvacrol, responsables de propiedades antibacterianas, citotóxicas, inclusive la presencia de β-carotenos que se asocia a capacidades antimutagénicas, antioxidantes, antiflogísticas y quimiopreventivas.^7,8,9,10

Por tal motivo el presente estudio tuvo como objetivo evaluar la actividad antifúngica in vitro del extracto crudo acuoso de R. officinalis contra C. albicans.

Rosmarinus officinalis. Se colectaron ejemplares con ramas, hojas y flores en cerros aledaños del distrito San Luis de Lucma, provincia de Cutervo, región de Cajamarca, dos ejemplares fueron transportados al herbario de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo para su identificación, luego se inició el proceso de desinfección de las hojas con una torunda de algodón humedecida con etanol al 95 ºGL, 1 Kg hojas fueron secadas empleando una estufa a temperatura a 50 °C, posteriormente se realizó su molienda hasta obtener 100 g de materia prima en polvo.

Preparación del extracto acuoso de Rosmarinus officinalis. 20 g de materia prima en polvo, se agregaron 500 mL de agua destilada, se hirvió por 15 min, el producto fue filtrado con papel filtro Whatmann N° 40, se obtuvo un extracto libre residuos, luego se distribuido en placas petri para su secado en hornilla a una temperatura de 50 °C hasta sequedad. 2 g de residuo seco obtenido, fue guardado en refrigeración a 2 °C en frasco de vidrio color ámbar.

Para las concentraciones se tomó como referencia a Purca¹¹ con modificaciones, 2 g del residuo seco se disolvió en 50 mL de agua destilada estéril, obteniéndose una solución madre de 40 mg/mL, se realizó diluciones seriadas por duplicado, obteniéndose diferentes concentraciones de 20 mg/mL, 10 mg/mL, 5 mg/mL 2.5 mg/mL y 1.25 mg/mL.¹²

Preparación del inóculo de Candida albicans. Se emplearon dos cepas proporcionadas del Laboratorio de Micología del Hospital Regional Lambayeque, Chiclayo, Perú, se preparó una suspensión de C. albicans, se tomaron 5 Unidades Formadores de Colonia (UFC) ≥ 1 mm de diámetro procedente de cultivo agar dextrosa Sabouraud (ADS), de 24 h, CLSI¹³. Se suspendieron en 5 mL de caldo Sabouraud y con ayuda del espectrofotómetro (Spectrophotometer UNICO^TM UV/VIS) a una longitud de onda de 625 nm, se ajustó a una densidad óptica de 0.12 equivalente a la turbidez del tubo N° 0.5 de la escala de Mc Farland equivalente a una concentración aproximadamente de 1-5 x 10⁶ UFC/mL.¹⁴ Posteriormente se realizó una dilución 1:1000 con caldo Sabouraud glucosado, obteniéndose una concentración de 1-5 x 10³. Esta última, es la que se utilizó para sembrar en las placas de con agar Mueller-Hinton.

Actividad antifúngica del extracto acuoso contra Candida albicans. Sobre las placas sembradas (5 placas para cada cepa), se realizaron 6 perforaciones de 6 mm de diámetro, con un sacabocado¹⁵ colocándose 50 μL de cada concentración del extracto crudo acuoso de R. officinalis en cada pozo, posteriormente fueron selladas con parafilm e incubándose a 37 °C, por un periodo de 24 h, para luego realizar la medición de los halos de inhibición de crecimiento fúngico, para el control negativo se empleó una placa con 6 perforaciones más agua destilada estéril.

Análisis estadístico. Para determinar la relación de la actividad antifúngica in vitro del extracto crudo acuoso de R. officinalis en el crecimiento de fúngico de C. albicans, se realizó un análisis de varianza¹⁶ (ANOVA) con un nivel de significación de P< 0.05.

En la figura 1 se observa el promedio de los halos de inhibición (mm) de las 6 concentraciones del extracto acuoso de las hojas de R. officinalis contra dos cepas de C. albicans.

Figura 1
Promedio halos de inhibición en milímetros (mm) del extracto crudo acuoso de R. officinalis contra las cepas de C. albicans y control negativo con agua destilada estéril [H₂O]

De las 6 concentraciones evaluadas se observa que la de 40, 20, 10 y 5 mg/mL presentaron halos de inhibición promedio 21.12, 16.08, 9.22 y 7.12 mm para cepa n°1 y para la cepa n° 2, la actividad fue diferente, las concentraciones de 40, 20 y 10 mg/mL presentaron halos de 10.35, 8.43 y 7.21 mm respectivamente, El agua estéril no presentó halo de inhibición.

Figura 2
Diferencias de las halos de inhibición en relación las concentraciones del extracto crudo acuoso de R. officinalis (1: 40 mg/mL, 2: 20 mg/mL, 3: 10 mg/mL, 4: 5 mg/mL, 5: 2.5 mg/mL, 6: 1.25 mg/mL, contra las 2 cepas de C. albicans (A, B)

En la figura 2, mediante el método de difusión en pozo se observa la actividad antifúngica del extracto crudo acuoso de las hojas de R. officinalis, asimismo se muestra la diferencia de los tamaños de los halos inhibición dependiendo de las concentraciones evaluadas in vitro.

La candidiasis oral puede estar presente en los hospederos como placa, estomatitis protésica, quelitis angular y manifestaciones orales mucocutáneas sistémicos, asimismo también se ha reportado la presencia genes activos de resistencia de C. albicans frente a antifúngicos conocidos.^17,18 En la actualidad como parte de la solución, se busca nuevos principios bioactivos presentes en partes de las plantas (tallo, raíces, hojas y semillas).¹⁹ El romero (R. officinalis L.) pertenece a la familia Lamiaceae, es una planta aromática y es utilizado en medicina popular, cosmética y en la industria alimentaria.²⁰

Este estudio se realizó para evaluar la actividad antifúngica del R. officinalis, por sus propiedades terapéuticas, que en concordancia con otras especies de plantas, como Picralima nitida que ha reportado capacidad antifúngica de extractos acuosos de semillas, por su capacidad de inhibir el crecimiento de Aspergillus flavus, Candida albicans y Microsporum canis²¹, e inclusive en extractos acuosos de hojas de Oliva, con capacidad antifúngica contra. C. albicans.²²

Estudios fitoquímicos de R. officinalis han demostrado la presencia de ácido rosmarínico y su capacidad antibacteriana^23,24 y además de otros componentes principales como 1,8-cineol, isoborneol, α-pineno y α-terpineol, existiendo una diversidad significativa por la variación estacional.²⁰

El extracto crudo acuoso de las hojas de R. officinalis tuvo una actividad antifúngica contra C. albicans, por el método de difusión en pozo, los halos promedios para una cepa fueron de 21.12m 16.08, 9.22, y 7.12 mm para las concentraciones de 40, 20, 10, 5 mg/mL respectivamente, sin embargo, respectivamente para la otra cepa se obtuvo halos promedios de 10.35, 8.43 y 7.21 mm para las concentraciones de 40, 20, 10 mg/mL, se logró una relación directamente proporcional entre la concentración del extracto y el diámetro de la zona de inhibición.

Lo anterior señala la capacidad antifúngica de R. officinalis contra C. albicans, a pesar de los escasos estudios que reporten su actividad antifúngica, pero coinciden con lo reportado por Oliveira et al.²⁵, a una concentración de 200 mg/mL obtuvo una reducción significativa de biopelículas formadas por C. albicans después de la exposición al extracto y con una metodología diferente para evaluar su actividad antifúngica, mediante el método de microdilución, determinando una Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) de 0.78 mg/mL y una Concentración Mínima Microbicida (CMM) de 3.13 mg/mL.

Los principios bioactivos los extractos acuosos en R. officinalis no solamente pueden inhibir el crecimiento de bacterias, sino también pueden presentar capacidad antifúngica, concordante con estudios con extractos acuosos de plantas de diferentes especies tales como la Mimosa púdica y Azadirachta indica.^26,27

Se observó que las cepas de C. albicans utilizados en esta investigación exhibieron diferentes grados de susceptibilidad al extracto de R. officinalis, inclusive la susceptibilidad observada a este podría atribuirse al factor de resistencia inherente de los microorganismos.^21,22,26

Finalmente, con estos datos el extracto crudo de hojas de R. officinalis revela un gran potencial biológico al presentar una actividad antifúngica a diferentes dosis, representando una alternativa terapéutica ante infecciones oportunistas, aunque los datos son concluyentes, se requiere realizar trabajos que validen esta técnica, extraer sus compuestos bioactivos y permitan en el tiempo ser explotado en el tratamiento terapéutico a través de pastas dentales, enjuagues bucales, irrigación de canales radiculares, ungüentos, entre otros y control de algunas infecciones fúngicas.

Los autores agradecen a la Universidad Señor de Sipán, Facultad de Ciencias de la Salud, por el apoyo técnico, científico y logístico realizado a la presente investigación.