Actividad antibacteriana in vitro de extracto etanólico crudo de las hojas de Origanum vulgare,frente Staphylococcus aureus ATCC 29213, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 y Escherichia coli ATCC 25922

In vitro antibacterial activity of crude ethanolic extract from the leaves of Origanum vulgare, against Staphylococcus aureus ATCC 29213, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 and Escherichia coli ATCC 25922

Pérez-Delgado, Orlando* operezd@gmail.com

Universidad Señor de Sipán, Perú

Alvarado-Pineda, Rosa Liliana

Universidad Católica Santo Toribio de Mogrovejo, Perú

Yacarini-Martínez, Antero Enrique

Universidad Católica Santo Toribio de Mogrovejo, Perú

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La aparición de microorganismos resistentes (MR), ya sea por mutaciones o la adquisición de elementos genéticos móviles que portan genes de resistencia, puede tener lugar independientemente de la presencia de agentes antibacterianos siendo una amenaza para la salud mundial¹.

En las últimas décadas, debido a la evolución de las bacterias y al abuso de antibióticos, la resistencia de Staphylococcus aureus ha aumentado gradualmente la tasa de infección por S. aureus multidrogo-resistente (MRSA) y el tratamiento clínico antiinfeccioso se ha vuelto más difícil². Inclusive existen estudios que señalan que el 63% de los aislados de MRSA producen biopelículas y con respuesta de resistencia a dos antibióticos como la eritromicina y clindamicina siendo cepas con genes formadores de biopelículas³.

Los hallazgos han demostrado la existencia de microbios resistentes a los antibióticos que en gran parte están presentes en la Unidad de Cuidados Intensivos (UCI), siendo Pseudomonas aeruginosa responsable de una amplia gama de infecciones adquiridas en la UCI en pacientes críticamente enfermos⁴, siendo reportada la resistencia intrínseca o mutaciones cromosómica a través de adquisición de genes de resistencia frente a penicilinas, cefalosporinas, monobactams, carbapenémicos incluyendo a los aminoglucósidos y fluoroquinolonas⁵.

Por otro lado, se tiene a Escherichia coli uropatógena (UPEC) como responsable de infecciones del tracto urinario, que posee un arsenal de genes de virulencia, el más frecuente el gen fimH, seguido de los genes: aer, hly, pap, cnf, sfa y afa que contribuyen a su capacidad para superar diferentes mecanismos de defensa y causar enfermedades⁶, además de aislados de E. coli existe variación con respecto a la susceptibilidad de antibióticos como la cefotaxima, nitrofurantoína, cefuroxima, ceftazidima, ácido nalidíxico, ciprofloxacina e incluso la prevalencia de E. coli productora de β-lactamasas de espectro extendido (BLEE) se ha visto aumentado significativamente^7,8.

Las propiedades antibacterianas y antioxidantes del orégano se han atribuido principalmente al carvacrol y al timol, componentes principales de su aceite esencial que provocan alteraciones estructurales y funcionales en la membrana celular^9-11, También en un estudio, los extractos de hojas de O. vulgare se ha probado su actividad bactericida contra diferentes patógenos importantes en la acuicultura de peces^12-14, con hallazgos de actividad frente bacterias causantes de enfermedades periodontales^15,16, inclusive es empleado en la estabilidad de almacenamiento de carnes para evitar su descomposición^17,18.

La actividad antimicrobiana de los extractos de O. vulgare, tiene una predilección por bacterias gram positivas como S. aureus, pero varía frente a bacterias gram negativas como E. coli, Kebsiella pneumoniae, P. aeruginosa^19-21 e inclusive dependiendo del solvente como etanol y metanol permite el aislamiento de compuestos bioactivos de mucho interés en su acción antioxidante, antibacteriana y antifúngica^22-24, como también su hallazgo con actividad antiviral²⁵.

Siendo posible el efecto antibacteriano del extracto etanólico, pueda presentar variaciones según sus concentraciones, se elaboró para la presente investigación cuyo objetivo fue, evaluar el efecto antibacteriano in vitro del extracto etanólico de las hojas de O. vulgare frente a S. aureus ATCC 29213, P. aeruginosa ATCC 27853 y E. coli ATCC 25922.

Se realizó un estudio in vitro con diseño experimental de estímulo creciente²⁶, con extracto etanólico (EE) de O. vulgare, 3 concentraciones de cada extracto y con 8 repeticiones, como control positivo (CP) se empleó etanol y control negativo (CN) agua destilada estéril.

Del material vegetal. Se colectaron ejemplares de O. vulgare con ramas, hojas y flores²⁷, de cultivos aledaños en el distrito de Chiclayo, Región Lambayeque, Perú, de los cuales dos ejemplares fueron transportados al herbario de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo para su identificación, luego se inició el proceso de desinfección de las hojas con alcohol de 95º GL. Posteriormente las hojas fueron secadas empleando una estufa a temperatura de 50 °C durante ocho horas. Después, 500 g de hojas pasaron a la etapa de molienda hasta obtener material en polvo.

Preparación del extracto etanólico de O. vulgare. Para la preparación del EE²⁸, se maceraron 40 g de polvo O. vulgare y se agregaron 200 mL de etanol absoluto, en una botella de vidrio ámbar hermética, se agitó la botella diariamente durante una semana a temperatura ambiente, el producto fue filtrado con papel filtro Whatmann N° 40, se obtuvo un extracto libre de residuos, el filtrado se concentró en Sohxlet hasta sequedad, 2 g de residuo seco fue guardado en refrigeración a 2 °C en frasco de vidrio color ámbar. Para las concentraciones, 2 g de residuo seco se disolvió en 25 mL de etanol absoluto, obteniendo una solución madre de 80 mg/mL, se realizó diluciones dobles seriadas, obteniendo concentraciones de 40 mg/mL y 20 mg/mL.

Preparación del inóculo de S aureus ATCC 29213, P. aeruginosa ATCC 27853 y E. coli ATCC 25922. Fueron adquiridas de la colección de cultivo tipo Americano ATCC (American Type Culture Collection) Culti-Loops™ Thermo Scientific™. Según las orientaciones de la Clinical and Laboratory Standars Institute²⁹, de 3 a 5 colonias de fueron seleccionadas de un cultivo en placa de agar Mueller-Hinton después de 24 h. La parte superior de cada colonia se tocó con un asa y se transfirió a un tubo con 4-5 mL de caldo Müller-Hinton y con ayuda del densitómetro (DEN-1B) se midió turbidez con absorbancias de 0.08-0.1 para bacterias equivalente a 0.5 del estándar de McFarland³⁰ obteniendo una suspensión bacteriana resultante de1 a 2 x 10. (UFC/mL). En un lapso de tiempo óptimo de 15 min después de ajustar la turbidez de la suspensión del inóculo, con una torunda de algodón se inoculó sobre toda la superficie de una placa de agar Mueller-Hinton.

Actividad antibacteriana de los extractos de O. vulgare. A través del método de difusión en pozo³⁰, sobre las placas sembradas, se realizaron 4 perforaciones de 6 mm de diámetro, con un sacabocado y se colocaron 50 μL en cada pozo los extractos de orégano, como CP se empleó etanol y CN agua destilada estéril, posteriormente fueron selladas con parafilm, se incubó a 37 °C, por un período de 24 h, luego se procedió a medir el diámetro de inhibición.

Análisis estadístico. Para determinar la relación del efecto antibacteriano del EE de O. vulgare en el crecimiento bacteriano, se realizó un análisis de varianza (ANOVA) con un nivel de significación de 0.05 y una Prueba de Tukey para la comparación de los extractos con el control positivo.

En la figura 1, se presenta los resultados de la actividad antibacteriana del EE de O. vulgare en las concentraciones de 80, 40 y 20 mg/mL, frente una especie bacteriana gran positiva S. aureus ATCC 29213, dos especies de bacterias gran negativas como P. aeruginosa ATCC 27853 y E. coli ATCC 25922, además se observa que las cepas gran negativas ofrecen menor susceptibilidad en comparación a S. aureus, además, siendo posible observar que el etanol activa los principios bioactivos presentes en el residuo seco de O. vulgare, siendo característica visible entre las concentraciones del extracto y el CP (etanol).

Figura 1
Actividad antibacteriana del extracto etanólico crudo de O vulgare frente a A S aureus ATCC 29213

En la figura 2, se presenta el promedio de los tamaños de los halos inhibición del EE de O. vulgare en las concentraciones de 80, 40 y 20 mg/mL, se observa halos promedios de 21.64, 15.24 y 11.45 mm para S. aureus, para P. aeruginosa de 13.31, 12.27 y 7.35 mm, para E. coli 12.5, 11.4 y 10.6 mm, inclusive la actividad antibacteriana del etanol es menor en comparación al extracto.

Figura 2
Tamaño de los halos de inhibición (mm) de la actividad antibacteriana del extracto etanólico frente a S. aureus ATCC 29213 P. aeruginosa ATCC 27853 y E. coli ATCC 25922

El presente trabajo de investigación tuvo como objetivo evaluar la actividad antibacteriana in vitro del EE de O. vulgare (Orégano).

Los resultados obtenidos en este estudio indican que el EE de O. vulgare posee propiedades antibacterianas inclusive, mayor actividad contra S. aureus ATCC 29213, en relación a E. coli ATCC 25922 y P. aeruginosa ATCC 27853, en las concentraciones de 80, 40 y 20 mg/mL, respectivamente. De acuerdo a estudios realizados, han evidenciado una abundancia de hidrocarburos monoterpénicos y compuestos fenólicos, siendo los principales componentes el carvacrol, seguido de timol, p-cimeno y 1-octacosanol, compuestos que tienen una importante actividad antimicrobiana amplia frente a bacterias, hongos y levaduras^9,31.

Así mismo, se observaron la presencia de halos promedios de: 21.64, 15.24 y 11.45 mm para S. aureus ATCC 29213, para P. aeruginosa ATCC 27853 de 13.31, 12.27 y 7.35 mm, y para E. coli ATCC 25922 de 12.5, 11.4 y 10.6. En otros estudios se han verificado que los EE tuvieron efecto antibacteriano contra cepas clínicas aisladas con resistencia múltiple de S. aureus con halos de inhibición de 10.44 mm, le sigue E. coli con 9.88 mm y P. aeruginosa con 9.77mm a concentración de 400 mg/mL³², con nuestros resultados, en comparación con los hallazgos mencionados, se obtuvieron halos mayores, lo cual puede deberse a las cepas estándar ATCC utilizadas en el mencionado estudio, toda vez que se emplearon concentraciones de 80, 40 y 20 mg/mL para S. aureus, E. coli y P. aeruginosa. Siendo la cepa de S. aureus la que presentó mayor susceptibilidad con halo de inhibición de 21.64 mm a la máxima concentración del extracto, le siguen las cepas de P. aeruginosa y E. coli (figura 1) en nuestro estudio como en el mencionado.

Asimismo, en otra investigación realizada en Irak reportó que dicho extracto de O. vulgare a una concentración de 50 y 100 mg/mL presentaron actividad antibacteriana frente a S. aureus con zonas de inhibición de 27-32 mm, seguido de E. coli de 25-29 mm y para P. aeruginosa de 19-28 mm³³, en comparación con nuestro estudio guarda coherencia y siendo O. vulgare una planta medicinal con potencial terapéutico y presencia de compuestos bioactivos capaces de inhibir el crecimiento de las bacterias.

Según Neira-Llerena³⁴, con el EE de O. vulgare se muestra como el de mayor actividad antimicrobiana en esta investigación, tras haber alcanzado los porcentajes y halos de inhibición más altos frente a S. aureus (16.65 mm) a concentración de 30 mg/mL, en nuestro estudio el tamaño del halo de inhibición a concentración de 80 mg/mL, fue de 21.64 mm, pero si comparamos en nuestro estudio a la concentración de 40 mg/mL fue de 15.24 mm en relación al estudio anterior a concentración de 30 mg/mL que es de 16.65 mm, los resultados son muy similares, señalando que actividad antibacteriana de orégano frente a S. aureus es efectiva para este microorganismo³⁴.

En cuanto a su actividad antimicrobiana, el resultado de la investigación ratifica que el EE del orégano, posee actividad antibacteriana frente a bacterias gram-positivas como S. aureus y sobre bacterias gram-negativas como E. coli, P. aeruginosa.

No obstante, otros estudios a través del método de microdilución reportaron variabilidad de la CMI del extracto etanólico de O. vulgare frente S. aureus de 500 µg/mL E. coli de 250 µg/mL y frente a P. aeruginosa no presento actividad³⁵, asimismo también emplearon el aceite esencial de O. vulgare frente a otros microorganismos clínicos, teniendo variabilidad en su acción antibacteriana siendo las cepas de E. coli entre las más resistentes a la acción antibacteriana de 24.8 a 28.6 µg/mL³⁶.

Los resultados de este trabajo permiten concluir que el extracto etanólico de O. vulgare, es capaz de producir compuestos con potencial antibacteriano frente a patógenos nosocomiales, lo que amerita continuar con la búsqueda de los componentes bioactivos responsables de esta actividad y así puedan emplearse como alternativa terapéutica para el tratamiento de infecciones causadas por bacterias de importancia clínica, como también su aplicación en la conservación de alimentos.

http://www.scielo.org.bo/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S2072-92942021000100003&lng=es&nrm=iso&tlng=es (html)